Диплом, курсовая, контрольная работа
Помощь в написании студенческих работ

Синтез ДНК ab initio, стимулируемый никующей эндонуклеазой Nt.BspD6I

Диссертация: Синтез ДНК ab initio, стимулируемый никующей эндонуклеазой Nt.BspD6I
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

При использовании различных методов амплификации ДНК часто возникает проблема появления неспецифических продуктов, особенно, если в реакции используется сложная матрица (геномная ДНК или ДНК, способная формировать вторичные структуры) и/или очень низкое количество матричной ДНК. Одним из источников образования неспецифических продуктов во многих случаях может быть способность термофильных… Читать ещё >

Содержание

  • 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ !
    • 1. 1. СИНТЕЗ ДНК В ОТСУТСТВИЕ МАТРИЦЫ И ПРАЙМЕРА
      • 1. 1. 1. Синтез ДНК ab initio ДНК-полимеразами 1 о
      • 1. 1. 2. Синтез ДНК ab initio в присутствии эндонуклеаз рестрикции
      • 1. 1. 3. Распространененность феномена формирования ферментами информации, 17 независимо от матрицы ДНК или РНК
      • 1. 1. 4. Возможная функциональная роль независимого от матрицы синтеза ДНК
    • 1. 2. НИКУЮЩИЕ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ
      • 1. 2. 1. Общая характеристика никаз. Никаза Nt.Bsp.D6I
      • 1. 2. 2. Применение никующих эндонуклеаз
    • 1. 3. БЕЖИ БАКТЕРИОФАГА Т4 И Е. coli, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С 31 ОДНОЦЕПОЧЕЧНОЙ ДНК
      • 1. 3. 1. Структурно-функциональные особенности белков SSB
      • 1. 3. 2. Применение белков Т4 gp32 и EcoSSB
  • 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТ
    • 2. 1. МАТЕРИАЛЫ
    • 2. 2. ОБОРУДОВАНИЕ
    • 2. 3. ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ И ИНТЕРНЕТ РЕСУРСЫ
    • 2. 4. МЕТОДЫ
      • 2. 4. 1. Электрофорезы
      • 2. 4. 2. Работа с радиоактивными изотопами
      • 2. 4. 3. Ферментативные реакции
      • 2. 4. 4. Выделение ДНК
      • 2. 4. 5. Работа с бактериями и бактериофагами
      • 2. 4. 6. Синтез ДНК ab inito
      • 2. 4. 7. Электронная микроскопия
      • 2. 4. 8. Изотермическая амплификация ДНК
  • 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
    • 3. 1. ОСОБЕННОСТИ ФЕРМЕНТОВ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ
    • 3. 2. СИНТЕЗ ДНК ab initio
      • 3. 2. 1. Синтез ДНК ab initio одной ДНК-полимеразой Bst
      • 3. 2. 2. Нуклеотидилтрансферазная активность ДНК-полимеразы Bst
      • 3. 2. 3. Синтез ДНК ab initio ДНК-полимеразой Bst в присутствие различных 61 никующих эндонуклеаз
  • Синтез ДНК ab initio, стмулируемый Nt. BspD6I
  • Синтез ДНК ab initio стмулируемый никазами Nt. AlwI, Nb. BbvCI и
  • Nb. BsmAI
    • 3. 2. 4. Синтез ДНК ab initio ДНК-полимеразой Bst в присутствие никующей 65 эндонуклеазы Nt. BspD6I
  • Зависимость синтеза ab initio от времени и количества никазы Nt. BspD6I
  • Анализ первичной стуктуры ДНК
  • Электронная микроскопия ДНК
    • 3. 2. 5. Определение нуклеотидной последовательности продуктов синтеза ДНК 70 ab initio
  • Клонирование последовательностей
  • Секвенирование ДНК
    • 3. 3. СХЕМАТИЧЕСКОЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ МОДЕЛИ ЭЛОНГАЦИИ ДНК ПРИ 76 СИНТЕЗЕ ab initio
    • 3. 4. ИНГИБИРОВАНИЕ СИНТЕЗА ДНК ab initio. 80 ВЛИЯНИЕ БЕЖОВ Т4 gp32 И SSB E. coli НА СИНТЕЗ ДНК
    • 3. 4. 1. Влияние белков SSB на синтез ДНК полимеразой Bst 81 Синтез ДНК ab initio в присутствие Т4 gp32 и EcoSSB 83 Синтез ДНК на праймированной матрице в присутствие Т4 gp32 и
  • EcoSSB
    • 3. 4. 2. Влияние белков Т4 gp32 и EcoSSB на синтез ДНК в присутствие никазы 85 Nt. BspD6I
  • Синтез ДНК ab initio в присутствие Т4 gp32 и EcoSSB
  • Синтез ДНК на праймированной матрице

Синтез ДНК ab initio, стимулируемый никующей эндонуклеазой Nt.BspD6I (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

При использовании различных методов амплификации ДНК часто возникает проблема появления неспецифических продуктов, особенно, если в реакции используется сложная матрица (геномная ДНК или ДНК, способная формировать вторичные структуры) и/или очень низкое количество матричной ДНК. Одним из источников образования неспецифических продуктов во многих случаях может быть способность термофильных ДНК-полимераз синтезировать ДНК в присутствии только dNTP. Синтез ДНК в отсутствие матричной ДНК и праймера термофильными ДНК-полимеразами был впервые убедительно продемонстрирован в середине 90-х в работах Огата и Миура. Авторы назвали наблюдаемый синтез синтезом ДНК ab initio. Продуктами синтеза ab initio были высокомолекулярные ДНК длиной от 0.1 до 50 т.п.о., состоящие из повторов длиной 8−10 п.о., состав которых зависел от условий реакции. На основании того, что подобные последовательности широко распространены как в сателлитной ДНК, так и в кодирующих участках генома эукариотов, Огата и Миура выдвинули предположение, что такие тандемные повторы были синтезированы ДНК-полимеразой на определенной стадии эволюции генома и что генетическая информация потенциально может создаваться непосредственно белком. Спустя несколько лет, Франк-Каменецким с соавт. было показано, что скорость синтеза ДНК ab initio значительно увеличивается при добавлении эндонуклеаз рестрикции. ДНК, синтезируемая в этом случае, состоит из палиндромных повторов, содержащих один или два сайта узнавания эндонуклеазы рестрикции, участвующей в реакции. Несмотря на то, что в работах, в которых изучается синтез ДНК ab initio, реагенты, участвующие в реакции, подвергаются тщательной очистке, тем не менее, это не исключает полностью присутствия следовых количеств ДНК, связанной с ферментами. В связи с этим, в англоязычной литературе этот синтез называют также синтезом, независимым от матрицы и праймера (template/primer-independent DNA synthesis).

Нами обнаружено, что синтез ДНК ab initio сильно стимулируется в присутствии никующих эндонуклеаз. Никующие эндонуклеазы (никазы) — недавно выделенная отдельная группа ферментов, которые, действуя в виде мономеров, узнают короткую специфическую последовательность (сайт), вносят разрыв (ник — nick) в одну из цепей ДНК в фиксированном положении относительно этой последовательности. На сегодняшний день известны никазы как выделенные из природных штаммов, так и полученные путем мутагенеза различных эндонуклеаз рестрикции. Одной из первых открытых никаз была никаза Nt. BspD6I выделенная в нашей лаборатории из термофильного штамма Bacillus species D6. Этот 70.8-кДа белок узнает на двухспиральной ДНК последовательность (сайт) б'-ОАСТС-З'/З7-GACTC-3 и расщепляет только цепь, содержащую последовательность GAGTC на расстоянии 4 нт от сайта узнавания в сторону З'-конца. В нашей лаборатории определена и первая для этого класса ферментов пространственная структура.

Несмотря на то, что никующие эндонуклеазы открыты сравнительно недавно, они уже нашли применение в разработке различных методов, в том числе методов, предназначенных для медицинской диагностики. Среди последних методов — амплификация ДНК с вытеснением цепи, изотермическая амплификация олигонуклеотидов, амплификация случайных последовательностей геномной ДНК, реакция экспоненциальной амплификации ДНК, картирование ДНК, мечение уникальной последовательности в ДНК. Однако использование никующих эндонуклеаз в сочетании с ДНК-полимеразами, как показано в настоящей работе, приводит к синтезу неспецифических продуктов, с которым столкнулись и другие исследователи. В связи с этим остро стоит проблема избавления от продуктов неспецифического синтеза ДНК в присутствии никующих эндонуклеаз. В качестве возможных ингибиторов неспецифического синтеза в настоящей работе были выбраны белки, связывающиеся с одноцепочечной ДНК (single-stranded DNA binding, SSB).

Белки SSB связываются неспецифически с высокой аффинностью с оцДНК в стехиометрических количествах, стабилизируют и придают ей регулярную форму, денатурируя побочные вторичные структуры, а также защищают одноцепочечную ДНК от нуклеаз. В ряде работ показано, что эти белки способны повышать эффективность амплфикации ДНК различными ДНК-полимеразами как за счет увеличения скорости элонгации и процессивности полимеразы, так и за счет увеличения точности синтеза. Считается, что присутствие белков SSB может сильно стимулировать изотермическое вытеснение цепи, и таким образом уменьшать формирование димеров праймеров и приводить к устранению неспецифических продуктов.

Таким образом, цель данного исследования заключалась в изучении синтеза ДНК ab initio ДНК-полимеразой Bst, стимулируемого никующей эндонуклеазой Nt. BspD6I.

В ходе исследования решались следующие задачи:

— сконструировать штаммы-суперподуценты большого фрагмента ДНК-полимеразы Bst и SSB белка Т4 gp32 и выделить эти белки в электорофоретически и функционально чистом состоянии;

— изучить синтез ДНК ab initio одной ДНК-полимеразой Bst;

— изучить влияние Nt. BspD6I и других никующих эндонуклеаз на синтез ДНК ab initio;

— изучить зависимость синтеза ДНК ab initio от времени и количества никующей эндонуклеазы Nt. BspD6I;

— установить структуру ДНК, синтезируемой в присутствии Nt. BspD6I;

— определить нуклеотидную последовательность продуктов синтеза ДНК ab initio;

— изучить влияние белков SSB на синтез ДНК ab initio.

выводы.

1. Впервые установлено, что никующие эндонуклеазы стимулируют высокоэффективный синтез ДНК в отсутствие матрицы и праймера (синтез ДНК ab initio).

2. Установлено, что структура ДНК, синтезированная в присутствии никующей эндонуклеазы Nt. BspD6I, является двухцепочечной, содержащей разветвленные участки.

3. Определена нуклеотидная последовательность ДНК, синтезированной в присутствии Nt. BspD6I, которая состоит из повторов сайта узнавания никазы в прямой или обратной ориентации.

4. Предложен механизм синтеза ДНК ab initio в присутствии Nt. BspD6I.

5. Показано, что белок gp32 бактериофага Т4, связывающийся с одноцепочечной ДНК, ингибирует синтез ДНК ab initio, но не влияет на синтез ДНК в присутствии матрицы и праймера. Таким образом, его можно рекомендовать в качестве ингибитора синтеза ДНК ab initio в реакциях амплификации ДНК с участием никующих эндонуклеаз.

Список публикаций по материалам диссертационной работы.

Статьи.

1. Zyrina N.V., Zheleznaya L.A., Dvoretsky E.V., Vasiliev V.D., Chernov A., Matvienko N.I. N. BspD6I DNA nickase strongly stimulates template independent synthesis of non-palindromic repetitive DNA by Bst DNA polymerase. Biol. Chem. 2007, Vol. 388, pp. 367−372.

2. H.B. Зырина. Л. А. Железная, И. В. Свадьбина, Н. И. Матвиенко.

Новый метод получения выеокоочищенного белка р32 бактериофага Т4 для биомедицинских исследований. Биомедицинский журнал Medline.ru, 2011, Т. 12, с. 1101−1118.

3. Н. В. Зырина. Р. И. Артюх, И. В. Свадьбина, Л. А. Железная, Н. И. Матвиенко.

Влияние белков, связывающихся с одноцпочечной ДНК, на безматричный/беспраймерный синтез ДНК в присутствии никующей эндонуклеазы Nt. BspD6I. Биоорганическая химия, 2012, Т. 38, N2, с. 199−205.

Тезисы докладов.

1. Зырина Н. В., Железная Л. А., Матвиенко Н. И. Очистка С-концевого фрагмента ДНК полимеразы Bacillus stearothermophillus и его применение в амплификации ДНК по типу катящегося кольца. Биотехнология: состояние и перспективы развития: материалы Третьего Московского международного конгресса (Москва, 14−18 марта, 2005 г.) М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д. И. Менделеева, 2005;часть 1, с. 68.

2. Дворецкий Е. В., Зырина Н. В. Матвиенко Н. И., Васильев В. Д. Безматричный синтез Bst ДНК-полимеразой в присутствии никазы. Биология — наука XXI века: X Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 17−21 апреля, 2006 г.) Сборник тезисов, Т.1, с. 13.

3. Дворецкий Е. В., Зырина Н. В. ДНК никазы N. Bsp D6I, N. Alwl, N. BbvC IA, BsmI стимулируют синтез ДНК ab initio ДНК-полимеразой из Bacillus stearothermophilus.

XIII международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «ЛОМОНОСОВ-2006» (Москва, 12−15 апреля 2006 г). Материалы конференции, с. 72−73.

4. Zyrina N.V. Zheleznaya L.A., Dvoretsky E.V., Vasiliev V.D., Chernov A., Matvienko N.I. Template independent DNA synthesis by Bst DNA polymerase in the presence of site-specific DNA nickases. Proceedings of the 40th Anniversary of the Institute of Protein Research Russian Academy of Sciences International Conference on «Protein Biosynthesis, Structure and Function» June 9−13, 2007, Pushchino, Russia, p 35.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Диссертационная работа посвящена решению актуальной молекулярно-биологической научной задачи — изучению неспецифического синтеза ДНК в отсутствии добавленных извне матрицы и праймера (синтез ДНК ab initio). Нами впервые обнаружено, что синтез ДНК ab initio ДНК-полимеразой Bst эффективно стимулируется никующей эндонуклеазой Nt. BspD6I, открытой в нашей лаборатории, а также никующими эндонуклеазами Nt. Alwl, Nb. BbvcI и Nb.BsmI. Синтез ДНК ab initio в присутствии никующих эндонуклеаз показал зависимый от концентрации характер: при небольших количествах никазы синтезировались высокомолекулярные продукты, при высоких количествах появлялись низкомолекулярные гомогенные полосы. Наличие низкомолекулярных продуктов свидетельствует о том, что синтез ДНК сопровождается гидролизом.

Мы остановились на детальном изучении синтеза ДНК ab initio в присутствии никазы Nt. BstD6I. Проведенный анализ структуры синтезированной ДНК обработкой различными нуклеазами (ДНКазой I, эндонуклеазой рестрикции Hinfl, нуклеазой золотистой фасоли) а также анализ с использованием электронной микроскопии показал, часть молекул ДНК имела разветвленные участки. Таким образом, было установлено, что синтезированная ДНК имеет необычную структуру.

Для определения нуклеотидной последовательности продуктов синтеза ДНК ab initio была поставлена задача клонировать ДНК, синтезированную ab initio, в плазмидном векторе pUC 18. Задача осложнялась тем, что большие вставки, содержащие большое количество повторяющихся последовательностей ДНК, не поддерживаются при клонировании, поскольку в таких вставках часто происходят делеции. По этой причине мы получали вставки небольшого размера, гидролизуя синтезированную до среднего размера 100 п.о. Были клонированы продукты синтеза ДНК ab initio, стимулированного никующей эндонуклеазой, а также продукты синтеза только полимеразы Bst. Анализ последовательностей ДНК, синтезированной в присутствии никазы, показал, что большинство продуктов состоит из повторов в прямой или обратной ориентации последовательности сайта, узнаваемого никазой, с одним дополнительным нуклеотидом, А или Т (Рис. 8). Встречались также повторы сайта узнавания никазы без вставки дополнительного нуклеотида. Последовательности ДНК, синтезированной в присутствии только полимеразы, оказались представленными dAT сополимерами. Таким образом, оказалось, что последовательности продукта синтеза ab initio в присутствии ииказы четко отличается от опубликованных ранее последовательностей продуктов, синтезированных только полимеразой и полимеразой в присутствие эндонуклеаз рестрикции.

На основе полученных нами данных мы предложили модель элонгации ДНК при синтезе ab initio, стимулируемом никующими эндонуклеазами. Модель объясняет образование разветвленной структуры и учитывает особенности использованных нами ферментов. Модель хорошо согласуется с известными данными по амплификации ДНК полимеразами при независимом от матрицы синтезе ДНК.

В данной работе проведено изучение возможности ингибирования неспецифического синтеза ДНК ab initio. Дело в том, что в настоящее время для диагностических исследований предложен целый методов, основанных на использовании ДНК-полимераз совместно с никующими эндонуклеазами. В этих методах никующие эндонуклеазы часто используются вместе с большим фрагментом ДНК-полимеразы Bst. Использование никующих эндонуклеаз в сочетании с ДНК-полимеразами, как показано в данной работе, приводит к синтезу неспецифических продуктов, с которым столкнулись и другие исследователи. В связи с этим остро стоит проблема избавления от продуктов неспецифического синтеза ДНК в присутствии никующих эндонуклеаз. В качестве возможных ингибиторов были рассмотрены белки SSB Е. coli (Eco SSB) и продукт гена 32 бактериофага Т4 (Т4 gp32), наиболее изученные и доступные в качестве коммерческих препаратов. Оказалось, что белок Eco SSB несколько стимулирует синтез ДНК ab initio одной ДНК-полимеразой Bst и практически не вляет на синтез ДНК ab initio в присутствии никазы Nt. BspD6I. Т4 gp32. Мы показали, что белок Т4 gp32 ингибирует синтез ДНК ab initio, но не влияет на синтез ДНК в присутствии матрицы и праймера. Таким образом, его можно рекомендовать в качестве ингибитора синтеза ДНК ab initio в реакциях амплификации ДНК с участием никующих эндонуклеаз.

Показать весь текст

Список литературы

  1. , М. А., Беличенко, О. А., Шевченко, А. В., и Дегтярев, С. X. (1996). N. BstSE — сайт-специфическая нуклеаза из Bacillus stearothermophilus SE-589. Мол. биол. 30,1261−1267.
  2. , Л. А., Перевязова, Т. А., Альжанова, Д. В., и Матвиенко, Н. И. (2001). Сайт-специфическая никаза из штамма Bacillus species D6. Биохимия 66,1215−1220.
  3. , Л. А., Качалова, Г. С., Артюх, Р. И., Юнусова А. К., Перевязова Т. А. и Матвиенко, Н. И. (2009). Никующие эндонуклеазы. Успехи биологической химии, 49, с. 107−128.
  4. , Т., Фрич, Э., and Сэмбрук, Д. (1984). Молекулярное клонирование. Мир, Москва
  5. , В. М., and Frey, L. (1970). Т4 bacteriophage gene 32: a structural protein in the replication and recombination of DNA. Nature 227 (5265), 1313−1318.
  6. Aliotta, J. M., Pelletier, J. J., Ware, J. L., Moran, L. S., Benner, J. S., and Kong, H. (1996). Thermostable Bst DNA polymerase I lacks a 3'→5' proofreading exonuclease activity. Genet Anal 12 (5−6), 185−195.
  7. Bath, J., Green, S. J., and Turberfield, A. J. (2005). A free-running DNA motor powered by a nicking enzyme. Angew Chem Int Ed Engl 44 (28), 4358−4361.
  8. Baugh, L. R., Hill, A. A., Brown, E. L., and Hunter, C. P. (2001). Quantitative analysis of mRNA amplification by in vitro transcription. Nucleic Acids Res 29 (5), E29.
  9. , M. (1996). De Novo synthesis of DNA-like molecules by polynucleotide phosphorylase in vitro. Journal of Molecular Evolution 42 (5), 493−499.
  10. Berdis, A. J., and McCutcheon, D. (2007). The use of non-natural nucleotides to probe template-independent DNA synthesis. Chembiochem 8 (12), 1399−1408.
  11. Biebricher, С. K., and Luce, R. (1996). Template-free generation of RNA species that replicate with bacteriophage T7 RNA polymerase. EMBOJ15 (13), 3458−3465.
  12. Biebricher, С. K., Eigen, M., and Luce, R. (1981). Product analysis of RNA generated de novo by Q beta replicase. JMol Biol 148 (4), 369−390.
  13. Biebricher, С. K., Eigen, M., and Luce, R. (1986). Template-free RNA synthesis by Q beta replicase. Nature 321 (6065), 89−91.
  14. Bochkarev, A., Pfuetzner, R. A., Edwards, A. M., and Frappier, L. (1997). Structure ofthe single-stranded-DNA-binding domain of replication protein A bound to DNA. Nature 385 (6612), 176−181.
  15. , C. (1981). DNA electron microscopy. CRC Crit Rev Biochem 10 (2), 113−169.
  16. Brack, C., Bickle, T. A., and Yuan, R. (1975). The relation of single-stranded regions in bacteriophage PM2 supercoiled DNA to the early melting sequences. Journal of Molecular Biology 96 (4), 693−702.
  17. Brukner, I., Paquin, B., Belouchi, M., Labuda, D., and Krajinovic, M. (2005). Self-priming arrest by modified random oligonucleotides facilitates the quality control of whole genome amplification. Anal Biochem 339 (2), 345−347.
  18. Bujalowski, W., Overman, L. B., and Lohman, T. M. (1988). Binding mode transitions of Escherichia coli single strand binding protein-single-stranded DNA complexes. Cation, anion, pH, and binding density effects. J Biol Chem 263 (10), 4629−4640.
  19. Canceill, D., Viguera, E., and Ehrlich, S. D. (1999). Replication slippage of different DNA polymerases is inversely related to their strand displacement efficiency. J Biol Chem 274 (39), 27 481−27 490.
  20. Chan, S. H., Zhu, Z., Van Etten, J. L., and Xu, S. Y. (2004). Cloning of CviPII nicking and modification system from Chlorella virus NYs-1 and application of Nt. CviPII in random DNA amplification. Nucleic Acids Res 32 (21), 6187−6199.
  21. Chou, Q., Russell, M., Birch, D. E., Raymond, J., and Bloch, W. (1992). Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications. Nucleic Acids Res 20 (7), 1717−1723.
  22. Chrysogelos, S., and Griffith, J. (1982). Escherichia coli single-strand binding protein organizes single-stranded DNA in nucleosome-like units. Proc Natl Acad Sei U S A 79 (19), 5803−5807.
  23. , J. M. (1988). Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNA polymerases. Nucleic Acids Res 16 (20), 9677−9686.
  24. , J. M. (1991). DNA synthesis on discontinuous templates by DNA polymerase I of Escherichia coli. Gene 104 (1), 75−80.
  25. , L. W. (1987). Preparation of nucleic acids for electron microscopy. In «Electron Microscopy in Molecular Biology» (J. Sommerville, and U. Scheer, Eds.), pp. 1−29. IRL Press, Oxford, England.
  26. Curth, U., Genschel, J., Urbanke, C., and Greipel, J. (1996). In vitro and in vivo function of the C-terminus of Escherichia coli single-stranded DNA binding protein. Nucleic Acids Res 24(14), 2706−2711.
  27. Dabrowski, S., and Kur, J. (1999). Cloning, overexpression, and purification of the recombinant His-tagged SSB protein of Escherichia coli and use in polymerase chain reaction amplification. Protein Expr Purif16 (1), 96−102.
  28. Davydova, E. K., and Rothman-Denes, L. B. (2003). Escherichia coli single-stranded DNA-binding protein mediates template recycling during transcription by bacteriophage N4 virion RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA 100 (16), 9250−9255.
  29. Delius, H., Mantell, N. J., and Alberts, B. (1972). Characterization by electron microscopy of the complex formed between T4 bacteriophage gene 32-protein and DNA. J Mo I Biol 67 (3), 341−350.
  30. Drabovich, A., and Krylov, S. N. (2004). Single-stranded DNA-binding protein facilitates gel-free analysis of polymerase chain reaction products in capillary electrophoresis. J ChromatogrA 1051 (1−2), 171−175.
  31. Dunn, J. J., and Studier, F. W. (1981). Nucleotide sequence from the genetic left end of bacteriophage T7 DNA to the beginning of gene 4. JMol Biol 148 (4), 303−330.
  32. Ehses, S., Ackermann, J., and McCaskill, J. S. (2005). Optimization and design of oligonucleotide setup for strand displacement amplification. J Biochem Biophys Methods 63 (3), 170−186.
  33. Garcia, P. B., Robledo, N. L., and Islas, A. L. (2004). Analysis of non-template-directed nucleotide addition and template switching by DNA polymerase. Biochemistry 43 (51), 16 515−16 524.
  34. Garcia-Diaz, M., and Bebenek, K. (2007). Multiple functions of DNA polymerases. CRC Crit Rev Plant Sci 26 (2), 105−122.
  35. , M. F. (2002). ERROR-PRONE REPAIR DNA POLYMERASES IN PROKARYOTES AND EUKARYOTES. Annual Review of Biochemistry 71 (1), 17−50.
  36. Grunberg-Manago, M., Oritz, P. J., and Ochoa, S. (1955). Enzymatic synthesis of nucleic acidlike polynucleotides. Science 122 (3176), 907−910.
  37. Hanaki, K., Odawara, T., Muramatsu, T., Kuchino, Y., Masuda, M., Yamamoto, K., Nozaki, C., Mizuno, K., and Yoshikura, H. (1997). Primer/template-independent synthesis of poly d (A-T) by Taq polymerase. Biochem Biophys Res Commun 238 (1), 113−118.
  38. Heiter, D. F., Lunnen, K. D., and Wilson, G. G. (2005). Site-specific DNA-nicking mutants of the heterodimeric restriction endonuclease R.BbvCI. J Mol Biol 348 (3), 631 640.
  39. Hsu, G. W., Ober, M., Carell, T., and Beese, L. S. (2004). Error-prone replication of oxidatively damaged DNA by a high-fidelity DNA polymerase. Nature 431 (7005), 217 221.
  40. Hu, G. (1993). DNA polymerase-catalyzed addition of nontemplated extra nucleotides to the 3' end of a DNA fragment. DNA Cell Biol 12 (8), 763−770.
  41. Huberman, J. A., Kornberg, A., and Alberts, B. M. (1971). Stimulation of T4 bacteriophage DNA polymerase by the protein product of T4 gene 32. J Mol Biol 62 (1), 39−52.
  42. Inoue, H., Nojima, H., and Okayama, H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96 (1), 23−28.
  43. Inoue, J., Shigemori, Y., and Mikawa, T. (2006). Improvements of rolling circle amplification (RCA) efficiency and accuracy using Thermus thermophilus SSB mutant protein. Nucleic Acids Res 34 (9), e69.
  44. Ji, J., Clegg, N. J., Peterson, K. R., Jackson, A. L., Laird, C. D., and Loeb, L. A. (1996). In Vitro Expansion of GGC: GCC Repeats: Identification of the Preferred Strand of Expansion. Nucleic Acids Research 24 (14), 2835−2840.
  45. Joyce, C. M., and Steitz, T. A. (1994). Function and structure relationships in DNA polymerases. Annu Rev Biochem 63, 777−822.
  46. Kacian, D. L., Mills, D. R., Kramer, F. R., and Spiegelman, S. (1972). A replicating RNA molecule suitable for a detailed analysis of extracellular evolution and replication. Proc Natl Acad Sci USA 69 (10), 3038−3042.
  47. Kaspar, P., Zadrazil, S., and Fabry, M. (1989). An improved double stranded DNA sequencing method using gene 32 protein. Nucleic Acids Res 17 (9), 3616.
  48. Kazmierczak, K. M., Davydova, E. K., Mustaev, A. A., and Rothman-Denes, L. B. (2002). The phage N4 virion RNA polymerase catalytic domain is related to single-subunitRNA polymerases. EMBOJ21 (21), 5815−5823.
  49. Kiefer, J. R, Mao, C., Hansen, C. J., Basehore, S. L., Hogrefe, H. H., Braman, J. C., and Beese, L. S. (1997). Crystal structure of a thermostable Bacillus DNA polymerase I large fragment at 2.1 A resolution. Structure 5 (1), 95−108.
  50. King, J. S., Fairley, C. F., and Morgan, W. F. (1996). DNA end joining by the Klenow fragment of DNA polymerase I. J Biol Chem 271 (34), 20 450−20 457.
  51. Koraberg, A., and Baker, T. A. (2005). «DNA replication.» University Science.
  52. Kornberg, A., Bertsch, L. L., Jackson, J. F., and Khorana, H. G. (1964). Enzymatic Synthesis of Deoxyribonucleic Acid, Xvi. Oligonucleotides as Templates and the Mechanism of Their Replication. Proc Natl Acad Sei USA 51, 315−323.
  53. Kowalczykowski, S. C., Bear, D. G., and Von Hippel, P. H. (1981). Single-Stranded DNA Binding Proteins. In «The Enzymes» (D. B. Paul, Ed.), Vol. 14, pp. 373−444. Academic Press.
  54. Krakow, J. S., and Karstadt, M. (1967). Azotobacter vinelandii ribonucleic acid polymerase. IV. Unprimed synthesis of rIC copolymer. Proc Natl Acad Sei USA 58 (5), 2094−2101.
  55. Krisch, H. M., and Selzer, G. B. (1981). Construction and properties of a recombinant plasmid containing gene 32 of bacteriophage T4. Journal of Molecular Biology 148 (3), 199−218.
  56. Kuhn, H., and Frank-Kamenetskii, M. D. (2008). Labeling of unique sequences in doublestranded DNA at sites of vicinal nicks generated by nicking endonucleases. Nucleic Acids Res 36 (7), e40.
  57. Kunkel, T. A., Meyer, R. R., and Loeb, L. A. (1979). Single-strand binding protein enhances fidelity of DNA synthesis in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 76 (12), 63 316 335.
  58. Kur, J., Olszewski, M., Dlugolecka, A., and Filipkowski, P. (2005). Single-stranded DNA-binding proteins (SSBs) — sources and applications in molecular biology. Acta Biochim Pol 52 (3), 569−574.
  59. , U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227 (5259), 680−685.
  60. Li, H., Cui, X., and Arnheim, N. (1990). Direct electrophoretic detection of the allelic state of single DNA molecules in human sperm by using the polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci USA 87 (12), 4580−4584.
  61. Liang, X., Jensen, K., and Frank-Kamenetskii, M. D. (2004). Very efficient template/primer-independent DNA synthesis by thermophilic DNA polymerase in the presence of a thermophilic restriction endonuclease. Biochemistry 43 (42), 13 459−13 466.
  62. Lin-Chao, S., Chiou, N. T., and Schuster, G. (2007). The PNPase, exosome and RNA helicases as the building components of evolutionarily-conserved RNA degradation machines. JBiomedSci 14 (4), 523−532.
  63. Lizardi, P. M., Huang, X., Zhu, Z., Bray-Ward, P., Thomas, D. C., and Ward, D. C. (1998). Mutation detection and single-molecule counting using isothermal rolling-circle amplification. Nat Genet 19 (3), 225−232.
  64. Lohman, T. M., and Ferrari, M. E. (1994). Escherichia coli single-stranded DNA-binding protein: multiple DNA-binding modes and cooperativities. Annu Rev Biochem 63, 527 570.
  65. Lohman, T. M., and Overman, L. B. (1985). Two binding modes in Escherichia coli single strand binding protein-single stranded DNA complexes. Modulation by NaCl concentration. J Biol Chem 260 (6), 3594−3603.
  66. Lohman, T. M., Overman, L. B., and Datta, S. (1986). Salt-dependent changes in the DNA binding co-operativity of Escherichia coli single strand binding protein. J Mol Biol 187 (4), 603−615.
  67. McClary, J., Ye, S. Y., Hong, G. F., and Witney, F. (1991). Sequencing with the largefragment of DNA polymerase I from Bacillus stearothermophilus. DNA Seq 1 (3), 173 180.
  68. Mead, D. A., McClary, J. A., Luckey, J. A., Kostichka, A. J., Witney, F. R., and Smith, L. M. (1991). Bst DNA polymerase permits rapid sequence analysis from nanogram amounts of template. Biotechniques 11 (1), 76−78, 80, 82−77.
  69. , B. (1989). Oligonucleotide-directed restriction endonuclease digestion. Nucleic Acids Res 17 (8), 3322.
  70. Mills, D. R., Kramer, F. R., and Spiegelman, S. (1973). Complete nucleotide sequence of a replicating RNA molecule. Science 180 (89), 916−927.
  71. Molineux, I. J., and Gefter, M. L. (1974). Properties of the Escherichia coli in DNA binding (unwinding) protein: interaction with DNA polymerase and DNA. Proc Natl Acad Sei USA 71 (10), 3858−3862.
  72. Molineux, I. J., Pauli, A., and Gefter, M. L. (1975). Physical studies of the interaction between the Escherichia coli DNA binding protein and nucleic acids. Nucleic Acids Res 2 (10), 1821−1837.
  73. Morgan, R. D., Calvet, C., Demeter, M., Agra, R., and Kong, H. (2000). Characterization of the specific DNA nicking activity of restriction endonuclease N.BstNBI. Biol Chem 381 (11), 1123−1125.
  74. , A. G. (1993). OB (oligonucleotide/oligosaccharide binding)-fold: common structural and functional solution for non-homologous sequences. EMBO J 12 (3), 861 867.
  75. Myers, T. W., and Romano, L. J. (1988). Mechanism of stimulation of T7 DNA polymerase by Escherichia coli single-stranded DNA binding protein (SSB). J Biol Chem 263 (32), 17 006−17 015.
  76. Novagen (2002). pET Manual. TB055, 10th edition
  77. , S. (1956). Enzymatic synthesis of ribonucleic acid-like polynucleotides. Fed Proc 15 (2), 832−840.
  78. Ogata, N., and Miura, T. (1997). Genetic information 'created' by archaebacterial DNA polymerase. Biochem J 324 (Pt 2), 667−671.
  79. Ogata, N., and Miura, T. (1998a). Creation of genetic information by DNA polymerase of the archaeon Thermococcus litoralis: influences of temperature and ionic strength. Nucleic Acids Res 26 (20), 4652−4656.
  80. Ogata, N., and Miura, T. (1998b). Creation of genetic information by DNA polymerase of the thermophilic bacterium Thermus thermophilus. Nucleic Acids Res 26 (20), 4657−4661.
  81. Ogata, N., and Morino, H. (2000). Elongation of repetitive DNA by DNA polymerase from a hyperthermophilic bacterium Thermus thermophilus. Nucleic Acids Res 28 (20), 3999−4004.
  82. , S. (1987a). Early genes that were oligomeric repeats generated a number of divergent domains on their own. Proc Natl Acad Sei USA 84 (18), 6486−6490.
  83. , S. (1987b). Evolution from primordial oligomeric repeats to modern coding sequences. J Mol Evol 25 (4), 325−329.
  84. Pavlov, A. R" Pavlova, N. V., Kozyavkin, S. A., and Slesarev, A. I. (2004). Recent developments in the optimization of thermostable DNA polymerases for efficient applications. Trends in Biotechnology 22 (5), 253−260.
  85. Phang, S. M., Teo, C. Y., Lo, E., and Wong, V. W. (1995). Cloning and complete sequence of the DNA polymerase-encoding gene (Bstpoll) and characterisation of the Klenow-like fragment from Bacillus stearothermophilus. Gene 163 (1), 65−68.
  86. Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., and Armes, N. A. (2006). DNA detection using recombination proteins. PLoS Biol 4 (7), e204.
  87. Prakash, S, Johnson, R. E., and Prakash, L. (2005). EUKARYOTIC TRANSLESION SYNTHESIS DNA POLYMERASES: Specificity of Structure and Function. Annual Review of Biochemistry 74 (1), 317−353.
  88. Radding, C. M., Josse, J., and Romberg, A. (1962). Enzymatic Synthesis of Deoxyribonucleic Acid. Journal of Biological Chemistry 237 (9), 2869−2876.
  89. Raghunathan, S., Ricard, C. S., Lohman, T. M., and Waksman, G. (1997). Crystal structure of the homo-tetrameric DNA binding domain of Escherichia coli single-stranded
  90. DNA-binding protein determined by multiwavelength x-ray diffraction on the selenomethionyl protein at 2.9-A resolution. Proc Natl Acad Sci U S A 94 (13), 66 526 657.
  91. Ramadan, K., Shevelev, I. V., Maga, G., and Hubscher, U. (2004). De novo DNA synthesis by human DNA polymerase lambda, DNA polymerase mu and terminal deoxyribonucleotidyl transferase. JMol Biol 339 (2), 395−404.
  92. Rap ley, R. (1994). Enhancing PCR amplification and sequencing using DNA-binding proteins. Mol Biotechnol 2 (3), 295−298.
  93. Rigler, M. N., and Romano, L. J. (1995). Differences in the mechanism of stimulation of T7 DNA polymerase by two binding modes of Escherichia coli single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem 270 (15), 8910−8919.
  94. D. H., Lacks, S., Marinus, M. G., Miyahara, M., Morgan, R. D., Murray, N. E., Nagaraja, V., Piekarowicz, A., Pingoud, A., Raleigh, E., Rao, D. N., Reich, N., Repin, V. E., Selker,
  95. Robinson, M., Lilley, R., Little, S., Emtage, J. S., Yarranton, G., Stephens, P., Millican, A., Eaton, M., and Humphreys, G. (1984). Codon usage can affect efficiency of translation of genes in Escherichia coli. Nucleic Acids Res 12 (17), 6663−6671.
  96. Samuelson, J. C., Zhu, Z., and Xu, S. Y. (2004). The isolation of strand-specific nicking endonucleases from a randomized Sapl expression library. Nucleic Acids Res 32 (12), 3661−3671.
  97. Sancar, A., Williams, K. R., Chase, J. W., and Rupp, W. D. (1981). Sequences of the ssbgene and protein. Proc Natl Acad Sei USA 78 (7), 4274−4278.
  98. Sandhu, D. K., and Keohavong, P. (1994). Effects of the T4 bacteriophage gene 32 product on the efficiency and fidelity of DNA amplification using T4 DNA polymerase. Gene 144 (1), 53−58.
  99. Schachman, H. K., Adler, J., Radding, C. M" Lehman, I. R., and Kornberg, A. (1960). Enzymatic Synthesis of Deoxyribonucleic Acid. Journal of Biological Chemistry 235 (11), 3242−3249.
  100. Schlotterer, C., and Tautz, D. (1992). Slippage synthesis of simple sequence DNA. Nucleic Acids Res 20 (2), 211−215.
  101. Schwarz, K., Hansen-Hagge, T., and Bartram, C. (1990). Improved yields of long PCR products using gene 32 protein. Nucleic Acids Res 18 (4), 1079.
  102. , Y. (2001). Single-stranded DNA-binding Proteins. In «eLS». John Wiley & Sons, Ltd.
  103. Shamoo, Y., Adari, H., Konigsberg, W. H., Williams, K. R., and Chase, J. W. (1986). Cloning of T4 gene 32 and expression of the wild-type protein under lambda promoter PL regulation in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sei USA 83 (23), 8844−8848.
  104. Shamoo, Y., Friedman, A. M., Parsons, M. R., Konigsberg, W. H., and Steitz, T. A. (1995). Crystal structure of a replication fork single-stranded DNA binding protein (T4 gp32) complexed to DNA. Nature 376 (6538), 362−366.
  105. Shortle, D., Koshland, D" Weinstock, G. M., and Botstein, D. (1980). Segment-directed mutagenesis: construction in vitro of point mutations limited to a small predetermined region of a circular DNA molecule. Proc Natl Acad Sei USA 77 (9), 5375−5379.
  106. Sigal, N., Delius, H., Kornberg, T., Gefter, M. L., and Alberts, B. (1972). A DNA-unwinding protein isolated from Escherichia coli: its interaction with DNA and with DNA polymerases. Proc Natl Acad Sei USA 69 (12), 3537−3541.
  107. Spargo, C. A, Fraiser, M. S., Van Cleve, M., Wright, D. J., Nycz, C. M., Spears, P. A., and Walker, G. T. (1996). Detection of M. tuberculosis DNA using thermophilic strand displacement amplification. Mol Cell Probes 10 (4), 247−256.
  108. Stankevicius, K., Lubys, A., Timinskas, A., Vaitkevicius, D., and Janulaitis, A. (1998). Cloning and analysis of the four genes coding for BpulOI restriction—modification enzymes. Nucleic Acids Research 26 (4), 1084−1091.
  109. Sumper, M., and Luce, R. (1975). Evidence for de novo production of self-replicating andenvironmentally adapted RNA structures by bacteriophage Qbeta replicase. Proc Natl Acad Sei USA 72 (1), 162−166.
  110. Tan, E., Erwin, B., Dames, S., Voelkerding, K., and Niemz, A. (2007). Isothermal DNA amplification with gold nanosphere-based visual colorimetric readout for herpes simplex virus detection. Clin Chem 53 (11), 2017−2020.
  111. Tebbe, C. C., and Vahjen, W. (1993). Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast. Appl Environ Microbiol 59 (8), 2657−2665.
  112. Tuntiwechapikul, W., and Salazar, M. (2002). Mechanism of in vitro expansion of long DNA repeats: effect of temperature, repeat length, repeat sequence, and DNA polymerases. Biochemistry 41 (3), 854−860.
  113. Van Ness, J., Van Ness, L. K., and Galas, D. J. (2003). Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences 100 (8), 4504−4509.
  114. Viguera, E., Canceill, D., and Ehrlich, S. D. (2001). In vitro replication slippage by DNA polymerases from thermophilic organisms. J Mol Biol 312 (2), 323−333.
  115. Villalva, C" Touriol, C., Seurat, P., Trempat, P., Delsol, G., and Brousset, P. (2001). Increased yield of PCR products by addition of T4 gene 32 protein to the SMART PCR cDNA synthesis system. Biotechniques 31 (1), 81−83, 86.
  116. Vincent, M., Xu, Y., and Kong, H. (2004). Helicase-dependent isothermal DNA amplification. EMBO Rep 5 (8), 795−800.
  117. Walker, G. T, Fraiser, M. S., Schram, J. L., Little, M. C., Nadeau, J. G, and Malinowski, D. P. (1992). Strand displacement amplification—an isothermal, in vitro DNA amplification technique. Nucleic Acids Research 20 (7), 1691−1696.
  118. Wang, L., Hall, J. G., Lu, M., Liu, Q., and Smith, L. M. (2001). A DNA computing readout operation based on structure-specific cleavage. Nat Biotechnol 19 (11), 10 531 059.
  119. Wells, R. D., Dere, R., Hebert, M. L., Napierala, M., and Son, L. S. (2005). Advances in mechanisms of genetic instability related to hereditary neurological diseases. Nucleic
  120. Acids Res 33 (12), 3785−3798.
  121. Williams, K. R., and Konigsberg, W. (1978). Structural changes in the T4 gene 32 protein induced by DNA polynucleotides. J Biol Chem 253 (7), 2463−2470.
  122. Williams, K. R., LoPresti, M. B., Setoguchi, M., and Konigsberg, W. H. (1980). Amino acid sequence of the T4 DNA helix-destabilizing protein. Proc Natl Acad Sei U S All (8), 4614−4617.
  123. Xia, Y. N., Morgan, R., Schildkraut, I., and Van Etten, J. L. (1988). A site-specific single strand endonuclease activity induced by NYs-1 virus infection of a Chlorella-like green alga. Nucleic Acids Res 16 (20), 9477−9487.
  124. Xiao, M., Phong, A., Ha, C., Chan, T. F., Cai, D., Leung, L., Wan, E., Kistler, A. L., DeRisi, J. L., Selvin, P. R., and Kwok, P. Y. (2007). Rapid DNA mapping by fluorescent single molecule detection. Nucleic Acids Res 35 (3), el6.
  125. Yang, J., Zhang, Z., Zhang, X. A., and Luo, Q. (2010). A ligation-independent cloning method using nicking DNA endonuclease. Biotechniques 49 (5), 817−821.
  126. Zhang, D. Y., Zhang, W., Li, X., and Konomi, Y. (2001). Detection of rare DNA targets by isothermal ramification amplification. Gene 274 (1−2), 209−216.
  127. Zhang, W., Cohenford, M., Lentrichia, B., Isenberg, H. D., Simson, E., Li, H., Yi, J., and Zhang, D. Y. (2002a). Detection of Chlamydia trachomatis by isothermal ramification amplification method: a feasibility study. J Clin Microbiol 40 (1), 128−132.
  128. Zhang, X., Yan, H., Shen, Z., and Seeman, N. C. (2002b). Paranemic cohesion of topologically-closed DNA molecules. J Am Chem Soc 124 (44), 12 940−12 941.
  129. Zhu, Z., Samuelson, J. C., Zhou, J., Dore, A., and Xu, S. Y. (2004). Engineering strand-specific DNA nicking enzymes from the type IIS restriction endonucleases Bsal, BsmBI, and BsmAI. J Mol Biol 337 (3), 573−583.1. БЛАГОДАРНОСТИ
  130. Я благодарна своим научным руководителям Людмиле Алексеевне Железной и Николаю Ивановичу Матвиенко за идеи и вдохновение, поддержку и неоценимую помощь в течение многих лет работы, за создание атмосферы сотрудничества среди коллег.
  131. Хотелось бы поблагодарить коллектив Лаборатории кристаллофизики ИТЭБ и, особенно, коллег из Лаборатории молекулярной генетики ИБ за готовность прийти на помощь словом и делом.
  132. Я выражаю глубокую личную благодарность Ильясовой Елене Николаевне, председателю профкома ИТЭБ, за неравнодушие и помощь в выживании в условиях постаспирантуры.
  133. Я искренне признательна родным и друзьям за переживание и моральную поддержку.
  134. Хочу поблагодарить мою подругу к.б.н. Веру Холыневу и свекровь Софью Павловну за то, что подставляли мне свое верное плечо в трудную минту.
  135. Я бесконечно благодарна своему супругу Вадиму за любовь, терпение и поддержку моих начинаний.
Заполнить форму текущей работой

На отлично!