Влияние ионов металлов на карбоангидразоподобную активность внешних водорастворимых белков PsbP и PsbQ фотосистемы 2

Министерство образования и науки Российской Федерации Тульский государственный университет Кафедра БИОЛОГИИ бакалаврская работа Направление 06.03.01

Биохимия Влияние ионов металлов на карбоангидразоподобную активность внешних водорастворимых белков PsbP и PsbQ фотосистемы 2

I. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

II. ВВЕДЕНИЕ

III. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Фотосинтез

1.1 Роль фотосинтеза

1.2 Строение и функционирование фотосинтетического аппарата высших растений

1.3 Фотосистема 2

Важную роль в обеспечении стабильности Mn4CaO5 — кластера играет белок PsbO (марганец — стабилизирующий белок). В процесс образования кислорода также принимают участие: ион Ca2+; один или два иона Cl-. Предполагается, что в обеспечении этими ионами в процессе сборки водоокисляющего комплекса, а также в их сохранении в нормально функционирующей ФС-2 участвуют внешние водорастворимые белки ВОК PsbP и PsbQ.

2.Карбоангидразная активность фотосистемы 2

2.1 Карбоангидразная активность ФС-2 высших растений и её свойства

2.2 Носители карбоангидразной активности в ФС-2 высших растений

3. Роль ионов металлов в биохимических процессах высших растений

IV. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Выделение тилакоидов по методу Berthold, Babcock, Yocum, 1981 с модификациями Ford, Evans, 1983 (на основе оригинальной статьи)

2. Выделение частиц ФС-2 из тилакоидов по методу schiller и dau (2005 г)

3. Измерение концентрации хлорофилла

4.Измерение скорости фотосинтетического выделения кислорода

5. Измерение фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции хлорофилла

6. Получение и очистка белков PsbP и PsbQ

7. Приготовление диализных трубок

8. Электрофорез

9. Измерение концентрации белка

10. Измерение карбоангидрзной активности

V. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение и характеристика препаратов ФС-2

1.1 Определение концентрации хлорофилла

1.2 Измерение скорости выделения кислорода

1.3 Измерение флуоресценции ФС-2

1.4 Электрофорез

2. Получение и очистка белков РsbР и РsbQ

2.1 NaCl обработка

2.2 Диализ

2.3 Разделение белков методом ионнообменной хромотографии

2.4 Электрофорез

2.5 Определение концентрации белка по методу Брэдфорд

2.6 Измерение карбоангидразоподобной активности белков PsbP и PsbQ

VI. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

VII. ВЫВОДЫ

VIII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

I. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АТФаденозинтрифосфат БКбикарбонат ВОК — водоокисляющий комплекс КАкарбоангидраза (ы) КА-активность— карбоангидразная активность КП-активностькарбоангидразоподобная активность НАДФникотинамидадениндинуклеотидфосфат П680- первичный донор электрона в фотосистеме 2

ПААГполиакриламидный гель РЦреакционный центр ССК2- основной светособирающий комплекс переферической антенны фотосистемы 2

Феофеофитин ФС-1- фотосистема 1

ФС-2- фотосистема 2

Хлхлорофилл ЭДТАэтилендиаминтетраацетат ЭТЦэлектрон-транспортная цепь

BBYфрагменты тилакоидных мембран, обогащённые фотосистемой 2 (выделенные согласно (Berthold et al., 1981))

CР43 — белок антенны ядерного комплекса ФС2

CР47 — белок антенны ядерного комплекса ФС2

D1 — интегральный белок РЦ ФС2

D2 — интегральный белок РЦ ФС2

DCBQ- 2,6-дихлор-п-бензохинон

HСО3_ - ион бикарбоната;

MES — (N-морфолино)этансульфоновая кислота

Mn4CaO5-кластер — неорганическое ядро ВОК ФС2

PsbP и PsbQводорастворимые белки ВОК ФС2высших растений и зеленых водорослей с молекулярными массами 23 кДа и 17 кДа, соответственно

Tris-2-амино-2-гидроксиметил-пропан-1,3-диол

QA — первичный хиноновый акцептор электрона в ФС2

QB — вторичный хиноновый акцептор электрона в ФС

II .

ВВЕДЕНИЕ

Фотосинтез — процесс образования богатых энергией органических веществ из веществ энергетически бедных — углекислого газа и воды. Углекислый газ, поступающий в клетку из окружающей среды, электроны в виде НАДФН и энергия в виде АТФ, поступающие из цепи переноса электронов, ассоциированной с тилакоидной мембраной обеспечивают синтез углеводов. В состав тилакоидной мембраны входят три белковых комплекса — фотосистема 1, фотосистема 2 и цитохромный b6f комплекс.

Благодаря фотосинтезу стала возможной жизнь на поверхности нашей планеты. Кроме того, результатом деятельности фотосинтезирующих организмов являются запасы топлива, к сожалению, исчерпаемые. Однако, знание механизмов этого процесса поможет обрести человечеству источник неиссякаемой экологически чистой энергии. Например, знание механизма фотосинтетического расщепления воды позволит получать водород как топливо практически в неограниченном количестве.

Фотосинтетическое окисление воды происходит в ФС-2 в неорганическом ядре, состоящем из ионов Ca и Mn, стабилизированном тремя внешними водорастворимыми белками: PsbO, PsbP, PsbQ. Выяснено, что для стабилизации и функционирования ВОК также необходимы ионы бикарбоната (БК). Для поддержания необходимого уровня бикарбонатов ФС-2 может быть необходим специальный фермент — карбоангидраза, катализирующий обратимую гидратацию углекислого газа. Присутствие КА показано для всех четырех царств живой природы: бактерий, животных, грибов, растений. В последние десятилетия, после того как стало известно, что работа ФС-2 зависит от содержания БК, интерес к изучению КА активности резко возрос.

Известно, что тилакоиды имеют как минимум два источника КА активности в ФС-2. Один из источников — Mn-стабилизирующий белок PsbO (молекулярная масса 33 кДа), другой источник — ассоциирован с ФС-2, который можно выявить путём отмывки белка PsbO 1 М раствором CaCl2. В ходе экспериментов было установлено, что источники КА активности зависят от присутствия ионов металлов Ca2+, Mn2+. Возник интерес действию других металлов на КА активность, например, входящих в КА или имеющих сходный радиус с теми металлами, для которых уже показана активность, либо установить действие тяжелых металлов. Выяснение механизма действия ионов тяжелых металлов на ФС-2 является актуальной проблемой, важной для развития сельского хозяйства и фундаментальных представлений о механизме функционирования ФС-2. Так как, по имеющимся в настоящий момент данным, ионы металлов могут влиять на КП-активность белков ВОК ФС-2, необходимо изучить этот вопрос более детально. Поэтому целью нашей работы явилось изучение влияния ионов металлов на карбоангидразоподобную активность внешних водорастворимых белков PsbP и PsbQ фотосистемы 2. Для достижения данной цели мы выделили несколько задач:

1) Выделить фотохимически активные фрагменты тилакоидных мембран хлоропластов, обогащенных ФС-2 из листьев гороха (PisumsativumL. cv. Moscowski 559);

2) Выделить из них белки водоокисляющего комплекса — PsbPи PsbQ;

3) Установить влияние ионов двухвалентных металлов на карбоангидразоподобную активность белков PsbPи PsbQ;

III.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Фотосинтез

1.1 Роль фотосинтеза Фотосинтез — это окислительно-восстановительный процесс, протекающий в несколько этапов, в котором происходит восстановление диоксида углерода до углеводов и окисление воды до кислорода. (http://fizrast.ru/fotosintez/etapy.html)

Результатом возникновения фотосинтеза в процессе эволюции являетсявеликое множество различных представителей живого мира на Земле. Нефть, газ и уголь — это биотопливо, накопившееся в результате захвата и преобразования солнечной энергии фотосинтезирующими организмами. В настоящее время фотосинтезможет помочь человечеству обрести источник неиссякаемой экологически чистой энергии. Так как процесс расщепления воды может дать практически неограниченное количество водорода.

Более трех миллиардов лет назад первые фотосинтезирующие организмы (фотосинтезирующие бактерии) приобрели способность эффективно захватывать и преобразовывать солнечную энергию для синтеза органических молекул в процессе аноксигенного фотосинтеза. Ископаемые животные организмы и растительные остатки, найденные в земной коре, Следующим этапом эволюции фотосинтеза является появление оксигенного фотосинтеза. Этот процесс осуществлялся у первых цианобактерий и сопровождался выделением молекулярного кислорода. Накопление кислорода в атмосфере благодаря широкому распространению цианобактерий привело к первой экологической катастрофе на планете — возникновение аэробной атмосферы. Это позволило предкам современных живых организмов существовать на суше. а также нынешнее разнообразие живых организмов дают представление о значимости фотосинтеза. Ведь именно этот процесс привел к взрыву биологической активности на Земле, позволив жизни процветать и значительно изменяться.

1.2 Строение и функционирование фотосинтетического аппарата высших растений Основным органом, где протекает фотосинтез в высших растениях является лист, а органоидами — хлоропласты. Внутри хлоропластов располагаются тилакоиды и в их мембранах находятся фотосинтетические пигменты, улавливающие кванты света. В молекуле хлорофилла — основного фотосинтетического пигмента (рис. 1) -выделяют порфириновую «головку» с атомом магния в центре и фитольный «хвост». Порфириновая «головка» представляет собой плоскую структуру, является гидрофильной, поэтому обращена к водной среде стромы. За счет своей гидрофобности фитольный «хвост» удерживает молекулу хлорофилла в мембране тилакоидов.

Рис. 1. Строение молекулы хлорофилла;

Хлорофилл a: R1= CH3, R2= С2Н5 ,

Хлорофилл b: R1= CH3, R2 = CH=CH2

Хлорофиллd: R1 = СООСН3, R2= CH=CH2

Растения имеют характерную зелёную окраску из-за того, что хлорофиллы отражают зеленый, а поглощают красный и сине-фиолетовый свет. Молекулы хлорофилла в мембранах входят в состав пигмент-белково-липидных комплексов, названных фотосистемами. У растений и сине — зеленых водорослей имеются ФС-1 и ФС-2, у фотосинтезирующих бактерий — ФС-1. Только ФС-2 имеет способность отбирать электроны у воды.

Световая фаза фотосинтеза осуществляется при участии двух фотосистем — ФС-1 и ФС-2, содержащих пигменты и различные белки. Они вместе с цитохромным комплексом являются основными компонентами фотосинтетической цепи переноса электронов. Электрон-транспортная цепь организована в мембране в виде трансмембранных белковых комплексов (ФС-1, ФС-2 и цитохромный b6f комплекс) и подвижных переносчиков электрона (пластоцианин, ферредоксин и пул пластохинонов). (http://fizrast.ru/fotosintez/etapy.html). Эти комплексы фотосинтетического аппарата гетерогенно распределены в мембране тилакоидов (рис.2). (В. Н. Гольцев, 2014)

Рис. 2. Схематическое изображение белковых комплексов, включённых в реакции фотоиндуцированного переноса электронов и протонов в тилакоидной мембране фотосинтетических оксигенных организмов.

Рис. 3. Z-схема фотосинтеза

Z-схема, или схема нециклического транспорта электронов, получила свое название из-за сходства с буквой Z. Её принцип впервые был предложен в 1960 г. Р. Хиллом и Ф. Бендаллом и в 1961 г. был подтвержден работами Л. Дюйзенса.

Конечным этапом световых стадий фотосинтеза является восстановление NADP+, которое осуществляет ФС-1. При возбуждении П700 в реакционном центре ФС-1 энергией, эквивалентной 1 кванту длинноволнового красного света, электрон захватывается мономерной формой хлорофилла a (A1; акцептор электрона) и затем последовательно передается переносчикам электронов А2 и Ав (железосерные белки FeS), ферредоксину (водорастворимый FeS-белок) и ферредоксин — NADP-оксидоредуктазе с FAD в качестве кофактора. Наконец, редуктаза восстанавливает NADP+. Именно в ФС-2 происходит фотоиндуцированное окисление воды. П700 является сильным окислителем. Донором электронов для него является ФС-2. Электроны от ФС-2 переходят на ФС-1 посредствам мобильных переносчиков и цитохромом b6f-комплексов.Исходным донором электронов для ФС-2 является вода. Энергия, освобождающаяся при движении электронов от П680 до П700, используется для синтеза АТФ из AДФ и неорганического фосфата (фотофосфорилирование). (Холл Д., Рао К., 1983)

Фотохимический реакционный центр ФС-2П680 поглощает энергию, эквивалентную 1 кванту коротковолнового красного света, и переходит в синглетное возбужденное состояние, отдает электрон феофетину (Фео). От Фео электроны, теряя энергию, последовательно передаются на пластохиноны — QA и QB, в пул липидорастворимых молекул пластохинона (PQ), переносящих через липидную фазу мембраны электроны и протоны в цитохромный b6f комплекс, который затем восстанавливает Cu-содержащий белок пластоцианин (Пц). Электроны с Пц переходят на вакантное место в П700.

Вакантное место («дырка») в П680 заполняется двумя электроном из содержащего Мn — неорганического ядра водоокисляющего комплекса. Этот комплекс связывает воду и восстанавливается за счет её электронов. Для осуществления этой реакции в белковом комплексе необходимы Мn и С1-, а также Са2+. Таким образом, основным источником электронов для восстановления NADP+ является вода, разложение которой происходит в ФС-2.

1.3 Фотосистема 2

ФС-2 (Рис. 4) содержит более 20 различных белков и пигмент-белковых комплексов, ее состав зависит от условий окружающей среды. Полипептиды ФС-2 выполняют ряд важных функций: часть поглощают энергию света и передают энергию возбуждения, участвуют в разделении зарядов и окислении воды, стабилизируют структуру димеров ФС-2, участвуют в сборке мономера и образовании димера, связывают и ориентируют молекулы хлорофилла, а и b, а также каротиноиды. В ФС-2 условно выделяют части, выполняющих разные функции: 1) реакционный центр, 2) светособирающий комплекс, 3) водоокисляющий комплекс.

Рис. 4. Схематическое изображение фотосистемы 2 в тилакоидной мембране. D1 иD2 белкиреакционногоцентра (РЦ). (Mn) — марганцевый кластер, участвующийв фотоокислении воды; P680 (П680) — специальная пара молекул хлорофилла реакционного центра; Phe (Фео) — феофитин; QA — связанный пластохинон; QB — пластохинон, подвижный переносчик электронов;Tyr — аминокислотный остаток тирозина-161 белка D1 (Yz); PQ — пул подвижных молекул пластохинона. Антенные комплексы: LHC-II (ССК-2) — периферийный светособирающий комплекс ФС-2; CP47 и CP43- хлорофилл-белковые комплексы внутренней антенны, имеющие соответственно молекулярные массы 47 и 43 кДа.

1.3.1 Реакционный центр

Реакционный центр обеспечивает фотосинтетическое разделениезарядов — первый этап преобразования солнечной энергии в энергию химических связей. Он содержит интегральные белки D1 (PsbA) и D2 (PsbD), каждый из которых образован пятью трансмембранными б-спиралями, расположенными в мембране пррактически параллельно друг другу (Barberetal., 1987). В состав РЦ ФС-2 также входит третий интегральный белок — цитохром b559, количество молекул которого на один РЦ точно не установлено (предполагается 1−2 молекулы).

На белках D1 и D2 расположены кофакторы переноса электрона в ФС-2 — фотоактивная А-цепь: TyrZ, П680, ChlD1, PheoD1, QA и QB. Энергия света, поглощенная пигментами светособирающего комплекса ФС-2, переносится к первичному донору электрона P680 — специализированному димеру хлорофиллов, а (Renger, 1992).Разделение зарядов в реакционном центре происходит за счет перехода молекулы P680 В возбужденное синглетное состояние, за счет энергии поглощенного кванта света. В первой стадии разделения зарядов принимает участие молекула хлорофилла a (ChlD1), которая располагается между П680 и PheoD1 (рис. 5.). Энергия возбуждения возможно делокализуется между четырьмя молекулами хлорофилла (специальная пара PD1PD2 и вспомогательными ChlD1 и ChlD2). (Barber, 2002)

Рис. 5. Схема расположения кофакторов переноса электрона в ФС-2 (Guskovetal., 2009). Красные стрелки — этапы переноса электронов с указанием времени переноса электрона. Голубые — возможные пути переноса электрона (Muh et al., 2012).

РЦ входит в состав более крупного белкового комплекса, называемого «ядерным» В его состав у высших растений, кроме белков D1, D2, цитохром b-559 входят белкиCP43, CP47, PsbO; могут входить белки PsbP, PsbQ.

Структура ядерного комплекса высших растений крайне близка к структуре цианобактерий: для цианобактерии Thermosynechococcus elongatus показано наличие 35 молекул хлорофилла а, 2 молекул феофитина, 3-х пластохинонов и 12 в-каротинов в расчёте на один мономер, а также марганцевого кластера и других кофакторов. Для «ядерных» комплексов из высших растений (шпината) показано наличие от 35 до 80 молекул хлорофилла, одной молекулы QA и марганцевого кластера в расчете на один РЦ.

1.3.2 Светособирающий комплекс (ССК)

Светособирающий комплекс необходим для эффекктивного улавливания квантов света с большой площади и направленной передачи энергии света в виде энергии возбужденного состояния хлорофилла в реакционный центр ФС-2. Белки ССК выполняют следующие функции:

— определяют специфичное связывание, ориентацию и распределение молекул пигментов;

— служат посредниками во взаимодействии с другими белковыми компонентами в структурной организации антенных систем, обеспечивая перенос энергии возбуждения и регуляцию этого процесса

ССК условно разделяют на внешнюю и внутреннюю антенны.

Внутреннюю антенну ФС-2 составляют два белка — CP43 и CP47, которые расположены по обе стороны от D1 и D2 (белков РЦ ФС-2). СР43 (с ним скоординировано 13 молекул хлорофилла) находится со стороны белка D1, а СР47 (содержит 16 молекул хлорофилла) — со стороны белка D2. К внутренней антенне акже относят белки CP29, CP26, CP24. Внешняя антенна представленна белками ССК-2 разного состава.

Эти комплексы формируют внешнюю антенну с высоким соотношением пигмент: белок. Регулирование светособирающей функции происходит за счёт обратимого, находящегося под окислительно-восстановительным контролем фосфорилирования белков ССК-2 (Lhcb1 и Lhcb2), и происходящая в результате латеральная миграция ССК-2 от ФС-2 к фотосистеме 1 (ФС-1) приводит к перераспределению энергии возбуждения между ФС-2 и ФС-1. (Шитов, 2013)

1.3.3 Водоокисляющий комплекс (ВОК)

Для окисления воды в растениях и цианобактериях требуются мембранные белки РЦ и внутренней антенны: СР47, СР43, D1, D2, б и в субъединицы цитохрома b-559. Фотоокисление воды происходит в части ФС-2, обращенной в просвет тилакоида.

В активном центре водоокисляющий комплекс содержит четыре иона марганца и один ион кальция, которыесвязаны между собой при помощи м-оксо мостиков (Mn4CaO5-кластер), активный в окислительно-восстановительном отношении тирозин-161 (TyrZ) и другие аминокислотные остатки, которые вместе функционируют как каркас. Mn4CaO5 — кластер ФС-2 высших растений окружён полипептидными цепями интегральных белков РЦ и периферических белков водоокисляющего комплекса (PsbO, PsbP, PsbQ). Эти полипептидные цепи стабилизируют структуру Mn4CaO5-кластера, создавая условия для фотоокисления воды. Для образования одной молекулы кислорода требуется две молекулы воды, дающие 4 электрона. Для полного разложения воды требуется 4 кванта света. В результате в люмен выходят четыре полученные протона. (Холл Д., Рао К., 1983)

2Н2О — 4е — 4Н+> О2^

Важную роль в обеспечении стабильности Mn4CaO5 — кластера играет белок PsbO (марганец — стабилизирующий белок). В процесс образования кислорода также принимают участие: ион Ca2+; один или два иона Cl-. Предполагается, что в обеспечении этими ионами в процессе сборки водоокисляющего комплекса, а также в их сохранении в нормально функционирующей ФС-2 участвут внешние водорастворимые белки ВОК PsbPи PsbQ.

2.Карбоангидразная активность фотосистемы 2

Кромеионов Mn2+, Са2+ иClважное значение для функционирования ФС-2 имеют ионы бикарбоната. В обеспечении ФС-2 ионами бикарбоната может быть нужен специальный фермент — карбоангидраза.

Карбоангидраза (карбонатгидролиаза, К.Ф.4.2.1.1.) — фермент, катализирующий обратимую гидратацию углекислого газа (СО2 + Н2О? Н2СО3? Н+ + НСО3), присутствует во всех живых организмах: растениях, животных, бактериях, грибах. Карбоангидразы делят на 6 основных классов — б, в, г, д, е и ж, представители которых имеют незначительные сходства в аминокислотных последовательностях. В одном организме могут находиться представители различных классов карбоангидраз (Moroney etal., 2001; Куприянова и Пронина, 2011). Карбоангидразы играют важную роль в фотосинтезе многих организмов, как цианобактерий, так водорослей и высших растений (Moroneyetal., 2011). В ФС-2 высших растений и некоторых одноклеточных водорослей обнаружена карбоангидразная активность.

2.1 Карбоангидразная активность ФС-2 высших растений и её свойства

Впервые наличие карбоангидразной активности было показано на листьях кукурузы в работе Алана Стемлера 1986 года. (Stemler, 1986). В 1999 году на горохе (как одном из представителей С3 растений) впервые было показано присутствие двух источников карбоангидразной активности в тилакоидах, один из которых ассоциирован с ФС-2 (Moskvinetal., 1999).

Возможные функции карбоангидразы (карбоангидраз) в фотосистеме 2:

1. Участие карбоангидразы в метаболизме углерода по механизму, предложенному ранее для микроводорослей (Пронина и Семененко, 1984; ProninaandBorodin, 1993; Пронина, 2000; Пронина с соавт., 2002).

2. Участие в преобразованиях H+ + HCO3 = H2O + CO2, которое может быть более важно для ФС-2, чем наличие СО2-концентрирующего насоса, как предполагалось в работе Парка с соавт. (Dai et al., 2001).

3. КА может обеспечивать накопление бикарбоната как компонента нативной ФС-2, или дегидрирование бикарбоната предотвращает опасное локальное увеличение концентрации протонов, особенно в условиях освещения высокой интенсивности (Villarejo et al., 2002;Moskvin et al., 2004). Было предположено, что для КА Cah3 из ФС-2 Chl. reinhardtiiКарбоангидраза может быть ответственна за снабжение ВОК бикарбонатом и/или за удаление излишка протонов, выделяемых в процессе выделения кислорода, особенно в условиях высокой интенсивности освещения, как это предложено (Villarejoetal., 2002; Rudenkoetal., 2007; Shutovaetal., 2008).

Несмотря на ассоциации КА-активности ФС-2, ее функции остаются не вполне ясными. В настоящее время не получен однозначный ответ на вопросы: нужна ли карбоангидразная активность для функционирования ФС-2 высших растений и что является источником этой активности .

2.2 Носители карбоангидразной активности в ФС-2 высших растений

Ранее предполагалось, что с мембранами ФС-2 ассоциировано два источника карбоангидразной активности, причём, один связан с периферическими белками (возможно с PsbO (Luetal., 2005; LuandStemler, 2007)) или с низкомолекулярными белками ФС-2 (Rudenkoetal., 2007; Ignatovaetal., 2011), а другим источником карбоангидразной активности является комплекс ФС-2, лишённый внешних водорастворимых белков (Daietal., 2001; Luetal., 2005; LuandStemler, 2007; McConnelletal., 2007) или «ядерный» комплекс (Khristinetal., 2004; Moskvinetal., 2004)

Позднее было установлено, что этот белок (PsbO) обладал КА-активностью только в присутствии Mn2+ и оптимальная концентрация иона для проявления активности составляла 1 мМ (Шитов с соавт. 2009). Кроме того, было установлено, что белки PsbPи PsbQ, как совместно, так и по отдельности обладали КА-активностью. Также было показано, что КА-активность внешних белков ВОК (PsbP, PsbOи PsbQ) не подавлялась ингибиторами карбоангидраз и поэтому активность обозначили как карбоангидразоподобную (КП-активность). Совместная КП-активность фракции белков PsbPи PsbQвозросла в 5 раз в присутствии 200 мкМ Mn2+(максимальный эффект Mn2+) и полностью подавлялась в присутствии ионов Zn2+, Ca2+, Mg2+ (Шитов с соавт.).

Было показано, что супернатант после CaCl2-обработки препаратов ФС-2 из гороха (содержащий белки PsbO, PsbP и PsbQ) также обладал карбоангидразной активностью. Авторы этой работы связывали наличие карбоангидразной активности в супернатанте только с присутствием PsbO, так как, по их мнению, нативные белки PsbP и PsbQ, полученные методами генной инженерии не обладают карбоангидразной активностью, как не обладают ей предшественники этих белков (Lu et al., 2005). Было установлено, что белок PsbO в присутствии Mn2+ обладает карбоангидразной активностью.

3. Роль ионов металлов в биохимических процессах высших растений

Ионы магния

Он входит в состав фотосинтетического пигмента — хлорофила и участвует в аккумуляции солнечной энергии в ходе фотосинтеза (Якушкина И.И., 2004). Также магний принимает участие в передвижении фосфора и в углеводном обмене, влияет на активность окислительно-восстановительных процессов.

При недостаточности магния снижается содержание хлорофилла в зеленых частях растений Поскольку хлорофилл поглощает солнечную энергию и с ее помощью углекислый газ и вода превращаются в сложные органические вещества: сахара, крахмал и др., само существование зеленых растений невозможно без магния. (Полевой В.В., 1989)

Ионы марганца Марганец, как и медь, играет важную роль в окислительно — восстановительных реакциях (он характеризуется высоким показателем окислительно-восстановительного потенциала), протекающих в растении. Он входит в состав ферментов, с помощью которых происходят данные процессы. Марганец непосредственно участвует в фотосинтезе, дыхании, в углеводном и белковом обменах. В растения марганец находится в разной степени окисления (Мn2+, Мn3+, Мn4+), но поступает в растение в виде ионов Мn2+. Среднее содержание данного элемента в растениях 0,001%.

Ионы марганца необходимы для нормального протекания фотосинтеза, так как входят в состав активного центра водоокисляющего комплекса ФС-2. Кроме того, марганец участвует в восстановлении С02, играет значимую роль в поддержании структуры хлоропластов. При недостатке марганца хлорофилл незамедлительно начинает разрушаться при освещениирастений. (Якушкина И.И., 2004)

Ионы кальция Кальций поступает в растение в течение всей его жизни в виде катионов Са2+ (Полевой В.В., 1989). Часть кальция находится в клеточном соке. Здесь он поддерживает определенное физиологическое равновесие ионов в клетке, главным образом нейтрализуя избыточно образующиеся органические кислоты; влияет на вязкость и проницаемость протоплазмы.(Малиновский В.И., 2004)

Помимо прочего кальций участвует в углеводном и белковом обмене растений, образовании и росте хлоропластов. От кальция в большей степени зависит построение нормальных клеточных оболочек. Кальций также как и марганец как входит в состав активного центра ВОК ФС-2.

Ионы цинка Поступает в растение в виде ионов Zn2+. Среднее содержание цинка в растениях 0,002%. В растениях цинк не участвует в окислительно-восстановительных реакциях, поскольку не обладает переменной валентностью. Он входит в состав более 30 ферментов, в т. ч. фосфатазы, карбоангидразы, алкогольдегидрогеназы, РНК-полимеразы и др. Кроме того, цинк участвует в синтезе аминокислоты триптофана, являющеся предшественником ростовых веществ (ауксинов) в растении. (Полевой В.В., 1989). Фермент КА важен для многих этапов процесса фотосинтеза. Например, углекислый газ, поступая в клетку, растворяется в воде, образуя Н2СO3: СO2 + Н2O<-> НСO3 + Н+. Фермент карбоангидраза, катализируя высвобождение С02 из гидрата окиси углерода, способствует его быстрой фиксации в цикле Кальвина-Бенсона. (Якушкина И.И., 2004)

Цинк благоприятен для процесса синтеза хлорофилла. Вызываемое недостатком цинка нарушение процессов синтеза хлорофилла приводит к появлению на листьях хлоротичных пятен светло-зеленого, желтого и даже почти белого цвета. Однако, избыток цинка токсичен для растения, связан недостатком меди, железа и редких случаях приводит к гибели растения. (Полевой В.В., 1989)

Ионы меди Медь является переходным и тяжелым металлом, для которого доказано токсическое действие. При взаимодействии с НАДФН-оксидазой он вызывает образование Н2О2. В митохондриях и хлоропластах ионы тяжёлых металлов могут являться акцептором при переносе электронов или неправильно направляют перенос электрона (в зависимости от окислительно-восстановительного статуса металла), что вызывает образование свободных радикалов. Кроме того, ионы тяжёлых металлов могут быть причиной мутаций. (ArunK. Shanker, 2008).

Ионы медь входят непосредственно в состав ряда ферментных систем. 75% ионов меди, содержащейся в листьях, сконцентрировано в хлоропластах. Также в хлоропластах находится маленький, водорастворимый, медьсодержащий белок синего цвета — пластоцианин (молекулярная масса около 10,5 кДа). В пластоцианине содержание меди составляет 0,57%. Медь обладает способностью к обратимому окислению и восстановлению (Сu2+ е —> Сu+), пластоцианин участвует в переносе электронов от ФС-2 к ФС-1. При дефиците меди снижается активность ФС-1. (Якушкина И.И., 2004)

Исследования последних лет свидетельствуют, что ингибирующее действие ионов тяжелых металлов на фотосинтетические функции растений обусловлено их взаимодействием с компонентами ФС-2.

IV. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Выделение тилакоидов по методу Berthold, Babcock, Yocum, 1981 с модификациями Ford, Evans, 1983 (на основе оригинальной статьи)

Листья растения обрываются от черешков и промываются дистиллированной водой. Далее они помещаются в гомогенизатор и заливаютсях средой, состоящей из раствора 0,4 М сахарозы (обеспечивающей изотоничность по отношению к внутреннему содержимому хлоропластов), Tris-HCl (pH 7.8) — обеспечивает постоянство pH при выделении, ЭДТА образует комплексы с ионами металлов, аскорбат натрия — восстановитель, нейтрализует эндогенные клеточные оксиданты. Гомогенат фильтруют и центрифугируют (1000−2000 оборотов в минуту на центрифуге К-70 в течении 3−4 минуты) для удаления разрушенных клеточных элементов и волокон фильтра.

Супернатант центрифугируют при 5500−6000 оборотов в минуту на центрифуге К-70 в течении 20 минут. На этом этапе в осадке получают интактные хлоропласты. Супернатант отбрасывают. Далее оболочку хлоропластов надо разорвать, поместив их в гипотоническую среду. Вода в этом случае будет поступать внутрь хлоропласта и разорвет его оболочку. Осадок хлоропластов ресуспендируют в гипотонической среде: 2 mMMES

(pH 6.3), 15 mMNaCl, 5 mMMgCl2.

Центрифугируют раствор при 5500−6000 оборотов в минуту на центрифуге К-70 в течении 20 минут. В осадке получают разрушенные хлоропласты. Супернатант отбрасывают. Ресуспендируем осадок кисточкой и затем в стеклянном гомогенизаторе в среде: 20 mM МES-NaOH (pH 6,3), 15 mMNaCl, 5 mMMgCl2, 0,33 M сахароза.

Доводим объем раствора тилакоидов до концентрации хлорофилла 2 мг/мл. Определяем концентрацию хлорофилла и функциональную активность ФС-2 в полученных тилакоидах.

2. Выделение частиц ФС-2 из тилакоидов по методу schiller и dau (2005 г)

Осаждают тилакоиды из раствора на центрифуге (6000g, 20 мин) и ресуспендируют в среде с бетаином (25 мМ HEPES (pH 6,0), 15 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 1 М глицин-бетаина) до концентрации ~ 2,2 мг/мл. Оставляют раствор тилакоидов в холодильнике в темноте на 1 ч.

Добавляют к суспензии тилакоидов (2 мг хл/мл) Тритон Х-100 к хлорофиллу 20:1(20мг Тритон Х-100/1 мг хлорофилла). Для того, чтобы не происходило образование локально высокой концентрации тритона, добавление раствора Тритона Х-100 производят по капле по стенке сосуда при перемешивании суспензии на магнитной мешалке.

Инкубируют раствор при 0 С в темноте на мешалке в течении 20 мин. Центрифугируют раствор на высокоскоростной центрифуге при 47 900 g в течении 22 мин. Супернатант, содержащий ФС-1 отбрасывают, а осадок ресуспендируют в среде с бетаином и повторяем центрифугирование при 47 900 g в течении 15 мин. Такой цикл проводят 4 раза. На этом этапе происходит отмывание препаратов ФС-2 от Тритона Х-100.

3. Измерение концентрации хлорофилла

Общее содержание хлорофиллов «a» и «b» определяли по методу (Arnon, 1949). К 0,05 мл исходной суспензии добавляли 0,95 мл воды и 4 мл 80%-ного ацетона, измеряли оптическую плотность вытяжки при 652 нм и рассчитывали содержание хлорофилла в исходном образце по формуле Схл (мг/мл) = (28,9. А652. L. K)/1000, где, А — оптическая плотность образца при 652 нм, L — длина оптического пути, K — коэффициент разбавления суспензии.

4.Измерение скорости фотосинтетического выделения кислорода

Скорость фотосинтетического выделения О2 измеряли амперометрическим методом с помощью электрода типа Кларка («Hansatech» Великобритания) в среде, содержавшей: 25 мМ MES-NaOH (pH 6,5), 10 мМ NaCl, 0.3 М сахарозу. Препараты освещали светом интенсивностью 1000 мкмолей фотонов/(м2· с1) (л?590 нм). Концентрация хлорофилла в ячейке во время измерений составляла 10 мкг/мл. Все измерения выполнялись при 25 °C в присутствии 0,3 мМ 2,6-дихлоро-р-бензохинона и 1 мМ феррицианида калия (K3[Fe (CN)6]) как акцепторов электронов.

5. Измерение фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции хлорофилла

Измерениякинетики фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции хлорофилла (Ф) с >660 нм (связанных с фотовосстановлением первичного акцептора электрона ФС-2, пластохинона QA) проводили с помощью прибора XE-PAMFluorometer фирмы «WALZ» (Германия) в 10 мм кювете при 20oС. Действующий свет, который получали пропусканием белого света через фильтр BG-39 («Schott», Германия), подавался через световод на кварцевую кювету, помещенную в специальную камеру ED-101US/M (Wals, Германия);Измерения осуществляли в среде, содержащей: 50 мМ MES (рН 6,5), 10 мМ NaCl. Концентрация частиц ФС-2 по хлорофиллу составляла 10мкг/мл.

6. Получениеи очистка белковPsbP и PsbQ

Для экстракции гидрофильных белков PsbQ (18 кДа) и PsbP (24 кДа) субмембранные препараты ФС-2 (конечная концентрация по хлорофиллу 0,5 мг/мл) обрабатывали 1 М NaCl в течение 30 минут при 4єC и комнатном освещении (MiyaoandMurata, 1983). Раствор белков, полученный после обработки обессаливали с помощью диализа против 20 мМ Tris-HCl-буфера, (рН 7,5), содержащего 10 мМ NaCl и 2 мМ ЭДТА.

Разделение смеси белков PsbQ и PsbP проводили с помощью ионообменной хроматографии с использованием системы ActaFPLC на колонке MonoQ («AmershamBiosciences», Швеция) (Calderoneetal., 2003). Белок PsbQ элюировали с колонки в течение 15 минут. Белок PsbР элюировали в градиенте NaCl от 0 до 500 мМ (время элюции 30 минут, выход белка наблюдался при 170 мМ NaCl).

7.Приготовление диализных трубок

фотосинтетический хлорофилл кислород диализный

1. Отрезать трубку необходимой длинны

2. Смочить и вымачивать 30 минут в большом избытке 10 мМ бикарбоната натрия

3. Вымачивать трубки 30 минут в большом избытке 10 мМ ЭДТА

4. Несколько раз сполоснуть дистиллированной водой

Хранить в 30% EtOH при +4оС. (http://molbiol.edu.ru/protocol/08₀₄.html)

8. Электрофорез

Способ разделения смеси белков на фракции или индивидуальные белки. Наиболее распространенным вариантом электрофоретического анализа белков, является электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) по Лэммли. (Остерман, 1981).

Анализ растворов отдельных белков после их очистки с помощью ионообменной хроматографии и трихлоруксусной кислоты проводили с помощью электрофореза в денатурирующих условиях в 12,5%-ном (м/о) ПААГ. (Laemmli, 1970) Образцы растворяли в 50 мМ Tris-HCl-буфере (рН 6,8), содержащем 8 М мочевину, 5% меркаптоэтанола, 3% додецилсульфата натрия, 10% сахарозы, 0,005%-ный бромфенолового синего, и нагревали в течение 1 минуты при 99оС. После электрофореза полипептиды в геле фиксировали и окрашивали по методике, описанной ранее (D. Kang, 2002), с использованием кумасси G-250.

В качестве маркеров использовали смесь белковых стандартов («Sigma», США).

1) Окраска SDS — PAGE по методу D. Kang с соавт. (2002 г.) с помощью кумасси — G — 250.

Окраска ведется в течении двух часов в свежеприготовленном растворе.

1.1.) Фиксация белков в геле — 30 минут Фиксирующий раствор :

30% этилового спирта

2% H3PO4

На 336 мл раствора:

122, 414 мл — 96% этанол

210, 520 мл — Н2О дист.

3 мл — 85% H3PO4

1.2.) Окраска — два часа (на качалке или оставить на ночь без перемешивания) Раствор для окраски:

0, 02% кумасси G — 250

2% H3PO4

5% Al2(SO4)3

10% эанол Растворы рассчитаны на 250 мл конечного объёма Готовят два раствора ;

1.2.1.) Кумасси в спирте (раствор А)

25 мл этилового спирта

0,05 г кумасси G — 250

1.2.2.) Соль и кислота в воде (раствор Б)

3, 48 мл — H3PO4 85%

24, 34 г — Al2(SO4)3 * 18 H2O

H2Oдо 225 мл Раствор профильтровать. После фиксации гель инкубируют некоторое время в растворе Б, а затем добавляют раствор, А и перемешивают.

На окрашивание (одного или двух гелей) необходимо взять 45 мл раствора Б и 5 мл раствора А.

2.) Расчеты для электрофореза (табл. 1)

Табл. 1. SDS электрофорез в ПААГ по Laemmli

Буфер для геля (х5):

a) Разделяющийгель (pH = 8, 8)

1, 5 M Tris — HCI 36, 3 g

0, 4%SDS 0, 8 g

H2O до 200 ml

b) Концентрирующий гель

0, 5 M Tris — HCI 6, 06 g

0, 4%SDS 0, 4 g

H2O до100 ml

Буфер для нанесения образца (х3):

0, 18 M Tris — HCI (pH = 6, 8) — 2, 18 g

6% SDS 0, 4 g- 6 g

30% Глицерин — 3 ml

0, 015% BPB (бромфеноловый синий) — 1,5 mg

H2O до 100 ml

Электродный буфер (х10):

0, 25 M Tris 60, 57 g

1, 92 MГлицин 288, 269 g

1% SDS 20 g

H2O до 2000 ml

9. Измерение концентрации белка

Содержание белка определяли методом Бредфорда.(Bradford, 1976)

Материалы:

1. Стандартный белковый раствор (0,5 мг/мл БСА), 0,5 мг/мл БСА имеет А280=0,33)

2. 0,15 М NaCl (0,0875 г в 10 мл H2Odd)

3. Раствор Кумасси (кумасси G-250 растворить в спирте, добавить к полученному раствору 85% фосфорную кислоту, довести водой полученный раствор. Профильтровать через фильтровальную бумагу. Хранить при +4оС.

Кумасси G-250 10 мг Этанол 95% 5мл

H2PO4 85% 10 мл

H2Odd до 100 мл

10. Измерение карбоангидрзной активности

КА-активность измерялась электрометрическим методом Вильбура и Андерсона (WilburandAnderson, 1948) по скорости изменения рН во время гидратации углекислого газа с использованием электрода MettlerToledoInLab 413 и «рН-метра-иономера cpX-2» (ИБП РАН, Пущино) с выводом сигнала на компьютер. Измерения проводились при 1,5−2оС в среде следующего состава: 25 мМ веронал (рН 8,6), 50 мМ KCl, 15 мМ MgCl2. К 1,29 мл вероналового буфера добавляли сначала образец 0,21 мл (добавка образца приводила к уменьшению рН на 0,1−0,15 ед.), а затем 0,75 мл воды, насыщенной углекислым газом при 0оС в течение 1 часа. С помощью специальной компьютерной программы рXmeter регистрировали изменения рН, а затем рассчитывали время уменьшения рН с 8,5 до 8,0. Для выражения значения КА-активности белков использовали единицы Вильбур-Андерсона, рассчитанные на 1 мг белка (ед. W-A/мг белка). Расчеты проводили по формуле: (t0 — t)/(t· m), где t0 и t — время изменения рН с 8,5 до 8,0 соответственно для спонтанной реакции (без добавок) и реакции в присутствии образца, m — количество белка в миллиграммах, внесенных в реакционную смесь. Измерения проводили по 3−4 раза в нескольких биологических повторностях. (Шитов с соавт., 2009)

V. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение и характеристика препаратов ФС-2

Для изучения карбоангидразоподобной активности белков PsbPи PsbQсначала необходимо выделить функционально активные препараты ФС-2. Их функциональная активность является мерой целостности этого пигмент-белкового комплекса. Чем выше фотосинтетическая активность полученных ФС-2, тем более полный выход белков PsbP и PsbQ можно получить. Поэтому первым этапом работы было выделение препаратов ФС-2 и определение концентрации хлорофилла в них.

1.1 Определение концентрации хлорофилла

BBY-препараты ФС-2 были получены по методу (RobinsonandYokum, 1980; Bertholdetal., 1981; FordandEvans, 1983). Определение концентрация хлорофилла в выделенных препаратах проводили при помощи спектрофотометрического метода, описанного в «Объектах и методах исследований».

На спектрофотометре (ShimadzuUV-1800)измеряется оптическая плотность (А) раствора при определенной длине волны 654 нм (данные приведены в табл.2).

Табл. 2. Измерение оптической плотности хлорофилла

Расчет концентрации хлорофилла производился по формуле, описанной в методике, результаты приведены в табл.3.

Табл.3. Концентрации хлорофилла для частиц ФС-2 BBYтипа

Из значений таблицы 3 вычислили среднее значение концентрации хлорофилла 2,628 мг/мл, которое затем использовали при определении количеств препаратов, необходимых для измерения фотосинтетической активности и вычислении объёмов сред для обработки препаратов ФС-2 с целью получения фракции белков PsbP и PsbQ.

1.2 Измерение скорости выделения кислорода

Скорость выделения кислорода является наиболее достоверным показателем функциональной активности ФС-2. Измерение проводили при рН 6.5. Концентрациюхлорофилла доводили до 10 мкг/мл. Скорость фотосинтетического выделения кислорода была рассчитана исходя из данныхграфика (рис.6).

Рис. 6. График фотосинтетического выделения кислорода ФС-2. Стрелкой вверх показан момент включения света. Стрелка вниз — момент выключения света.

Вычисление скорости выделения О2 за 1 час по формуле: V (О2) = ДU*K*60мин/СХл, где ДUзначение изменения вольтажа за 1 минуту, Kкалибровочный коэффициент (мкМО2/мл*мин*В), СХлконцентрация хлорофилла (мг/мл). Значение калибровочного коэффициентавычисляется по специальному калибровочному графику (рис.7). Его значение равно665, 79 мкМО2/ мл*мин*В. За тем по графику (рис.6) нашли изменение напряжения (В) за 1 минуту после включения света (начальная скорость на прямолинейном участке).

Скорость выделения кислорода составила 344,7 ± 12 мкМО2/ ч *мг/мл Для этого метода получения BBYмаксимальное значение для выделения кислорода показано порядка 600 мкМО2/ч*мг/мл, а среднее значение колеблется в пределах от 300 до 450 мкМО2/ч*мг/мл. Полученные нами данные свидетельствуют о достаточно хорошей функциональной активности ФС-2.

Рис. 7. Калибровочнаякривая для расчета скорости выделения кислорода

1.3 Измерение флуоресценции ФС-2

Ещё одним из наиболее достоверных методов определения функциональной активности ФС-2 является метод измерения флуоресценции. Пигменты фотосинтетического аппарата поглощают энергию света, часть высвечивается обратно в виде флуоресценции или рассеивается в виде тепла. При комнатной температуре в спектре флуоресценции наблюдается преимущественно полоса при 685 нм, принадлежащая антенному хлорофиллу, а ФС-2. (Кизимирко Ю. В., 2006)

Молекула П680, входящая в состав реакционного центра ФС-2, в возбужденном состоянии является первичным донором электрона для акцептора Qa. Реакционный центр находится в открытом состоянии, когда молекула П680 окислена, а хиноновый акцептор Qa восстановлен. После появления первичной пары П680+Феопроисходит восстановление П680+ от вторичных доноров. В результате РЦ оказывается состоянии П680Qa, называемое закрытым (Goh, Schreiber, Hedrich et al., 1999; Renger, 1992). Эти состояния характеризуются разным выходом флуоресценции (в закрытом состоянии флуоресценция максимальна, а в открытом — минимальна).

Разность между максимальным и минимальным выходом флуоресценции называется переменной флуоресценцией. Было установлено, что под действием света происходит восстановление первичного акцептора QA и выход флуоресценции возрастает от начального уровня (Fo) до максимального уровня (Fm), т. е. возникает так называемая переменная флуоресценция (Fv = Fm — Fo).Эта величина пропорциональна той части энергии света, которая используется в фотохимических реакциях фотосинтеза при открытых реакционных центрах ФС-2 и теряется в виде флуоресценции и тепла при закрытых реакционных центрах. Для расчета данных, полученных в ходе измерения следует брать одно из важнейших соотношений Fv/Fm, т. е. отношение интенсивностей переменной и максимальной флуоресценции. (Ланкин А.В. с соавт., 2014) Это отношение равно квантовому выходу использования энергии света открытыми РЦ ФС-2. По изменению этой величины можно судить о потенциальной эффективности первичных процессов фотосинтеза в ФС-2. Этот параметр флуоресценции, как показатель состояния и эффективности функционирования фотосинтетического аппарата, широко используется в фундаментальных и прикладных исследованиях. (Antalandal., 1998), (G. H. Krause, E. Weis, 1991).

Измерение флуоресценции проводилось для препаратов изначально адаптированных к темноте. Расчеты были проведены исходя из данных графика флуоресценции (рис.8).

Рис. 8. График флуоресценции ФС-2.

Fmмаксимальный квантовый выход флуоресценции;

Fvзачение переменной флуоресценции;

Foначальный уровень флуоресценции;

Отношение интенсивностей переменной и максимальной флуоресценции составило 0,744. Из других источников известно, что максимальный квантовый выход у листа растения составлял 0,83.(Лукаткин А. С. с соавт., 2009). Таким образом, полученные нами BBY частицы обладают довольно высоким показателем максимального квантового выхода фотохимии ФС-2и этот показатель, в совокупности с данными о фотосинтетическом выделении кислорода этим препаратом, свидетельствует о хорошей функциональной активности образца, достаточной для дальнейшей процедуры выделения белков PsbP и PsbQ.

1.4 Электрофорез

Ещё одним методом, позволяющем судить о целостности препаратов является денатурирующий электрофорез. Электрофорез проводили в полиакриламидном геле для идентификации ФС-2. (рис.9). Результаты электрофореза свидетельствуют о наличии в препаратах ФС-2 всех необходимых нам для дальнейшей работы белков.

Исходя из экспериментальных данных о фотохимической активности и электрофореза можно судить о функциональной активности субмембранных препаратов ФС-2 и её целостности, позволяющей проводить с этими препаратами дальнейшие обработки.

2. Получение и очистка белковРsbР и РsbQ

2.1 NaCl обработка

Субмембранные препараты ФС-2 обрабатывали 1 М раствором NaCl для экстракции гидрофильных белков PsbP (18 кДа) и PsbQ (24 кДа) при температуре +4оС при комнатном освещении в течение 30 минут. ссылка на статью

2.2 Диализ

Обессоливание белков проводилось методом диализа в присутствии 20 мМ HEPES-KOH-буфера (рН 7,5), содержащего 10 мМ NaCl и 2 мМ ЭДТА. ЭДТА использовалось в качестве комлексообразователя, то есть препараты таким образом были избавлены от металлов.

2.3 Разделение белков методом ионнообменной хромотографии

Ионообменная хроматография позволяет разделять молекулы, основываясь на ионных взаимодействиях. Чаще всего ионообменная хроматография является первым шагом к дальнейшей очистке белков.

Для разделения белков использовалась анионная ионообменная хроматография. Она характеризуется неподвижной фазой с положительно заряженными функциональными группами и задержкой отрицательно заряженных анионов.

Изначально система хроматографа (ActaFPLCc колонкойMonoQ) промывается этиловым спиртом и деионизованной водой. Разделение смеси белков PsbQ и PsbP проводилось в присутствии буфера HEPES (рН 7.5). Cкорость нанесения белка на колонку выбиралась в зависимости от давления и варьировала от 0,2 до 0,5 мл/мин.

После нанесения белковой смеси на колонку наблюдалось возрастание показателя поглощения в ультрафиолетовой области, что свидетельствовало о выходе белка из колонки (рис.10). Длина волны при поглощении в УФ области составляет 280 нм. Первым из колонки выходил белок PsbQ (он был собран во фракцию, обозначенную номером 1). Его выход был связан с тем, что он имеет изoэлектрическую точку (рI) равную 8.3, а белок PsbР — 6.5. Общий заряд белка определяется величиной рН. Если значение pH ниже изоэлектрической точки — заряд белковой молекулы является положительным, при pH выше — отрицательный. Таким образом при рН 7,5, белок РsbQ (заряженный положительно) выходит из колонки, а PsbР (заряженный отрицательно) задерживается на ней. Белок PsbР элюировали в градиенте NaCl от 0 до 500 мМ (время элюации 58 минут, выход белка наблюдался при 165−260 мМ NaCl). По мере элюции выходящий раствор собирали в различные фракции. Исходя из данных поглощения в ультрафиолетовой области, белки предположительно должны содержаться во фракциях 1, 6, 7 и 11. Эти фракции взяли для анализа на содержание белков. Для этого использовали электрофорез в денатурирующих условиях. Так как ряд фракций содержал высокую концентрацию NaCl, которая мешает проведению электрофореза, белки предварительно осадили с помощью трихлоруксусной кислоты (надосадочную жидкость с высоким содержанием соли слили), а затем перевели осадок в буфер для нанесения образцов для электрофореза.

2.4 Электрофорез

Электрофорез проводился в 12,5% ПААГ (рис.9). Растворы для нанесения на гель готовились по табл. 4. Ячейки геля заполнялись в соответствии со схемой (табл. 5).

Табл. 4. Растворы для нанесения на гель

Экспериментов по разделению белков было два, и нам удалось собрать фракцию 1 дважды. В таблицах отражены обе фракции под номерами 1.14 и 1.19 (номера после точки соответствуют дате выделения).

Табл. 5. Схема заполнения геля

Рис. 9. Электрофорез в ПААГ

1) Буфер для нанесения (контроль)

2) МаркерыAmershamECLRainbow — FullRange (Рис.11)концентрация белка приблизительно 2 мг / мл, спектр определения молекулярной массы 12−225 кДа.

3) BBY — препараты ФС-2 (описание в разделе «Получение и характеристика препаратов ФС-2»)

4) ФР6 — Обнаружен белок PsbP с молекулярной массой 23 кДа

5) ФР7 — Белка не обнаружено

6) ФР11 — примеси белков

7,8) ФР 1.14 и 1.19 — Обнаружен белок PsbQ (17 кДа) c примесями других белков.

9) Препараты ФС-2 после NaCl-обработки

10) МаркерыFermentasPagerulerUnstainedProteinLadder (рис. 11) Спектр определения белка от 10 кДа до 200 кДa

Рис. 11. Маркеры Amersham ECL Rainbow — Full Range (слева), маркерыPageRuler Unstained Protein Ladder (справа)

Из результатов электрофореза видно (рис. 9; полосы геля 3 и 9), что нам удалось полностью удалить белки PsbP и PsbQ из препаратов ФС-2 с помощью обработки NaCl. Кроме того, нам удалось отделить белки PsbP и PsbQ друг от друга при помощи ионообменной хроматографии (рис. 9 полосы геля 4, 7 и 8). Таким образом, полученные фракции белков можно использовать для исследования их карбоангидразоподобной активности. К сожалению, фракции изолированных белков PsbP и PsbQ содержат примеси: во фракции белка PsbP по-видимому присутствует белок PsbS; а фракция белка PsbQ содержит некоторые белки ССК-2.Для дальнейшей идентификации примесных белков необходимы другие методы и подходы, но это не входило в цели данной работы. Кроме того, известно, что белки ССК-2 не обладают карбоангидразной активностью (Шитов с соавт., 2009) и, следовательно, не могут помешать исследованию карбоангидразоподобной активности белка PsbQ.

Итак, нам удалось разделить белки PsbP и PsbQ и мы могли производить на них по отдельности дальнейшие исследования.

2.5 Определение концентрации белка по методу Брэдфорд

Для дальнейшей работы с белковыми фракциями было необходимо знать концентрацию белка в них. Для её определения был выбран метод Брэдфорд. Концентрация белка определялась исходя из данных по его оптической плотности (табл.6) через уравнение графика калибровки (рис.12). Расчеты произведенные по уравнению калибровочной кривой представлены в табл. 7.

Табл. 6. Данные оптической плотности (л = 595 нм) растворов разных концентраций бычьего сывороточного альбумина и исследуемых фракций белков.

Рис. 12. Калибровочная кривая

Табл.7.Конечная концентрация белка во фракциях

2.6 Измерение карбоангидразоподобной активности белков PsbP и PsbQ

Как было сказано выше, КА-активность внешних белков ВОК (PsbP, PsbOи PsbQ) не подавлялась ингибиторами карбоангидраз и поэтому активность обозначили как карбоангидразоподобную (КП-активность).

Исходя из данных концентрации белка, полученных при помощи метода Брэдфорд рассчитываем количество образца для измерения карбоангидразной активности (табл. 8 и 9).

Измерение КП-активности для белка РsbР проводим по схеме описанной в табл.8, для белка РsbQ — в табл. 9. Также измеряем КА-активность для ФС-2, чтобы сравнить её с активностью белков. Результаты измерения КП-активности отражены на рис. 13.

Табл. 8. Схема измерения КП-активности белка PsbP

Табл. 9. Схема измерения КП-активности белка PsbQ

Рис. 13. КА-активность ФС-2, КП-активность белков PsbPи PsbQ в присутствии или отсутствии ионов металлов.

Ранее было показано, что КП-активность белка PsbP увеличивалась в присутствии Mn2+ (Шитов с соавт., 2009). Однако, в этой работе белок PsbP содержал Mn в своём составе и осталось неясным, будет ли обладать КП-активностью этот белок, если удалить ионы Mn из белка. В нашей работе был получен образец белка PsbP, не содержащего ионов металлов в своём составе (для этого проводился диализ в присутствии ЭДТА). Нами было выяснено, что обработанный ЭДТА белок не обладал КП-активностью, но добавление ионов Mn2+ вызывало появление КП-активности этого белка. Как было показано ранее, также ведёт себя белок PsbO (Шитов с соавт., 2009). Ионы Ca2+ и Mg2+ и даже Cu2+ ещё более значительно увеличивали КП-активность белка PsbP, максимальное значение зафиксировано в опыте с ионами Mg2+ (83,29). Эти данные свидетельствуют о возможном сродстве белка PsbP к ионам двухвалентных металлов. Это предположение подтверждается результатамими, опубликованными ранее в иностранных научных статьях. Пока непонятно, насколько специфично действие определённых металлов на КП-активность PsbP и как связано это явление с механизмом функционирования и сборки ФС-2.Все эти вопросы требуют дальнейшего исследования.

В присутствии ионов Zn2+ КП-активность PsbP не проявлялась. Пока непонятно, с чем может быть связан этот результат. Возможно, играет какую-то роль неспособность ионов цинка проявлять степень окисления больше двух (как Mn), или этот ион имеет размеры, которые не подходят для мест связывания на белковой молекуле. Для решения этоих вопросов требуются дополнительные исследования.

Белок PsbQ, лишённый металлов, в отличии от белка PsbP, обладал КП-активностью, которая была сравнима с КА-активностью ФС-2. В присутствии Mn2+ и Ca2+ его КП-активность увеличивалась примерно в 3 раза. Резкое увеличение КП-активности наблюдалось с ионами Zn2+(94.77). Присутствие ионов Mg2+ и Сu2+ не приводило к увеличению КП-активности. Эти данные свидетельствуют о большем сродстве PsbQ к ионам Mn2+, Ca2+ и особенно Zn2+. Подтверждением этого сродства могут быть данные о важности белков PsbPи PsbQдля сохранения ионов Caи Cl в составе ВОК ФС-2. Косвенным подтверждением сродства Zn к PsbQ может являться тот факт, что в ФС-2 ранее обнаруживали присутствие ионов Zn2+ (Шитов с соавт., 2009).Однако, пока непонятна роль этого связывания в функционировании ФС-2. Необходимо отметить, что ионы цинка могут связываться не только с PsbQ, но и с другими белками, которые входят в состав выделенной нами фракции белка PsbQ. Для подтверждения связывания ионов Zn (а также Caи Mn), необходимо дальше очистить эту фракцию с применением других физико-химических методов (например, катионнообменной хроматографии) с целью получения белка PsbQв чистом виде и проведения аналогичных экспериментов с КП-активностью.

Так как ионы Zn2+ и Ca2+ обладали наибольшим влиянием на КП-активность, необходимо было определить зависимость активности от концентрации этих ионов (рис.14).

Из графиков видно, что зависимости КП-активности PsbQ от концентраций разных ионовзначительно отличаются. На графике концентрационной зависимости для ионов Zn2+ прослеживается пик активности (94,8 ед. W-A/мг белка при 200 мкМ Zn), а в присутствии высоких концентраций (1мМ) КП-активность уменьшается. Ионы Ca2+ действуют иначе, активность линейно возрастает по мере увеличения концентрации иона. По-видимому, это связано с различной природой взаимодействий этих ионов с белком. Причины различий в действии этих металлов пока не ясны и этот вопрос требует дальнейшего изучения. Наличие оптимума концентрации двухвалентного металла характерно для металлоферментов (в том числе и карбоангидраз) и это может быть либо признаком того, что белок PsbQявляется карбоангидразой нового класса, либо признаком присутствия посторонней карбоангидразы во фракции белка PsbQ. В любом случае, эта работа ещё не завершена и поставленные нами вопросы требуют дальнейшего исследования.

VI. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время наличие карбоангидразной активности в ФС-2 высших растений (горох, шпинат, пшеница, кукуруза) показано многими исследователями и не должно вызывать сомнений. Но пока неясно, какова природа носителя карбоангидразной активности в ФС-2. Им может быть один (или несколько) из известных белков ФС-2, обладающий неизвестной ранее функцией (карбоангидразной активностью), или неизвестный белок. Принимая во внимание значимость карбоангидразной активности для функционирования донорной стороны ФС-2, особое внимание было уделено исследованию карбоангидразной активности внешних водорастворимых белков водоокисляющего комплекса. В данной работе впервые был проведен анализ действия ионов двухвалентных металлов на карбоангидразоподобную активность белков РsbРи РsbQпо отдельности.

Было выяснено, что белок PsbPне обладал КП-активностью пока к нему не добавляли ионы двухвалентных металлов. Особенно эффективным активатором КП-активности оказался ион Mg2+, несколько менее эффективными — ионы Ca, Cu, Mn. Вопрос о специфичности ионов металлов в активации КП-активности PsbP пока остаётся открытым.

Было показано, что очищенный от ионов металлов белок PsbQобладал КП-активностью, которая сильно возрастала в присутствии ионов Zn2+, в присутствии ионов Caи Mn КП-активность увеличивалась с в два раза меньшей эффективностью. Также было выявлено, что Zn и Ca по-разному влияют на увеличение КП-активности, что может свидетельствовать о разной природе взаимодействий ионов этих металлов с белком PsbQ. Природу этих взаимодействий необходимо более тщательно исследовать, поскольку это важно для понимания закономерностей функционирования фотосистемы 2. В силу актуальности этой тематики, эта работа требует продолжения.

Роль обнаруженных носителейкарбоангидразной активности, находящихся в люменальной части ФС-2, в непосредственной близости к ВОК, может быть важна для фотосинтетического окисления воды, подобно функциональной активности карбоангидразы cah3, обнаруженной ранее в составе «ядерного» комплекса ФС-2 клеток C. reinhardtii и необходимой (наряду с анионом бикарбоната) для формирования, стабилизации и функционирования Mn2±содержащего водоокисляющего комплекса (Villarejoetal., 2002;Shutovaetal., 2008).

VII. ВЫВОДЫ

1. Фрагменты тилакоидных мембран хлоропластов, обогащенных фотосистемой 2, выделенные из листьев гороха, обладали хорошей фотохимической активностью и по своему белковому составу соответствовали препаратам фотосистемы 2, описанным ранее в научной литературе.

2. Выбранные нами методы и подходы позволили выделить изолированные фракции белков PsbPи PsbQс сохранением их КП-активности.

3.Выявлено, что изолированный и очищенный от металлов белок PsbP не обладал карбоангидразоподобной активностью. Эта активность проявлялась только в присутствии ионов двухвалентных металлов, таких как Mn2+, Ca2+, Mg2+, Cu2+. Ионы Zn2+не вызывали увеличения КП-активности.

4. Белок РsbQобладал КП-активностью без добавления ионов двухвалентных металлов. Однако, его активность значительно возрастала в присутствии ионов Zn2+, Ca2+ и Mn2+.Было выяснено, что ионы Zn2+и Ca2+ по-разному воздействуют на карбоангидразоподобную активность белка PsbQ.

VIII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Antal T. K., Venediktov P. S., Konev Yu. N., Matorin D. N., Hapter R., and Rubin A. B. (1998) Assessment of Vertical Profiles of Phytoplankton Photosynthetic Activity by the Fluorescence Method

Arnon D.I. (1949) Copper Enzymes in Isolated Chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiology 24, 1−15.

Arun K. Shanker (2008) Trace elements: Nutritional benefits, environmental contamination and health; 21 Modeofaction and toxicity of trace elements, Edited by M.N.V. Prasad

Barber J. (2002)P680: what is it and where is it?, Bioelectrochemistry. Jan;55(1−2):135−8.

Barber J., Chapman D.J. and Telfer A. (1987) Characterization of a PSII reaction center isolated from the chloroplasts of Pisum sativum. FEBS Lett. v.220, p.67−73.

Basics G. H. Krause E. Weis (1991) Сhlorophyll fluorescence and photosynthesis

Bradford M. M. (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding

Dai X., Yu Y., Zhang R., Yu X., He P. and Xu C. (2001) Relationship among Photosystem II carbonic anhydrase, extrinsic polypeptides and manganese cluster. Chinese Science Bulletin46, 406−408.

Guskov A., Kern J., Gabdulkhakov A., Broser M., Zouni A., Saenger W. (2009) Cyanobacterial photosystem II at 2.9 A resolution: role of quinones, lipids, channels and chloride. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 334−342.

Kang D., Gho Y.S., Suh M. and Kang C. (2002) Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Bulletin of the Korean Chemical Society23, 1511−1512.

Khristin M.S., Ignatova L.K., Rudenko N.N., Ivanov B.N. and Klimov V.V. (2004) Photosystem II associated carbonic anhydrase activity in higher plants is situated in core complex. FEBS Letters577, 305−308.

Klimov V.V., Allakhverdiev S.I., Shuvalov V.A. and Krasnovsky A.A. (1982) Effect of extraction and re-addition of manganese on light reactions of photosystem-II preparations. FEBS Letters148, 307−312.

Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature227, 680−685.

Lu Y.K. and Stemler A.J. (2007) Differing responses of the two forms of photosystem II carbonic anhydrase to chloride, cations, and pH. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) — Bioenergetics 1767, 633−638.

Lu Y.K., Theg S.M. and Stemler A.J. (2005) Carbonic anhydrase activity of the photosystem II OEC33 protein from pea. Plant and Cell Physiology 46, 1944;1953.

McConnell I.L., Badger M.R., Wydrzynski T. and Hillier W. (2007) A quantitative assessment of the carbonic anhydrase activity in photosystem II. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) — Bioenergetics 1767, 639−647.

Moroney J.V., Ma Y., Frey W.D., Fusilier K.A., Pham T.T., Simms T.A., DiMario R.J., Yang J. and Mukherjee B. (2011) The carbonic anhydrase isoforms of Chlamydomonas reinhardtii: intracellular location, expression, and physiological roles. Photosynthesis Research109, 133−149.

Moskvin O.V., Razguljayeva A.Y., Shutova T.V., Khristin M.S., Ivanov B.N. and Klimov V.V. (1999) Carbonic anhydrase activity of different Photosystem II preparations. In: Garab G. (ed.) Photosynthesis: Mechanism and Effects, Vol. 2, pp. 1201−1204. Kluver Academic Publishers, Dordrecht.

Renger G. (1992) Energy transfer and trapping in photosystem II. -In: Topics in photosynthesis, the photosystems: structure, functions and molecular biology. (ed.: Barber J.), Elsevier, Amsterdam, 45−99.

Muh F., Glockner C., Hellmich J., Zouni A., (2012) Light-induced quinone reduction in photosystem II. Biochimica et Biophysica Acta 1817, 44−65.

Rudenko N.N., Ignatova L.K. and Ivanov B.N. (2007) Multiple sources of carbonic anhydrase activity in pea thylakoids: soluble and membrane-bound forms. Photosynthesis Research 91, 81−89.

Shutova T., Nikitina J., Deikus G., Andersson B., Klimov V. and Samuelsson G. (2005) Structural dynamics of the manganese-stabilizing protein-effect of pH, calcium, and manganese. Biochemistry44, 15 182−15 192.

Stemler A. (1986) Carbonic anhydrase associated with thylakoids and Photosystem II particles from maize. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) — Bioenergetics850, 97−107.

Villarejo A., Shutova T., Moskvin O., Forssen M., Klimov V.V. and Samuelsson G. (2002) A photosystem II-associated carbonic anhydrase regulates the efficiency of photosynthetic oxygen evolution. EMBO Journal21, 1930;1938.

Wilbur K.M. and Anderson N.G. (1948) Electrometric and colorimetric determination of carbonic anhydrase. The Journal of Biological Chemistry176, 147−154.

Гольцев В.Н., Каладжи М. Х., Кузманова М. А., Аллахвердиев С.И.(2014). Переменная и замедленная флуоресценция хлорофилла a — теоретические основы и практическое приложение в исследовании растений. Ижеск-Москва: Институт компьютерных исследований.

Казимирко Ю. В. Разработка флуорометрических методов оценки состояния фотосинтетического аппарата для биоиндикации среды: диссертация … кандидата биологических наук: 03.00.02, 03.00.16. — Москва, 2006. — 117 с.

Ланкин А.В., Креславский В. Д., Худякова А. Ю., Жармухамедов С. К., Аллахвердиев С. И. (2014) Влияние нафталина на фотохимическую активность фотосистемы 2

Лукаткин А. С., Ревин В. В., Башмаков Д. И., Кренделева Т. Е., Антал Т. К., Рубин А. Б. (2009), Экологическая оценка состояния древесных растений г. Cаранска по флуоресценции хлорофилла

Малиновский В. И. (2004) Физиология растений, Владивосток: ДВГУ

Остерман, Л. (1981). Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование. Москва: Наука.

Полевой В. В. (1989) Физиология растений, Москва: Высшая школа Холл Д., Рао К. (1983) Фотосинтез, Москва: Мир Шитов, А. В. Исследование карбоангидразной активности фотосистемы 2 гороха: диссертация … кандидата биологических наук:03. 01. 04- Пущино, 2013. — 116 с.

Якушкина И. И. (2004). Физиология растений, Москва: Владос Яныкин, Д. В. Фотопоглощение молекулярного кислорода на донорной стороне фотосистемы 2 в субхлоропластных мембранных препаратах с разрушенным водоокисляющим комплексом: диссертация … кандидата биологических наук:03. 01. 04- Пущино, 2013. — 133с.