Метод штаммовой дифференциации вируса инфекционного бронхита кур и анализ изолятов вируса, выделенных на территории России

Актуальность темы

.

Инфекционный бронхит кур (ИБК) — острое высококонтагиозное заболевание, поражающее кур различного возраста, возбудителем которого является вирус, принадлежащий к роду Coronavirus, семейства Coronaviridae. В зависимости от штамма, вызвавшего инфекцию, могут поражаться респираторные органы, почки, а также герминативные органы и кишечник кур. Инфекционный бронхит регистрируется в птицеводческих хозяйствах мясного и яичного направления.

По данным серологических исследований наличие ИБК в настоящее время подтверждают практически во всех обследованных птицехозяйствах России, а также в странах СНГ, что указывает на широкое распространение инфекции.

В птицеводческих хозяйствах, неблагополучных по ИБК, отход молодняка составляет, в среднем, 18−20%, но при первичной циркуляции в хозяйстве вируса с нефрогенной тропностью смертность птицы может увеличиваться до 57−70% [8]. Вынужденная выбраковка цыплят в хозяйствах, где отмечают ассоциированное течение ИБК с вторичными инфекциями может достигать 40−60% среди цыплят 1−5 месячного возраста.

Проявление ИБК часто маскируется другими болезнями вирусной и бактериальной природы, а также физиологическими нарушениями. Даже при типичном течении постановка диагноза на ИБК по клиническим и па-тологоанатомическим признакам является затруднительной. Кроме того, в крупных птицехозяйствах ИБК может иметь стационарный характер и протекать как хроническая инфекция без ярко выраженных симптомов поражения респираторных органов.

Система лабораторной диагностики ИБК включает в себя выделение вируса на куриных эмбрионах, постановку биопробы на восприимчивых цыплятах, идентификацию выделенного вируса в РН, РИФ и РТГА, выявление антител в сыворотках крови в РН, РТГА и ИФА, а также обнаружение гистологических изменений в органах и тканях.

Вирус ИБК отличается очень высокой генетической изменчивостью, которая обуславливает его антигенную вариабельность. По имеющимся к настоящему времени данным в мире известно более 30 серотипов вируса ИБК, причем перекрестная защита между штаммами разных серотипов практически отсутствует. Эффективность профилактических мероприятий при ИБК во многом обусловлена правильным выбором вакцинного штамма. В нашей стране в 1970;1980 гг. выделяли изоляты вируса ИБК, антиген-но родственные серотипам Массачусеттс и Коннектикут [6, 9], а в последнее время дигностика этого заболевания сводилась, в основном, к исследованию сывороток крови от больной птицы в ИФА и РЗГА. Таким образом, спектр штаммов, циркулирующих сейчас в России, оставался неизвестным. Постоянное появление новых антигенных вариантов вируса ИБК в разных странах мира, в том числе штаммов, способных вызывать заболевание у вакцинированной птицы, определяет актуальность работы и необходимость совершенствования имеющихся и разработки новых, более эффективных средств индикации и идентификации вируса и профилактики ИБК.

Основными критериями при совершенствовании и разработке методов диагностики ИБК является их высокая чувствительность, специфичность, быстрота проведения анализа, а также возможность не только выявлять, но и идентифицировать вирус.

В последнее время метод ПЦР, основанный на энзиматической амплификации части вирусного генома с использованием термостабильной ДНК-полимеразы и специфичных праймеров, стал успешно использоваться в диагностике многих инфекционных заболеваний. ПЦР обладает высокой специфичностью и чувствительностью, что позволяет выявлять даже фрагменты вирусного генома. Определение и сравнительный анализ первичной структуры кДНК фрагментов генома, характеризующихся высокой вариабельностью, позволяет наиболее точно установить штаммовую принадлежность вируса.

Метод ОТ-ПЦР для диагностики ИБК был впервые применен Lin и соавт. в 1991 году [114] и в настоящее время используется многими лабораториями в разных странах. Основными недостатками предложенных ранее методов при индикации вирусного генома являются необходимость культивирования полевых изолятов вируса в куриных эмбрионах, а при штаммо-вой дифференциации — анализ консервативных областей генома, что снижает информативность метода. Имеющиеся к настоящему времени данные о первичной структуре различных областей генома вируса ИБК позволяют разработать оптимальную тест-систему не только для индикации, но и для штаммовой дифференциации вируса.

Цель и задачи исследования

.

Основная цель данных исследований заключалась в разработке метода индикации и штаммовой дифференциации вируса ИБК и изучении моле-кулярно-биологическими методами генетических взаимоотношений штаммов вируса ИБК.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

— разработать метод индикации генома вируса ИБК в различных вируссо-держащих материалах на основе ОТ-ПЦР;

— разработать метод идентификации вируса ИБК на основе нуклеотидного секвенирования вариабельной области гена Б1, позволяющий определять штаммовую принадлежность вируса;

— провести анализ нуклеотидной последовательности вариабельной области гена 81 полевых изолятов вируса ИБК, выделенных в России и вакцинных штаммов вируса ИБК;

— сравнить первичные структуры вариабельной области гена полевых изолятов и зарубежных штаммов вируса ИБК.

Научная новизна исследования.

Впервые определена нуклеотидная последовательность вариабельной области гена 21 изолята вируса ИБК, выделенного на территории России в течение 1997;1998 гг., а также 10 отечественных и зарубежных вакцинных и патогенных штаммов.

Выявлены и дифференцированы генетические группы штаммов вируса ИБК.

Создан банк данных нуклеотидных и соответствующих аминокислотных последовательностей вариабельной области гена Б1 вируса ИБК.

Практическая значимость исследования.

Разработаны метод очистки и концентрирования вируса ИБК и метод выделения вирусной РНК, позволяющие получать из аллантоисной жидкости РКЭ, инфицированных вирусом ИБК штаммом НПО препараты с концентрацией вирусного белка 0,5−1,5 мг/мл и, соответственно, около 0,3 мг вирусной РНК.

Разработан метод индикации вируса ИБК на основе ОТ-ПЦР с прай-мерами на консервативную область З'-ИТЯ, позволяющий выявлять геном возбудителя в различных вируссодержащих материалах без выделения вируса в куриных эмбрионах в течение 4−6 часов.

Разработан метод прямого секвенирования амплифицированных в ПЦР фрагментов кДНК, позволяющий в течение 2−3 дней определять первичную структуру вариабельной области гена 81, и в результате сравнительного анализа с использованием созданного банка данных, проводить штаммовую дифференциацию новых изолятов вируса ИБК.

С помощью разработанного метода проведена идентификация 21 изолята ВИБК, выделенного на территории России в 1997;1998 гг., а также 10 отечественных и зарубежных вакцинных и патогенных штаммов.

Разработанные методы индикации генома и штаммовой дифференциации вируса ИБК одобрены ученым советом и утверждены директором ВНИИЗЖ, а также Департаментом ветеринарии МСХиП РФ и в настоящее время используются для индикации генома и штаммовой дифференциации изолятов вируса ИБК, выделяемых на территории России и стран СНГ. Публикация научных исследований.

По теме научных исследований опубликовано 5 научных работ. Апробация работы.

Основные материалы диссертации были доложены на научно-практической конференции «Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных» ВНИИЗЖ, г. Владимир (1997 г.), научной конференции «Современные аспекты ветеринарной патологии животных» г. Владимир (1998 г.) и II Всероссийской конференции «ПЦР в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний» г. Москва (1998 г.).

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 127 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и приложение.

Список литературы

включает 188 источников. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 5 таблицами.

5. ВЫВОДЫ.

1. Разработан метод очистки и концентрирования вируса ИБК из аллантоисной жидкости развивающихся куриных эмбрионов, инфицированных вакцинным штаммом Н120, основанный на центрифугировании в градиентах плотности сахарозы.

2. Предложен новый метод выделения РНК вируса ИБК с использованием ОГ/Р фильтров, преимуществами которого являются большой количественный выход РНК, техническая простота и высокая скорость анализа.

3. Разработан метод индикации генома вируса ИБК на основе ПЦР с праймерами на консервативную область З'-иТЯ, позволяющий выявлять вирусный геном в течение 6−8 часов в различных вируссодержащих образцах: органах инфицированных кур (легких, трахеях, почках, кишечнике), в инфицированных куриных эмбрионах, образцах вакцинных препаратов.

4. На основе прямого секвенирования амплифицированного в ПЦР фрагмента кДНК гена разработан метод идентификации вируса ИБК, позволяющий в течение 2−3 дней определить первичную структуру вариабельной области гена 81 и путем ее сравнения с имеющимися в банке данных аналогичными структурами других штаммов определить штаммовую принадлежность изолята.

5. Определены нуклеотидные и соответствующие аминокислотные последовательности вариабельной области гена Б1 21 изолята вируса ИБК, выделенного на территории России в течение 1997;1998 г. и 10 отечественныхи зарубежных вакцинных и патогенных штаммов вируса.

6. Создан банк данных нуклеотидных и соответствующих аминокислотных последовательностей отечественных и зарубежных штаммов вируса ИБК, позволяющий проводить сравнительный анализ и идентификацию вновь выделенных изолятов. Выявлены генетические группы штаммов вируса ИБК. Показано, что распределение на группы коррелирует с серологической классификацией штаммов вируса ИБК при отсутствии четкой зависимости от места выделения вируса.

7. В результате сравнительного анализа вариабельной области гена и белка S1 было показано, что 11 изолятов, выделенных на территории России имеют структуру, близкую к таковой штаммов серотипа Массачусеттс (Н120, Н52, М41, Beaudette) — 10 изолятов, не относятся к какой либо генетической группе и не имеют высоких уровней гомологии ни с одним зарубежным штаммом.

8. Установлено, что изолят IBV-14/98 обнаружил высокую степень гомологии со штаммами нового серотипа 793/В, впервые выделенными в Великобритании в 1991 г., а затем и в других странах, что позволяет предположить, что они имеют общее происхождение.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Разработанный метод индикации генома и штаммовой дифференциации вируса ИБК с использованием полимеразной цепной реакции и секвенирования амплифицированных фрагментов гена S1 включен в «Методические указания по диагностике вирусных болезней животных», утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России в 1998 г. и применяется для идентификации вновь выделенных изолятов вируса ИБК из патматериала, поступающего с различных п/ф России и стран СНГ.

2. Создан банк данных нуклеотидных последовательностей вариабельной области гена S1 отечественных и зарубежных изолятов и вакцинных штаммов.

3. В процессе выполнения научных исследований разработана и утверждена научно-техническая документация:

НТД к набору для выявления антител к вирусу инфекционного бронхита кур методом ИФА" - Владимир, 1997.

4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей разных штаммов вируса ИБК был использован для выбора участка генома, позволяющего проводить индикацию и штаммовую дифференциацию. В связи с тем, что филогенетический анализ консервативных областей генома вируса ИБК (ген N, область З'-UTR) не коррелирует с антигенными свойствами штаммов, а наиболее подходящая для штаммовой дифференциации областьген S1, отличается высокой вариабельностью было выбрано два разных участка для амплификации в ПЦР: консервативная область З'-UTR для индикации вирусного генома и вариабельная область гена S1 для штаммовой дифференциации.

Для индикации вирусного генома в различных биопробах были использованы две пары праймеров для «гнездовой» ПЦР, фланкирующие консервативную область З'-UTR, предложенные Adzhar и соавт. (1996).

Анализ нуклеотидных последовательностей гена S1, штаммов вируса ИБК 17 различных серотипов, в З'-концевой части гена S1 позволил выявить область, характеризующуюся максимальной вариабельностью. Ранее было показано, что эта область генома кодирует вируснейтрализующие и сер отипо специфические эпитопы. В результате проведенного анализа последовательностей гена S1 были выбраны 6 праймеров для «nested» -ПЦР, гомологичные относительно консервативным участкам, фланкирующим вариабельную область гена S1 .

В результате сравнения различных способов очистки и концентрирования был разработан метод очистки вируса ИБК из аллантоисной жидкости РКЭ, инфицированных вирусом ИБК, штамм HI20, включающий осветление аллантоисной жидкости низкоскоростным центрифугированием, концентрирование вируса улырацентрифугированием, очистку в ступенчатом сахарозном градиенте (плотность 20%, 35%, 55%), дополнительную очистку в линейном градиенте плотности сахарозы (30−55%). Полученный вирусный препарат был использован в качестве антигена в реакции ИФА, обладая при этом высокой активностью и специфичностью.

Был разработан новый метод выделения и очистки РНК вируса ИБК с использованием фильтров GF, а также метод выделения суммарной РНК. Было показано, что качество полученных препаратов и количество содержащейся в них вирусспецифической РНК удовлетворяли требованиям ревертазных и полимеразных реакций. Сравнение метода выделения РНК с помощью фильтров GF/F и классического метода Chomczynski и соавт. [1987] показало, что разработанный метод выделения РНК не уступал методу Chomczynski и соавт. по количественному выходу и значительно превосходил его по скорости и технической простоте.

Для выбора наиболее оптимального метода амплификации фрагментов вирусного генома были сравнены метод раздельной постановки ОТ и ПЦР и «непрерывной» ОТ-ПЦР (continuous RT-PCR). Полученные результаты показали, что метод «непрерывной» ОТ-ПЦР по количественному выходу вирусспецифических фрагментов кДНК не уступал методу раздельной ОТ и ПЦР и при этом сокращал время постановки реакции и был технически проще первого. С использованием РНК, выделенной из концентрированного и очищенного вируса ИБК, был осуществлен подбор оптимального температурно-временного режима для ОТ-ПЦР, а также концентраций компонентов реакций. Оптимизированы условия выделения суммарной РНК для индикации вируса ИБК в различных вируссодержащих материалах. В результате, была отработана методика амплификации в ПЦР консервативной области З'-UTR, которая использовалась для индикации вируса ИБК в инфицированных куриных эмбрионах, внутренних органах инфицированных птиц, образцах вакцинных и вирулентных препаратов.

При разработке метода идентификации вируса ИБК было показано, что для определения нуклеотидной последовательности вариабельной области гена S1 наиболее удобно использовать метод циклического секвенирования. Данный метод отличается скоростью и технической простотой анализа.

На основе ПЦР и прямого секвенирования амплифицированных фрагментов кДНК разработан метод, позволяющий в течение 2−3 дней проводить идентификацию штаммов вируса ИБК. Разработанный метод идентификации вируса ИБК был использован для выявления спектра штаммов вируса, циркулирующих на птицефабриках России. Определена первичная структура вариабельной области гена 81 22 изолятов вируса ИБК.

Для оценки возможности проведения штаммовой дифференциации с помощью сравнительного анализа первичной структуры выбранной нами вариабельной области мы использовали нуклеотидные последовательности гена 81.

Филогенетический анализ последовательностей вариабельной области гена 81 американских, европейских, и японских штаммов из базы данных ЕМВЬ показал, что они образуют несколько генетических групп и их распределение в большинстве случаев коррелирует с серологической классификацией, за исключением нескольких серологически отличных европейских штаммов конца 1970;х начала 1980;х гг, обладающих высокой генетической гомологией и японского изолята КВ8523. При этом следует отметить, что четкой корреляции между разделением штаммов на генетические группы и их геграфическим происхождением не было выявлено.

Таким образом, было показано, что анализ последовательностей выбранной нами вариабельной области гена отражает общую структуру филогенетических связей, полученную при анализе последовательностей полного гена 81 и серологическую классификацию изученных штаммов.

Нуклеотидные и соответствующие аминокислотные последовательности вариабельной области гена 81 исследованных изолятов сравнили между собой и с последовательностями, опубликоваными ЕМВЬ. Сравнительный анализ установленных первичных структур позволил определить вариабельность вируса, выявить генетические группы штаммов.

На основе гомологии первичной структуры вариабельной области гена 81 можно выделить несколько групп изолятов. Первая группа (10 изолятов) обладает большим сходством со штаммами серотипа Массачусеттс, которые выделяют во многих странах. Десять входящих в эту группу изолятов по нуклеотидной последовательности очень сходны с вакцинными штаммами Н120 и Н52. Широкое географическое распространение штаммов серотипа Массачусеттс, которые выделяют в разных странах Европы и в США объясняется, по-видимому, широким использованием живых вакцин против ИБК, полученных на основе штаммов этого серотипа (Н52, Н120, МА5, АМ и ряда других). Около половины нуклеотидных замен сосредоточено в двух гипервариабельных областях, определенных Niesters и соавт., (1986) для серотипа Массачусеттс. При сравнении аминокислотных последовательностей уровень различий между исследованными изолятами и штаммами М41, Beaudette, «Чапаевский» возрастает до 7−9%, так как большинство нуклеотидных замен приводит к заменам аминокислот, хотя различия изолятов между собой и штаммами H120, Н52 увеличиваются не столь значительно (до 4%). Полученные данные по первичной структуре вариабельной области гена S1 и теоретический расчет вторичных структур белка по методу Chou и соавт. [1974] изученных изолятов этой группы указывают на их сходство и позволяют предположить у них антигенные свойства, сходные со штаммами серотипа Массачусеттс.

К описанной выше генетической группе примыкает изолят IBV-06/98, выделенный в Краснодарском крае. Результаты сравнительного анализа показали, что его отличия от российских изолятов, а также от вакцинных и патогенных штаммов Массачусеттской группы по нуклеотидным последовательностям составляют от 4,5 до 6%, а по аминокислотным еще выше (7,5−9,5%), так как большинство нуклеотидных замен значимые, от других штаммов отличия значительно выше. Для оценки предполагаемых антигенных свойств изолята IBV-06/98, по нашему мнению, обязательно проведение серологических исследований, т.к. достаточно высокий уровень генетических различий (предельный внутри серотипа Массачусеттс), а также данные о том, что изолят выделен от вакцинированной птицы затрудняют оценку по данным филогенетического анализа.

Высокий уровень отличий, выявленный у 10 других отечественных изолятов от американских и европейских штаммов вируса ИБК показал, что они не относятся ни к одной из изученных генетических групп, поэтому они были названы «вариантными» изолятами. Они имеют от 25 до 30% отличий от всех анализируемых штаммов вируса.

Изоляты IBY-10/98 и IBY-20/98, выделенные на птицефабриках «Горинская» (Ивановская обл.) и «Истро-Сенежская» (Московская обл.) имеют высокий уровень гомологии нуклеотидных (92,5%) и аминокислотных (93,5%) последовательностей между собой, значительно отличаясь от других штаммов и изолятов. Наиболее высокой гомологией нуклеотидных последовательностей (19−20%) с этими двумя изолятами обладает изолят IBV-04/98, выделенный в Московской области.

Высокой степенью гомологии нуклеотидных последовательностей (около 93%) обладают изоляты IBV-08/98 и IBV-21/98, выделенные на п/ф «Дружба» и «Русь». Оба эти изолята были выделены в одном географическом регионе (Краснодарский край) от кур-несушек, у которых наблюдались сходные клинические признаки, характерные для ИБК (нефриты, недоразвитие и атрофия яичников, увеличение процента бесскорлуповых яиц). В обоих хозяйствах проводилась вакцинация живыми и инактивированными вакцинами против ИБК серотипа Массачусеттс производства Голландии и США, которая не обеспечивала надежной защиты против заболевания.

Проведенные за рубежом фирмами «Intervet» и «TAD» серологические исследования сывороток в РТГА от инфицированной вирусом ИБК птицы из двух птицефабрик Московской области и Краснодарского края, где по нашим данным были выявлены изоляты, имеющие сильно отличающуюся структуру исследуемой области подтвердили, что они антигенно отличны от референтных европейских штаммов.

Наибольшим своеобразием отличаются 4 изолята IBV-07/98, IBV-12/98, IBV-16/98 и IBV-17/98, выделенные в Краснодарском крае, Омской, Ростовской и Пермской областях. Они отличаются от всех изученных изолятов и между собой на 20−30% по нуклеотидным и на 22−30% по аминокислотным последовательностям на исследуемом участке.

Значительно отличающиеся по первичной структуре изоляты были выявлены с незначительным временным интервалом от бройлеров на птицефабрике «Сибирская», Омской области: IBV-09/98, IBY-12/98. Первый изолят был выявлен в апреле 1998 г. от цыплят-бройлеров с респираторной клиникой и, по результатам сравнительного анализа, был отнесен к Массачусеттской генетической группе. После вакцинации против ИБК, спустя 2 месяца, в июне 1998 г., в патматериале с этой же птицефабрики был выявлен изолят IBV-12/98, первичная структура вариабельной области гена S1 которого значительно отличалась как от выделенного ранее изолята, так и от всех остальных изолятов и штаммов. На основе полученных данных нельзя сделать однозначных выводов: или на одной птицефабрике могут практически одновременно перси стировать изоляты, вируса ИБК, генетически сильно отличающиеся друг от друга, или произошла быстрая смена одного штамма другим, причем вызывающим совершенно другие клинические проявления у птицы.

Изолят IBV-14/98, выявленный на птицефабрике «Большевик», Воронежской области от цыплят яичного направления, обнаружил 91−92% гомологии по нуклеотидным и 88,5−89% гомологии по аминокислотным последовательностям со штаммами серотипа 793/В, впервые выделенными в Великобритании в 1991 г., и распространившимися в других странах. Высокий уровень гомологии этого изолята и штаммов 793/В позволяет предположить, что они имеют общее происхождение и данный изолят мог быть занесен в Россию из Европы. Для профилактики ИБК, вызванного изолятами нового серотипа 793/В, фирмой «Intervet» (Голландия) была создана живая вакцина на основе аттенуированного штамма 4/91, применение которой, по-видимому является целесообразным в случаях выявления изолятов этой группы и в нашей стране.

Филогенетический анализ показал, что почти половина изолятов (10 из 22), выделенных на территории России не относятся к какой либо генетической группе и не имеют высоких уровней гомологии ни с одним зарубежным штаммом. Это свидетельствует о том, что вспышки ИБК, имевшие место на ряде птицефабрик России не были вызваны вирусами европейского или американского происхождения, а вызывались изолятами, появившимися в нашей стране. Столь значительные отличия в первичной структуре вариабельной области гена и белка S1, которая считается определяющей антигенные свойства вируса ИБК, выявленные у «вариантных» изолятов, позволяют предполагать у них наличие оригинальных антигенных характеристик.

За рубежом, для профилактики ИБК, вызванного вариантными штаммами, которые постоянно выявляются в разных странах применяют живые и инактивированные вакцины на основе этих штамов, а также поливалентные живые вакцины серотипов Массачусеттс и Арканзас (Gelb et al., 1991, 1997). В сложившейся на птицефабриках России ситуации с ИБК для профилактики и контроля за вариантными изолятами целесообразным, по-видимому, будет получение на их основе инактивированных вакцин, обеспечивающих достаточно высокие уровни иммунитета, специфичного к полевым изолятам.

С использованием результатов собственных исследований, а также данных ЕМВЬ, был создан банк данных, включающий 50 нуклеотидных последовательностей вариабельной области гена 81 отечественных и зарубежных полевых изолятов и вакцинных штаммов вируса ИБК. Анализ накопленных данных позволяет наиболее полно представить генетическую вариабельность вируса ИБК. Было показано, что сравнительный анализ исследуемого участка не выявляет четкой корреляции между разделением штаммов на группы и географическим местом выделения, что, по всей видимости, связано с особенностями распространения заболевания.

Создание банка данных, включающего первичные структуры вариабельной области гена Б1 штаммов вируса ИБК, выделенных в разных регионах и в разное время, позволяет проводить сравнение не только среди штаммов, циркулирующих на территории России, но и сравнивать их со штаммами, выделенными в других странах, что становится особенно важным, т.к. практика закупки племенной птицы у зарубежных фирм может способствовать быстрому распространению новых штаммов вируса на территории России.

Проведенный комплекс молекулярно-биологических работ позволил разработать метод индикации генома и штаммовой дифференциации вируса ИБК, изучить генетические взаимотношения между российскими изолятами вируса ИБК и зарубежными штаммами.

Таким образом, результаты изучения первичных структур полевых и вакцинных штаммов вируса ИБК свидетельствуют о том, что данное направление исследований является перспективным для изучения эпизоотологии ИБК, а также для изучения структурно-функциональной организации ИБК на молекулярном уровне.