Разработка тест-систем для диагностики герпесвирусной инфекции кошек на основе иммунологических методов

1.1.

Актуальность темы

.

На сегодняшний день диагностика у кошек инфекционных заболеваний, проявляющихся респираторно-окулярным синдромом, чрезвычайно важна. Трудно оценить экономический ущерб, наносимый этой группой заболеваний питомникам породистых кошек и владельцам животных, но не подлежит сомнению тот факт, что только наличие племенного ядра, свободного от респираторно-глазных инфекционных заболеваний позволяет получать здоровых котят, вести племенную работу, и, в конечном итоге, развивать зооиндустрию мелких домашних животных. Кроме того, домашняя кошка, средой обитания которой является жилище человека, непосредственно и постоянно контактирует с ним, что заставляет нас заботиться о ее здоровье не только из соображений гуманности и любви к животным, но и ради гигиены и сохранения здоровья человека.

Респираторно-окулярный синдром у кошек вызывают различные патогенные микроорганизмы, такие как герпес и калицивирусы, хламидии, микоплазмы. Но именно герпесвирусная инфекция кошек представляет наиболее серьезную проблему для фелинологов и ветеринарных врачей по причине ее повсеместной распространенности, высокой вирулентности, тяжелых окулярных поражений, установления пожизненного носительства с эпизодами периодического выделения активного вируса после переболевания этой инфекцией и относительно слабой эффективности средств активной и пассивной иммунизации.

Сегодня для диагностики герпесвирусной инфекции кошек, российская ветеринарная практика имеет в своем распоряжении метод выделения вируса (ВВ) на культуре клеток и полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Метод ВВ, являясь классическим, надежным, специфическим и достаточно чувствительным диагностическим методом, в силу своей длительности (до 10 дней), высокой трудоемкости, сложности и дороговизны используется, в основном, лишь в научно — экспериментальных работах. Метод ПЦР, хотя и обладает высокой чувствительностью и специфичностью, не может являться экспресс-методом, так как сложен в постановке, требует дорогостоящего оборудования и его результаты трудно интерпретировать с точки зрения клинической значимости.

Метод определения антигенов и антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) позволяет быстро получать результаты, не требует дорогостоящего оборудования или особых условий для работы и стерильности. ИФА позволяет определять уровень антител как в сыворотке крови, так и во внутриглазной, спинномозговой жидкостях и в молоке, что необходимо при проведении любых научных и научно-практических исследований. С помощью ИФА можно проводить контроль эффективности вакцин и иммунных сывороток, определять напряженность иммунитета, что позволяет оценить степень защиты животных от заражения и заболевания. Метод также чрезвычайно удобен для выявления вирусного антигена в смывах и соскобах со слизистой оболочки глаз, ротовой и носовой полостей.

Высокая разрешающая способность этого метода обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих наблюдаемый эффект. Таким образом, очистка и концентрирование вирусов является решающим условием при изготовлении диагностикумов и получении высокоактивных иммунных сывороток, используемых при создании компонентов, необходимых для проведения иммуноферментного анализа.

Для получения антивидовых иммуноглобулинов животных, меченых пероксидазой из хрена (ПХ), необходимо наличие чистых препаратов иммуноглобулинов в, М и, А классов.

Методы выделения иммуноглобулинов из сыворотки человека разработаны детально, но применительно к иммуноглобулинам животных они не всегда эффективны. Использование многих иммунологических методов для решения прикладных задач в области ветеринарии сдерживается отсутствием коммерческих моноспецифических антисывороток. Идеальным условием получения моноспецифических антисывороток представляется иммунизация продуцентов чистыми антигенами.

Ключевым моментом в отработке твердофазного непрямого ИФА является получение коньюгата, то есть иммуноглобулина меченого пероксидазой. Качество получаемого коньюгата находится в прямой зависимости от серологической активности иммуноглобулина, активности фермента и условий связывания этих компонентов.

Реакция иммунофлуоресценции, была предложена Кунсом в 1942 году, и ее трудно отнести к новым методам исследования. Однако, эта реакция получила в настоящее время «вторую жизнь» благодаря появлению гибридомных технологий, позволяющих получать моноклональные антитела. Их применение позволило значительно увеличить ее чувствительность и специфичность.

Популярность РИФ объясняется экономичностью, наличием широкого спектра диагностических наборов, быстротой получения ответа. Чаще всего РИФ используют для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом материале. РИФ является чрезвычайно ценным методом диагностики, его можно по праву отнести к экспресс-методам, поскольку он позволяет получить результат в течение 1−1,5 часов с момента взятия образца на анализ, прост в исполнении, не требует стерильной работы.

Таким образом, существуют все предпосылки для расширения спектра методов диагностики герпесвирусной инфекции кошек, поскольку быстрый и точный диагноз является решающим условием организации необходимых мер борьбы с этим заболеванием.

1.2. Цели и задачи исследования.

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлось создание диагностикумов на основе очищенного и концентрированного вируса ГВК-1, штамм «Гранд», для использования его в качестве компонента наборов при определении уровня антител и детекции антигенов вируса ГВК-1 в различных биологических субстанциях при иммуноферментной и люминисцентной диагностике герпесвирусной инфекции кошек.

Решались следующие задачи:

1.2.1. Разработать метод получения очищенного и концентрированного вируса ГВК-1, штамм «Гранд», репродуцированного в перевиваемой культуре клеток CrFK.

1.2.2. Получить иммуносорбенты на основе активированной BrCN Сефарозы 4 В с иммобилизованным в качестве анигена очищенным и концентрированным вирусом ГВК-1.

1.2.3. Выделить антитела к вирусу ГВК-1 из сыворотки естественно переболевших кошек методом аффинной хроматографии и получить пероксидазный и ФИТЦ-конъюгаты антител к антигенам ГВК-1.

1.2.4. Выделить IgG кошки, получить антисыворотку к IgG кошки на кроликах и получить пероксидазный и ФИТЦ-коньюгаты с анти-IgG кошки.

1.2.5. Разработать тест систему для определения уровня антител к вирусу ГВК-1 в сыворотке крови кошек в непрямм твердофазнм ИФА.

1.2.6. Разработать тест систему для детекции антигена ГВК-1 в смывах и соскобах с окулярного и респираторного тракта в прямом и непрямом твердофазном ИФА.

1.2.7. Разработать тест систему для определения антигенов вируса ГВК-1 в смывах и соскобах с окулярного и респираторного тракта в непрямой и прямой РИФ.

1.2.8. Провести сравнительную оценку эффективности детекции вируса в прямой и непрямой РИФ, прямом и непрямом твердофазном ИФА и методом вирусовыделения на культуре клеток.

1.2.9. Провести сравнительную оценку определения уровня антител к вирусу ГВК-1 в сыворотке крови кошек методами реакции нейтрализации на культуре клеток и непрямого твердофазного ИФА.

1.3. Научная новизна.

В результате проведенных исследований:

— испытаны различные методы очистки и концентрирования культурального вируса ГВК-1 штамм «Гранд», репродуцированного в перевиваемой культуре клеток СгИС и на их основе разработана схема получения очищенного и концентрированного вируса ГВК-1;

— разработана методика выделения кошки и усовершенствована схема иммунизации лабораторных животных, обеспечивающая получение высокоактивных специфических гипериммунных сывороток к кошки;

— разработана методика использования непрямой и прямой РИФ для определения антигенов вируса ГВК-1 в смывах и соскобах с окулярного и респираторного тракта;

— разработаны методики получения компонентов и отработаны условия постановки непрямого твердофазного ИФА для определения уровня антител к вирусу ГВК-1 в сыворотке крови кошек и твердофазного ИФА для определения антигенов ГВК-1 в смывах и соскобах с окулярного и респираторного тракта;

— установлена достоверная корреляция результатов, полученных при выявлении антител к вирусу ГВК-1 в сыворотке крови кошек в непрямом твердофазном ИФА и реакции нейтрализации и детекции вируса в прямой и непрямой РИФ, прямом и непрямом твердофазном ИФА и методом вирусовыделения на культуре клеток.

1.4. Практическая значимость работы.

Разработаны методики получения компонентов для иммуноферментных и люминесцентных тест-систем, предназначенных для диагностики герпесвирусной инфекции кошек. На основе проведенных исследований разработаны методические рекомендации по определению уровня антител к ГВК-1 и антигенов ГВК-1 в иммуноферментном и РИФ-анализах: «Методические рекомендации по лабораторной диагностике герпесвирусной инфекции кошек методом иммуноферментного анализа (ИФА)», «Методические рекомендации по серологической диагностике герпесвирусной инфекции кошек методом иммунофрментного анализа (ИФА)» и «Методические рекомендации по применению для диагностики герпесвируса кошек тип 1 (FHV-1) антиFHV-1 флюоресцирующих антител».

Разработанные методики определения уровня антител в РИФ и ИФА рекомендуется использовать для оценки напряженности иммунитета, определения материнских антител у котят с целью корректировки сроков первой вакцинации, а также в качестве методов контроля антигенной активности соответствующих монои поливалентных вакцин.

Полученные результаты являются основой для дальнейших исследований по изучению механизмов и закономерностей формирования постинфекционного и поствакцинального противовирусного иммунитета у кошек, а также дают возможность расширить научные знания относительно роли вирусов в возникновении массовых респираторных заболеваний кошек и могут быть использованы при дальнейшем изучении иммунологии и патогенеза инфекций, вызванных герпесвирусами.

1.5. На защиту выносятся следующие положения:

1.5.1. Схема очистки и концентрирования ГВК-1, штамм «Гранд», репродуцированного в культуре клеток СгРК.

1.5.2. Методика выделения кошки, получения анти-^в кошки на кроликах, и получения пероксидазного и ФИТЦ-коньюгатов с антикошки для использования последних в тест-системах индикации антигенов ГВК-1 и определения уровня анти-ГВК-1 антител.

1.5.3. Методика выделения анти-ГВК-1 анттел и получения пероксидазного и ФИТЦ-коньюгатов с анти-ГВК-1 анттелами.

1.5.4. Результаты выявления антгена вируса ГВК-1 в различных вариантах постановки РИФ и ИФА и антител к вирусу ГВК-1 в непрямом твердофазном ИФА.

1.5.5. Результаты полученные при выявления антител к вирусу ГВК-1 в своротке крови кошек в непрямом твердофазном ИФА и реакции нейтрализации и детекции вируса в прямой и непрямой РИФ, прямом и непрямом твердофазном ИФА и методом вирусовыделения на культуре клеток.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

6. ВЫВОДЫ.

6.1. Предложена схема комбинированной очистки и концентрирования герпесвируса кошек, штамм «Гранд», репродуцированного в культуре клеток СгБК, позволяющая получать препараты вируса, очищенные на 91% в расчете на инфекционную дозу, с титром инфекционности на 1,6−2,0 1§ ТЦД50/мл выше, чем в исходной суспензии.

6.2. Показана возможность одноэтапного препаративного выделения антигена ГВК-1 из вирусосодержащей суспензии с помощью препаративной аффинной хроматографии на анти-ГВК-1Сефарозе 4 В.

6.3. Усовершенствованы метод выделения из сыворотки крови кошек и схема получения сывороток антикошки на кроликах, позволяющая получать сыворотки с активностью в РДП 1:32 — 1:256.

6.4. Методом аффинной хроматографии с использованием иммуносорбента на основе активированной ВгСЫ Сефарозы 4 В с иммобилизованным в качестве антигена очищенным и концентрированным вирусом ГВК-1 выделены антитела к вирусу ГВК-1 из сыворотки естественно переболевших кошек и получены пероксидазный и ФИТЦ-конъюгаты с антителами анти-ГВК-1.

6.5. Разработаны тест-системы прямой и непрямой РИФ с использованием ФИТЦ-конъюгатов анти-ГВК-1 антител и антикв кошки. Методы позволяют определять вирус ГВК-1 в вирусосодержащих суспензиях и патологическом материале.

6.6. Разработана тест-система непрямого ИФА для выявления антител к вирусу ГВК-1 в сыворотке кошек с использованием в качестве антигена очищенного и концентрированного вируса ГВК-1.

6.7. Разработанная тест-система для выявления анти-ГВК-1 антител позволяет определять вирус ГВК-1 в вирусосодержащих суспензиях и патологическом материале методом ингибирования антигена в конкурентном твердофазном ИФА.

6.8. Разработан «сэндвич"-вариант ИФА с использованием коньюгата анти-ГВК-1 антител. Метод позволяет определять вирус ГВК-1 в вирусосодержащих суспензиях и патологическом материале, чувствительность тест-системы составила 2 ^ ТЦД 50/мл.

6.9. Установлено, что методы вирусовыделения, прямой и непрямой РИФ, ингибирования антигена в ИФА и «сэндвич"-ИФА пригодны для выявления ГВК-1 в острый период заболевания, но с точки зрения простоты, удобства постановки реакции, быстроты получения результата метод «сэндвич"-ИФА и прямая РИФ имеют преимущество перед другими методами.

6.10. ИФА является наиболее быстрым, удобным, и экономичным методом для определения анти-ГВК-1 антител, превосходит по чувствительности на 1−2 порядка реакцию нейтрализации (РН) и может быть рекомендован для выявления антиГВК-1 антител в низких титрах.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

В практику предложены иммуноферментная и люминиецентная тест-системы, предназначенные для диагностики герпесвирусной инфекции кошек. На основе проведенных исследований разработаны методические рекомендации по определению уровня антител к ГВК-1 и антигенов ГВК-1 в иммуноферментном и РИФ-анализах: «Методические рекомендации по лабораторной диагностике герпесвирусной инфекции кошек методом иммуноферментного анализа (ИФА)», «Методические рекомендации по серологической диагностике герпесвирусной инфекции кошек методом иммуноферментного анализа (ИФА)» и «Методические рекомендации по применению для диагностики герпесвируса кошек тип 1 (FHV-1) антиFHV-1 флюоресцирующих антител».

Разработанные методики определения уровня антител в РИФ и ИФА рекомендуется использовать для оценки напряженности иммунитета, определения материнских антител у котят с целью корректировки сроков первой вакцинации, а также в качестве методов контроля антигенной активности соответствующих монои поливалентных вакцин.

Полученные результаты являются основой для дальнейших исследований по изучению механизмов и закономерностей формирования постинфекционного и поствакцинального противовирусного иммунитета у кошек, а также дают возможность расширить научные знания относительно роли вирусов в возникновении массовых респираторных заболеваний кошек и могут быть использованы при дальнейшем изучении иммунологии и патогенеза инфекций, вызванных герпесвирусами.