Влияние тепловых шоков, влажности и пострадиационного хранения на лучевое поражение хромосом растений

Актуальность проблемы. Влияние ионизирующих излучений на клетки начало привлекать внимание исследователей вскоре после открытия рентгеновых лучей и радиоактивного распада. Развитие техники дозиметрии в 20-х годах и открытие новых источников ионизирующего излучения послужили основой для становления количественной радиобиологии. К началу «атомной эры», когда новая наука начала развиваться особенно бурно, в радиобиологии сформировалось фундаментальное направление, изучающее исходные (пусковые) физические механизмы, имеющие место при действии ионизирующей радиации. Теоретической основой этого направления послужила точная формулировка принципа попадания и теория мишени, в основу которых легли представления о дискретном и случайном распределении событий сорбции энергии излучения и о неравнозначности отдельных микрообъемов живого вещества в отношении наблюдаемой радиобиологической реакции. Специальные опыты показали, что наиболее уязвимые компоненты клетки локализованы в ядре. А разработанные к тому времени генетиками методы обнаружения мутаций позволили доказать исключительную роль повреждений наследственного аппарата в реакции клеток на облучение. Поэтому изучение закономерностей изменений генетических структур при воздействии ионизирующих излучений имеет первостепенное значение и для теории радиобиологии, и для её практических приложений.

Уже в ранних радиационно-генетических исследованиях можно найти указания на то, что инактивация и гибель облученных клеток в большой степени зависят от окружающих их условий. Открытие и доказательство универсальности кислородного эффекта указали на принципиальную возможность управлять выходом радиобиологических реакций путем изменения физико-химических условий. Эта заманчивая как с теоретической, так и с практической точки зрения перспектива вызвала к жизни огромное количество работ по влиянию сопутствующих облучению факторов на лучевое поражение. Выполнены они многими авторами на разнообразных объектах с использованием разных методик, с учетом различных критериев поражения, но не. всегда с достаточно четким контролированием условий опытов. Вследствие этого картина влияния сопутствующих облучению факторов нередко противоречива. Более всего это, пожалуй, относится к данным о температурной модификации лучевого поражения, интерпретация которых усложнена тем, что температурные эффекты могут быть следствием изменений других сопутствующих облучению факторов (содержания кислорода, влажности и др.).

Цель и содержание настоящей работы. Целью настоящего исследования является изучение на удобной биологической системе, находящейся в относительном покое при минимальной интенсивности общего метаболизма, влияния тепловых шоков на выход лучевых повреждений хромосом. В качестве такой системы избраны покоящиеся семена Crepis capiiiaris, причем влажность семян варьировала в широких пределах. В качестве изучаемой реакции выбрано возникновение хромосомных аберраций в метафазе первого митотического цикла клеток меристемы корешков после начала прорастания облученных семян.

Основой исследования служат опыты по установлению кривых доза-эффект в пределах достаточно широкого диапазона доз для семян каждой данной влажности. При этом зависимость выхода хромосомных аберраций от дозы устанавливали как сразу после облучения, так и после пострадиационного хранения. На этом «фоне» проводили опыты по установлению возможного влияния тепловых шоков в широком диапазоне температур до и после облучения покоящихся семян.

С этой целью были поставлены следующие опыты:

1. Получение кривых доза-эффект сразу после облучения (25, 50, 75 и 100 Гр.) и после пострадиационного хранения при действии пред — и пострадиационных шоков в 60, 80 и Ю0°С на семена влажности 5, ад.

2. Получение тех же кривых для семян влажности 10,0 $.

3. Получение тех же кривых для семян влажности 18,0 $. В данном опыте влияние тепловых шоков в Ю0°С не изучено — температура оказалась летальной для относительно влажных семян.

4. Получение тех же кривых для семян влажности 2,5 $. Дозы облучения в данном опыте были 5, 10, 20 и 40 Гр., что вызвано высокой радиочувствительностью сухих семян.

Работа содержит также краткий обзор литературы и обсуждение полученных данных.

Научная новизна и основные результаты. Экспериментальный материал, представленный в работе, дает достаточно полную картину влияния тепловых шоков на цитогенетический эффект облучения благодаря получению кривых доза-эффект на фоне различных уровней сопутствующих облучению факторов. Было установлено, что предрадиа-ционный тепловой шок (предшок) непосредственного участия в первичных радиобиологических процессах не принимает. Эффективность пред-шока сводится к модификации кислородного эффекта согласно двум механизмам: удаление кислорода, препятствующее развитию кислородного эффектаудаление воды, способствующее проявлению кислородного эффекта. Относительный вклад первого механизма в выход изучаемой реакции растет с температурой. Показано, что усиление под влиянием пострадиационного теплового шока биологического последействия обусловлено, по крайней мере частично, сопутствующим высушиванием семян. Температурные эффекты мы рассматривали на фоне данных по влиянию влажности семян на выход изучаемой реакции. Такой подход позволил уточнить и конкретизировать механизмы, лежащие в основе некоторых температурных эффектов (защитный эффект и подавление последействия под влиянием предрадиационного теплового шока), описанных ранее, но до сих пор не имевших объяснения, а также выяснить природу усиления последействия под влиянием предрадиационного теплового шока, описанного нами впервые.

Практическая ценность. Настоящая экспериментальная работа посвящена развитию представлений о физико-химических механизмах радиационного поражения клетки. Полученные данные и обобщения. могут быть использованы в научных исследованиях по изучению влияния сопутствующих облучению факторов на радиобиологические эффекты, в исследованиях по радиационному мутагенезу, а также при изыскании способов повышения выхода радиомутантов для селекции растений и микроорганизмов.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Усиление поражения хромосом под влиянием пострадиационного теплового шока может наблюдаться лишь в достаточно сухих семенах. Оно обусловлено ускорением развития эффекта хранения, а также,.частично, высушиванием семян.

2. Лредрадиационный тепловой шок способен защищать семена от последующего облучения. Этот температурный эффект не связан с уменьшением влажности семян, а обусловлен, по-видимому, удалением, из семян кислорода.

3. Воздействие на семена тепловым шоком в Ю0°С до облучения делает их нечувствительными к пострадиационному хранению, что можно объяснить удалением кислорода. Во всем диапазоне влажнос-тей поражение семян, обработанных предрадиационными шоками в 60 и 80 °C, усиливается в процессе хранения. В семенах с влажностью 5.3 — 18% этот эффект обусловлен высушиванием в результате термического воздействия.

4. При комбинированном воздействии на семена с влажностью 2.5% тепловыми шоками и рентгеновыми лучами выход хромосомных аберраций меньше, чем при действии каждого из этих факторов в отдельности. По-видимому, изменения, вызываемые в клетке каждым из этих факторов и приводящие к образованию хромосомных аберраций, в этих условиях частично компенсируют друг друга.

2. КРАТКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Развитие теоретической радиобиологии привело в 50-х годах к пересмотру многих представлений и в первую очередь к отказу от «мгновенности первичного поражения». Было установлено, что после акта взаимодействия излучения с живым веществом образуются скрытые повреждения, превращение которых в явные зависит от пострадиационных условий. Среди процессов, приводящих к видимому радиобиологическому эффекту, была выделена группа реакций физико-химической природы, которую объединили под названием «физико-химическое последействие». Поскольку сам акт взаимодействия кванта излучения с веществом протекает на атомном уровне и, очевидно, не подвержен влиянию сопутствущих облучению факторов, то модификация радиационного поражения этими факторами, в том числе и тепловая модификация, сводится, по сути дела, к изменению хода процессов последействия. Поэтому здесь уместно рассмотреть вкратце основные результаты исследований радиационного физико-химического последействия.

Течер, выдерживая облученные семена ячменя в комнатных условиях в течение 12 недель, впервые обнаружил, что доля прорастающих семян уменьшается с увеличением времени хранения (Tascher, 1929). Позже Густафссон показал увеличение числа индуцированных мутаций через год после облучения семян рентгеновыми лучами (Gustaffson, 1947). Хранение облученных семян уменьшало также выживаемость (Stadler, 1930) — СКОРОСТЬ роста растений (Ehrenberg, 1954) и увеличивало число хромосомных аберраций (Gustaffson, 1937). Было установлено, что в сухих покоящихся семенах высших растений — в условиях, где физиологическая активность подавлена, метаболизм практически отсутствует, поражение может прогрессировать в течение нескольких недель после облучения (Adams, Kilan, 1958; Adams et al., 1955; Caldecott, 1958; Curtis et al, 1958). Усиление поражения семян во время пострадиационного хранения было названо эффектом хранения. На сегодняшний день феноменология эффекта хранения довольно хорошо изучена. Подтвердилась отмеченная еще в ранних исследованиях изменчивость его проявлениявыявлены основные причины этой изменчивости. Оказалось, что проявление эффекта хранения находится в сложной зависимости от всего комплекса условий проведения радиобиологических опытов.

Прежде всего, эффект хранения, наблюдаемый в опытах с рентгеновыми и гамма-лучами, как правило, отсутствует или незначителен при облучении семян плотноионизирующими излучениями (Эрен-берг, 1956; Caldecott, 1958; Hilan et al., 1961; Нузвдин И др., 1963; Conger, Carabia, 1972; Иванов, 1974; Nakai et al., 1980). Отмеченный в нескольких работах эффект хранения после нейтронного облучения (Шкварников, Черный, 1964; Помогайбо, 1968, 1969) обычно приписывают примесному гамма-излучению, хотя в некоторых случаях (Немцева, 1971; Дишлер, 1974) последействие нейтронов было показано и с учетом примесного гамма-излучения.

Показана температурная зависимость эффекта хранения. Так, пострадиационное усиление поражения семян за 96 час. выдерживания их при температуре сухого льда было пренебрежимо мало (коп-zak et al., 1957). Ослабление пострадиационного поражения при низких температурах показано рядом других исследователей (Семи-хатова, Бушуева, 1963; Filey, 1966; Тарасов, 1967, Бурлакова, 1968; Стойлов, Филев, 1971).

Прослеживая во времени поражение семян после облучения удается выделить два компонента эффекта хранения — быстрый и медленный. Быстрый компонент начинает сказываться уже с первых часов после облучения и нарастает до I — 2 суток. Затем кривая время-эффект изгибается, но не выходит на плато, а продолжает медленно подниматься вплоть до нескольких недель или даже месяцев после облучения (Иванов, 1974). При еще больших сроках хранения выход радиобиологических реакций стабилизируется и даже может снизиться (Дишлер, 1965; Березина и др., 1966; Семерджян и др., 1968). В некоторых случаях обнаруживаются периодические изменения — так называемая, «волновая кинетика» — уровня поражения в пострадиационном периоде хранения (Дубинин, Дубинина, 1968; Гиляровская, 1973; Коробко и др., 1973; Шаназарова, 1977).

В большой степени эффект хранения зависит от содержания влаги в семенах. Оказалось, что его можно наблюдать только в достаточно сухих семенах. Максимальная влажность семян, когда еще можно обнаружить эффект хранения, колеблется для разных видов в области 8 — 12 $ относительной влажности (conger, 1972). Однако, в очень сухих (0 — 1,5 $ влаги) семенах последействие также не наблюдается (Немцева, Романов, 1969; Конгер, 1963). Так что, эффект хранения в семенах можно обнаружить лишь в довольно узком диапазоне влажности. Позже было показано, что влиянию влаги подвержен только быстрый компонент эффекта хранения, а медленный компонент может развиваться и в сильно увлажненных семенах (Atayan, Gabrielian, 1978). Опыты с изменением влажности семян после облучения показали, что содержание влаги в семенах важно как во время облучения, так и во время пострадиационного хранения (Wolff, Sicard, 1961; Фесенко, 1966; Joshi et al., 1969; Фесенко, Царапкин, 1973; Габ-риелян, Атаян, 1977). Рассмотрена связь физического состояния воды при различных содержаниях ее в семенах с ее модифицирующим влиянием (Mahama, Silvy, 1982).

Наконец, существенным для наблюдения эффекта хранения оказалось наличие кислорода (Adams, Nilan, 1958;Tallentire" Davis, 1961). Причем, аэрация необходима для выявления только быстрого компонента эффекта хранения — медленный компонент имеет место и в анаэробных условиях (Afzai, Kesavan, 1977). В приведенных исследованиях критерием поражения служили в основном или хромосомные аберрации, или родственные им нарушения роста и развития растений.

Следует отметить, что к «эффекту хранения» принято относить только часть процессов радиационного последействия, которая заключена в отрезке времени между концом облучения и началом замачивания. Однако, те же процессы конечно же протекают уже вовремя облучения и вносят свой определенный вклад в «мгновенную» реакцию исследуемого объекта на облучение. Так, Натараджан и Марич показали, что картину влияния влажности на радиочувствительность семян ячменя вполне можно объяснить величиной эффекта хранения, развивающегося во время облучения (Nataraj'an, Marie, 1961). Кроме того, во время облучения могут иметь место и такие процессы последействия, которых вообще невозможно обнаружить в пострадиационный период из-за скоротечности. Так, Пауэрсу удалось выделить пять типов начальных повреждений в облученных спорах в. megaterium, которые приводят к гибели бактерий, если их не подвергнуть специальным воздействиям (аноксия, 80 °C, no, h2s). Два из них, вызывающих 38 $ общего поражения от данной дозы облучения, можно обезвредить анокси-ей и сероводородом только во время облучения. Такой же вклад в общее поражение дает класс III долгоживущих начальных повреждений, по-видимому соответствующий тем изменениям в семенах, которые ответственны за эффект хранения (Powers, Kaleta, I960- Powers et al., I960- Пауэре, 1963; Ewing, Powers, 1976).

Таким образом, трудно назвать фактор или условие проведения опытов, которые не влияли бы на радиационное последействие. Сложная зависимость последействия от всего комплекса условий радиобиологических опытов на семенах растений вызвала изрядную противоречивость результатов и особенно их интерпретаций. Поэтому, до сих пор это явление не получило удовлетворительного объяснения.

Увеличение числа хромосомных аберраций в пострадиационный период связывали с движением хромосом. Полагали, что разорванные облучением хромосомы могут легко воссоединиться, если семена замачивать вскоре после облучения. Если же гидратация клеток отсрочена, то разломы хромосом за время хранения могут настолько разойтись, что их воссоединение (реституция) станет невозможным (Curtis et al, 1958).

Другое объяснение последействия связано с гипотезой потенциального (латентного) разрыва (Liming, 1954; Swanson, 1954; 1955; Thoday, 1953). Предполагается, что облучение вызывает как действительные, так и потенциальные разрывы хромосом. Последние превращаются в действительные разрывы в присутствии кислорода, а в анаэробных условиях восстанавливаются.

Усиление повреждения хромосом после облучения может также быть обязано влиянию кислорода на процессы реституции. Кислород может реагировать с разорванными концами хромосом, препятствуя реституции, тогда как присутствие азота может благоприятствовать ей (Adams, Nilan, 1958).

Ни одна из этих гипотез, как видно, не предполагает увеличения количества генных мутаций в пострадиационном периоде, которые, как полагалось, индуцируются в момент облучения или в результате разрывов хромосом, или независимо от них. Высказаны также предположения о механизмах последействия, индифферентные к роду наблюдаемого эффекта облучения.

Альпер предложила гипотезу о «метионической реакции» (Alper, 1956). Она постулирует, что облучение вызывает возбуждение или ионизацию молекулы мишени, которая способна некоторое время оставаться в таком состоянии. Если ионизированная молекула сможет как-то заполучить электрон, то она восстановится в нормальную. Однако, если до этого она встретит такую активную молекулу как кислород, то вступив с ней в реакцию станет невосстановимой.

Калдекотт для объяснения последействия в семенах привлек явление миграции энергии возбуждения, известное из радиохимии, Он считает, что по крайней мере один из механизмов радиационного последействия включает в себя перенос энергии поглощенного кванта из сайта первичной абсорбции во вторичный более чувствительный сайт (Caldecott, 1961).

На сегодняшний день наиболее популярна «кислородно-радикальная гипотеза» последействия радиации. После того, как были обнаружены долгоживущие парамагнитные центры, индуцируемые облучением в семенах, количество которых, к тому же, зависело так же, как величина последействия от наличия кислорода (conger, Randolf, 1959; Zimmer, 1959), радиобиологам впервые представилась возможность оперировать не какими-то гипотетическими лабильными состояниями молекул, а вполне материальными свободными радикалами, легко регистрируемыми сравнительно простым физическим методом ЭПР. В многочисленных исследованиях спектров ЭПР облученных биологических образцов установлен параллелизм в поведении свободных радикалов и биологическом последействии радиации при воздействии различных модифицирующих факторов (Ehrenberg, Uybom, 1954; Conger, Randolf, 1959; Myttenaere et al., 1965; Kavai, Sato, 1966; Constantin et al., 1970; Rogers, Powers, 1981). А главную поддержку эта гипотеза получила из опытов по биологическому действию синтезированных радикалов (philips, 1956) и экспериментов с применением перехватчиков свободных радикалов (Sparrman et al., 1959; Ehret et al., I960- Powers et al., I960- Conger, 1961; Kakken, 1965). He вдаваясь в подробности развития свободно-радикальной концепции радиационного последействия приведем со слов автора модель пострадиационного усиления поражения семян, учитывающую влияние основных сопутствующих облучению факторов, в которой, как нам кажется, наиболее полно суммированы знания о поведении свободных радикалов в сухих биологических системах:

Возникшие радикалы могут или рекомбинировать, или реагировать с другими биологическими молекулами. Их рекомбинация наиболее безвредна. Если же они взаимодействуют с другими молекулами, то часть из них, реагируя с биологически важными молекулами, усилит повреждение. Факторы, вызывающие образование радикалов близко друг к другу (облучение с высокой плотностью ионизации) или удерживающие их вместе (очень низкие температуры, сухость, очень жесткие состояния) усиливают скорость рекомбинации и в результате приводят как к уменьшению числа радикалов, остающихся после облучения, так и к уменьшению последействия. Факторы, которые способствуют подвижности радикалов (высокая температура, высокое содержание воды, малая жесткость системы) дают такой же результат. С другой стороны, если во время облучения создаются условия, приводящие к сохранению радикалов, то впоследствии те условия, которые способствуют их подвижности, будут усиливать их рекомбинацию и уменьшать повреждениете же, которые ослабляют их движение, будут уменьшать рекомбинацию и способствовать реакциям, приводящим к дополнительному повреждению. Значительную часть такой реакции, усугубляющей лучевое поражение, составляет превращение долгоживу-щих радикалов вследствие взаимодействия с кислородом в перекисные радикалы" (Конгер, 1963).

Ясно, что манипулируя таким множеством переменных, можно post factum объяснить любое мыслимое изменение эффекта облучения. Однако, гипотеза лишена предсказательной силы из-за отсутствия количественного описания ее, а также из-за неопределенности исходных посылок. Так, видимое уменьшение сигнала радикалов может сопровоздаться усилением или уменьшением биологического пораженияобводнение среды увеличивает вероятность и рекомбинации радикалов, и их реакции с биологически важными молекулами и т. д. С другой стороны сигнал ЭПР в таких сложных объектах, как семена, бактерии ит. п. представляет наложение резонансов множества парамагнитных центров, индуцируемых облучением в самых разных молекулах, большая часть среди которых, скорее всего не имеет отношения к наблюдаемой биологической реакции. Наблюдаемые корреляции же свидетельствуют лишь о том, что свойства парамагнитных центров, регистрируемых ЭПР в отношении использованных модифицирующих факторов примерно одинаковы, независимо от их участия в биологическом эффекте (Корогодин, 1966).

Таким образом, относительно механизмов последействия радиации в сухих биологических системах определенно можно утверждать лишь, что, по-видимому, имеется много способов, какими начальное повреждение может быть усилено после облучения. Какие из этих способов наиболее существенны — зависит от конкретных условий радиобиологического эксперимента.

Температура была одним из первых факторов, значение которых было оценено радиобиологами как для практического управления эффектами облучения живых организмов, так и в качестве важного инструмента в изучении путей становления радиобиологичес~ ких реакций. Поэтому естественно, что к настоящему времени накопилось большое количество литературы, посвященной изучению влияния различных температурных воздействий (повышенных и пониженных температур, глубокого охлаждения и тепловых шоков) до, во время и после облучения на выход самых разнообразных радиобиологических реакций у самых различных организмах. Несмотря на это, картина влияния температуры на эффекты облучения остается пока довольно туманной, подчас противоречивой. Меллер подчеркивает, что «сложность, запутанность температурного влияния не слишком удивительна, так как понятно, что выход радиационного поражения зависит от цепи химических событий, легко изменяемых различными реакциями в протоплазме. С этой точки зрения понятно также, что температурные эффекты не будут одинаковыми во всех биологических объектах или во всех типах генетических изменений» (Muller, 1954).

Исследования модификации лучевого поражения пониженными температурами приводят к весьма тривиальному выводу: процессы последействия облучения замедляются, а при достаточно низкой температуре начальные изменения, вызванные облучением, как бы «замораживаются» и могут сохраняться в образце неопределенно долго после облучения. Так, В опытах (Bergbusch, Caldecott, 1963) облученные семена ячменя после 120 час. хранения в сухом льду (-78°С) вели себя во время пострадиационного хранения при различных температурах (20 и 85°С) и реагировали на наличие кислорода во время замачивания точно так же, как без низкотемпературной обработки. Подобные результаты получены и в ряде других исследований (Гриценко, Сергеева, 1974; Найденова, Василева, 1976а- 19 766- Гарина и др., 1979; Порозова, 1979; Цуцаева и др., 1981).

Более информативны, но и более противоречивы результаты исследований эффектов высоких температур — так называемых, тепловых шоков.

Предрадиационный тепловой шок оказывает, как правило, защитное действие на индуцируемое облучением семян подавление роста проростков (Smith, 1943, 1946; Caldecott, Smith, 1952; Konzak et al., 1957, I960- Bergbusch, Caldecott, 1963; Бабаян, 1972; Николов, Иванов, 1976), но не оказывает заметного действия на выживаемость семян (Smith, Caldekott, 1948; Caldecott, Smith, 1951, 1952). Под влиянием предрадиационного шока происходит увеличение частоты мутаций, но уменьшение частоты хромосомных аберраций (Smith, Caldecott, 1948; Caldecott, Smith, 1951, 1952; Шапиро, Протопопова, 1964) или же он вовсе не влияет на выход хромосомных аберраций (Swanson, Yost, 1951). Пострадиационный шок высокой температурой не оказывает заметного действия на выживаемость семян (Smith, Caldecott, 1948; Caldecott, Smith, 1951, 1952). Он способствует усилению эффекта облучения на подавление роста проростков (Smith, 1943; 1946) или ослаблению его (Gelin, 1953, 1956, a, bGaul, 1957; Konzak et al., I960, I96I-Wolff, Sicard, 1961; Santos, 1965; Mostafa, 1965; Kesavan et al-, 1973). Пострадиационный шок увеличивает, как правило, частоту мутаций (smith, Caldecott, 1948, Caldecott, Smith, 1951, 1952; Gaul, 1957; Konzak et al-, 1961). Пострадиационный шок уменьшает частоту хромосомных аберраций (Smith, Caldecott, 1948; Gaul, 1957; Konzak et al., I960, 1961; Balint et al., 1968; Горанов, Катрова, 1976), или не влияет на выход хромосомных аберраций (Swanson, Yost, 1951;Wolff, Sicard, 1961). На семенах гороха (влажность — 15%) показано, что тепловые шоки приводят к уменьшению. поражения хромосом, измеряемого в клетках в конце первого митозавыход же хромосомных аберраций в клетках, вступающих в первый митоз, не реагировал на воздействие на семена тепловыми шоками.(Атаян, 1968).

Такое разнообразие, порой противоречивость, эффектов высоких температур очевидно вызвана влиянием на них множества факторов. С другой стороны, и сама высокая температура неизбежно влияет на другие сопутствующие облучению факторы. Поэтому осмыслить эффекты высоких температур можно только при рассмотрении их в комплексе с другими модифицирующими факторами. Было сделано несколько таких попыток. Это прежде всего исследования Найлана, Конзака, Калде-котта (Konzak et al., I960- Caldecott, 1961; Hilan et al., 1962; Nilan, 1964), в которых рассматривались взаимоотношения таких модификаторов радиационного поражения, как хранение, температура, кислород, влажность.

Показано, в частности, что предрадиационный тепловой шок может защищать семена как от поражения, наблюдаемого сразу после облучения, так и от «эффекта хранения». Однако, при этом он не только не уменьшает пострадиационную чувствительность семян к кислороду, которая обычно уменьшается со временем после облучения (Caldecott, 1958), но даже стабилизирует ее (caldecott, 1961; North et al., 1962. Калдекотт предположил, что эти эффекты могут быть связаны или с изменениями под действием высокой температуры в клеточных мембранах, в результате которых они становятся непроницаемыми для кислорода, или с реориентацией чувствительных сайтов макромолекул, вследствие чего они становятся недоступными для кислорода до тех пор, пока семена не будут замочены. Высказаны также предположения об удалении локально связанной воды из чувствительных сайтов (Caldecott, 1961), о вытеснении кислорода ИЗ семян (Ehrenberg et al., 1962) и др.

Высокая температура может оказывать защитное действие и в случае ее применения во время или непосредственно после облучения. В таких случаях защиту объясняют быстрой рекомбинацией не успевших прореагировать с кислородом свободных радикалов (Пауэре, 1963), или «возвращением захваченных электронов в дырки кристаллической решетки, откуда они были выбиты радиацией» (Konzak et al., I960), или уменьшением времени жизни перексиных радикалов (Nilan et al., 1962).

Однако более типичный эффект пострадиационного теплового шока — это усиление индуцированного облучением поражения. При этом высокая температура вызывает потерю семенами чувствительности к кислороду — картина прямо противоположная той, что наблюдается после предрадиационного шока (Caldecott, 1961). Поражающее действие пострадиационной тепловой обработки обычно объясняют ускорением реакций эффекта хранения (копиак et а1., 1960; ве^ЬивсЬ Са1с1есо-М-, 1963), хотя сами они еще мало понятны.

Калдекотт отмечает, что наблюдаемые им эффекты высокой температуры ярче выражены в предварительно высушенных семенах. Однако, систематического исследования зависимости тепловых эффектов от влажности семян в литературе нет. Существенным пробелом в изучении эффектов тепловых шоков является также отсутствие исследований их зависимости от самой температуры воздействия. Наконец, общий почти для всех цитированных работ недостаток — это исследование лишь при одной дозе, а не в диапазоне доз облучения, хотя известно, что как степень, так и направление влияния сопутствующих облучению факторов могут зависеть от дозы облучения (Тимофеев-Ресовский, 1963). С учетом всего вышесказанного и было проведено настоящее исследование.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА.

I. МАТЕРИАЛ И УЧИТЫВАВШАЯСЯ РЕАКЦИЯ.

В качестве объекта исследования использованы покоящиеся семена Crepis capillaris (скерда зеленая) из семейства Compositae. При изучении сопутствующих облучению факторов эти семена имеют определенные преимущества даже по сравнению с классическим объектом таких исследований — ячменем. Так, малые размеры семян позволяют быстро изменять их влажность и температуру, облучать их в большом количестве одновременно. Всего три пары легко идентифицируемых хромосом позволяют с успехом применить метафазный метод анализа перестроек хромосом, дающий наиболее объективную и точную оценку степени поражения хромосом (Wolff, Luipold, 1957; Шевченко, 1965; Conger, 1965; Демин и др., 1967; Генералова, 1968).

После соответствующих обработок семена проращивали в чашках Коха на фильтровальной бумаге, смоченной водопроводной водой. Чашки с семенами помещали в темный термостат с температурой 24 °C. Через 30 час., когда у большинства семян уже проклюнулись первичные корешки, семена переносили на фильтровальную бумагу, смоченную 0,01^-ным раствором колхицина (Colchicin krist. reinst.) и выдерживали их в термостате еще в течение 4−5 часов. Затем отбирали корешки длиной 1,5 — 2 мм и фиксировали их в смеси этилового спирта с ледяной уксусной кислотой (объемное отношение 3:1). Учет хромосомных аберраций проводили в метафазных пластинках на давленных ацетокарминовых препаратах кончиков корешков.

Как известно, клетки зародыша семян Crepis capyliaris находятся в стадии G., клеточного цикла, когда хромосомы представлены одиночными нитями. Повреждения хромосом в этой стадии, после удвоения, проявляются в метафазе в виде аберраций хромосомного типа (sire, Hilan, 1959). Мы учитывали все встречавшиеся виды хромосомных аберраций: симметричные и асимметричные транслокации, хромосомные кольца, парные микрофрагменты, инверсии, делеции. Аберрации хроматидного типа встречались крайне редко (I — 2 на 1000 ме-тафаз).

Обработка колхицином только что проклюнувшихся корешков, в которых клетки еще только начинали вступать в первый митоз, позволила нам исключить ошибки в оценке поражения хромосом, связанные с их размножением. Дело в том, что колхицин блокирует деление клеток, не препятствуя при этом кариокинезу (К-митоз). Плоидность клеток при прохождении каждого митоза удваивается, и отличить первые метафазы от последующих не представляет труда. Мы учитывали только диплоидные клетки, т. е. клетки в метафазе первого митоза. Кроме того, колхицин способствует накоплению метафазных клеток. В подробностях метод метафазного анализа аберраций хромосом в семенах Crepis capillaris описан в книге Л. С. Немцевой (Немцева, 1970).

В среднем на экспериментальный вариант анализировали 500 клеток в 10 корешках, больше — в контроле, меньше — в случаях сильного поражения.

При обработке результатов цитологического анализа применяли необходимые математико-статистические методы.

Основные результаты, полученные в настоящей работе, можно кратко. сформулировать следующим образом:

1. Частота спонтанных аберраций хромосом семян Crepis са-pillaris изменяется с влажностью лишь незначительно. Под. влиянием тепловых шоков частота хромосомных аберраций растет. Этот эффект увеличивается с температурой и сильнее выражен в сухих семенах.

2. Радиочувствительность семян Crepis capiilaris уменьшается с увеличением влажности в диапазоне от 2,5 до 18%, Эффект хранения уменьшается с увеличением влажности от 2,5 $ и исчезает при. влажности 10 $.

3. Эффективность пострадиационного теплового шока как модифицирующего фактора в значительной мере зависит от влажности семян, от температуры воздействия и дозы облучения.

4. Предрадиационный тепловой шок способен защищать семена от последующего облучения. Защитный эффект увеличивается с температурой предобработки и уменьшается с увеличением влажности семян. Этот эффект не связан с уменьшением (в результате термической обработки) влажности семян, а обусловлен, по-видимому, удалением из семян кислорода.

5. Воздействие на семена тепловым шоком в Ю0°С до облучения делает их нечувствительными к пострадиационному хранению, что можно объяснить удалением кислорода. Во всем диапазоне влажностей поражение семян, обработанных предрадиационными токами в 60 и 80 °C, усиливается в процессе хранения. В семенах с влажностью 5.3−18 $ этот эффект обусловлен высушиванием в результате термического воздействия.

6. При комбинированном воздействии на семена с влажностью 2.5 $ тепловыми шоками и рентгеновыми лучами выход хромосомных аберраций меньше, чем при действии каждого из этих факторов в отдельности. Таким образом, изменения, вызванные в клетке каждым из этих факторов и приводящие к образованию хромосомных аберраций, в этих условиях частично компенсируют друг друга.

7. Эффекты тепловых шоков изменялись по величине, а часто и по направлению, в зависимости от температуры, дозы облучения, влажности семян и пострадиационного хранения. Это означает, что при изучении влияния модифицирующих факторов на радиочувствительность для получения полной картины следует варьировать в широких пределах как дозу облучения, так и уровень сопутствующих облучению факторов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Настоящий раздел состоит из 3 глав: I. Общие итоги опытов, 2. Обсуждение полученных результатов, 3. Заключительные замечания.

I. ОБЩИЕ ИТОГИ ОПЫТОВ.

Таким образом, результаты всех опытов, приведенных в предыдущем разделе, приводят к следующей общей картине.

В разных опытах в качестве контрольных вариантов выступали: а) необработанные семена с влажностью 5,3, 10, 18, 2,5 $- б) семена, выдержанные в течение 30 мин. при температурах 60, 80 и Ю0°С (последняя обработка оказалась летальной при влажности 18 $) — в) семена, хранившиеся вслед за тепловой обработкой в течение недели. Уровень спонтанных аберраций незначительно менялся от опыта к опыту в зависимости от влажности семян. Поражение семян также несколько изменялось в ту или другую сторону (здесь мы не смогли уловить какой-либо закономерности) в процессе хранения семян после термической обработки. Сами тепловые шоки неизменно вызывали повреждение хромосомэффект этот рос с температурой и в некоторых случаях выход хромосомных аберраций намного превышал фон. Как пример наиболее интересного наблюдения отметим, что тепловой шок в Ю0°С поражал сухие (2,5 $) семена в той же мере, что и облучение в дозе 10 Гр.

Во всех опытных вариантах хромосомные и хроматидные аберрации учитывались дифференцированно. Хроматидные аберрации наблюдались крайне редко. Основной вклад в общее число хромосомных аберраций вносится транслокациями — симметричными и асимметрииными. Затем шли кольца, парные микрофрагменты, инверсии и хромосомные концевые делеции. Выход хромосомных аберраций рос с дозой облучения, но относительная частота появления отдельных типов перестроек при этом не изменялась. То же можно сказать о модифицирующих факторах — примененные нами обработки не оказывали заметного влияния на спектр хромосомных аберраций. Поэтому в дальнейшем мы будем рассматривать лишь суммарные данные для числа хромосомных аберраций на клетку.

Дозы облучения мы выбирали на основании предварительных опытов таким образом, чтобы выход хромосомных аберраций в варианте «Облучение» находился примерно, а одном и том же диапазоне для семян разных влажностей. Сравнение «фоновых» кривых доза-эффект, представленных в предыдущем разделе, показывает, что семена с относительным содержанием влаги 5,3, 10 и 18 $ по радиочувствительности примерно одинаковы, в то время как сухие (2,5 $) семена примерно в 2,5 раза чувствительнее к Х-лучам.

Эффект хранения сходит на нет с увеличением влажности семян: в семенах с влажностью 2,5 $ поражение в процессе хранения усиливалось в 2,1 раза, в семенах с влажностью 5,3 $ - в 1,6 раз, в более влажных семенах последействие не наблюдалось.

Прежде чем рассмотреть температурные эффекты, отметим следующий экспериментальный факт. Как правило, эффекты, оказываемые тепловыми шоками в 60 и 80 °C совпадали по направлению и часто по величине. Принципиально отличные эффекты мы наблюдали при применении тепловых шоков в 100 °C. Особенно это относится к влиянию предрадиационных шоков на начальное поражение и на эффект хранения.

Пострадиационные тепловые шоки усиливают поражение сухих (2,5 $) семян, облученных в относительно больших дозах — тепловое последействие. Этот эффект растет с температурой. Семена с влажностыо 5,3 $ также проявляют тепловое последействие, но лишь при воздействии на них температурой 100 °C. Более влажные семена на постшоки не реагируют.

Хранение семян с влажностями 5,3, 10 и 18 $, обработанных тепловым шоком после облучения, не изменяет уровень их поражения. То же касается и семян с влажностью 2,5 $, облученных в малых дозах. Семена с влажностью 2,5 $, облученные в больших дозах и затем обработанные тепловым шоком, реагируют на дальнейшее хранение по разному в зависимости от температуры тепловой обработки: выход хромосомных аберраций в семенах, обработанных температурами 60 и 80 °C, растет, а в семенах, обработанных температурой Ю0°С, не изменяется. Этот результат не означает, что с увеличением температуры постобработки семена теряют чувствительность к пострадиационному хранению. Скорее под влиянием теплового шока в Ю0°С в семенах развивается максимально возможное последействие уже во время термического воздействия (в течение первых 30 минут после облучения), и дальнейшее хранение семян неспособно изменить достигнутый уровень.

Предрадиационные тепловые шоки защищают семена с влажностью 2,5 $ от последующего облучения, причем эффект растет с температурой. Защитный эффект наблюдается и для семян с влажностью 5,3 и 10 $, но лишь при действии предшока в Ю0°С. Начальное поражение семян с влажностью 18 $ под влиянием предрадиационных шоков не изменялось.

Предрадиационный тепловой шок в Ю0°С полностью подавлял развитие эффекта хранения в семенах. Во всем диапазоне исследованных влажностей поражение семян, обработанных тепловыми шока-ми в 60 и 80 °C до облучения, усиливается в пострадиационный период. В приложении к семенам влажности 10 и 18 $ этот результат можно сформулировать так: в определенных экспериментальных ус.

0,6 м со и «.

§ за.

0,4.

0,2 со л.

О) •Оа} 0.

0,21а.

0,3 Г 0,2 ОД т м.

20 40 5 Доза, Гр.

Рис. 8. Влияние предрадиационных тепловых шоков на поражение хромосом в семенах с влажностью 2,5 $. а — без хранения, б — после недельного хранения. Температура шоков: ¦ - 60 °C,? — 80 °C, И — Ю0°С.

40 ловиях предрадиационные тепловые шоки могут инициировать эффект хранения в семенах, в которых в норме пострадиационное поражение не наблюдается. Усиление пострадиационного поражения под влиянием предшоков в 60 и 80 °C — единственный эффект, который не зависит от влажности. Это также единственный температурный эффект в семенах влажности 18 $. Любопытно, что этот эффект никем до сих пор не был замечен.

Сравнительное рассмотрение кривых доза-эффект, полученных для семян с влажностью 2,5 $ при предрадиационном воздействии на них тепловыми шоками, затруднено ввиду их своеобразной формы (Рис. 7 б, в, г). На Рис. 8 мы представили данные в форме, позволяющей четко выделить особенности влияния предрадиационных токов на сухие семена. На этом рисунке частота хромосомных аберраций представлена как функция предрадиационной температуры для каждой дозы Х-лучей. В левой части рисунка (а) представлены данные для немедленного пораженияв правой части (б) — для поражения в конце периода пострадиационного хранения. Выход хромосомных аберраций в комбинированных вариантах ТО и ТОХ указан за вычетом числа хромосомных аберраций в соответствующих контролях Т и ТХ. Соответственно, выход аберраций ниже 0-уровня указывает, что поражение в результате комбинированного воздействия было ниже, чем при соответствующем тепловом воздействиивыход аберраций выше 0-уровня указывает, что поражение в результате комбинированного воздействия сильнее, чем при соответствующем температурном контроле. Выход хромосомных аберраций в контрольных вариантах — термическая обработка без облучения (Т, ТХ) — также указан на рисунке. Легко видеть, что для каждой данной дозы Х-лучей имеет место обратная зависимость числа хромосомных аберраций при комбинированной обработке от температуры шокового воздействия. В то же время поражающий эффект теплового шока усиливается с температурой. Очевидно, чем сильнее поражает тепловой шок, тем эффективнее он защищает семена от последующего облучения. Таким образом, изменения, вызванные в клетке каждым из этих факторов и приводящие в конечном счете к образованию хромосомных аберраций, в условиях нашего опыта «уничтожали» друг друга.

В таблице 7 сведены все основные результаты. Таблица составлена таким образом, чтобы легко прослеживалась зависимость температурных эффектов от влажности семян. При рассмотрении таблицы следует учесть что: I) варианты ОХ, ТО и ОТ сравниваются с фоновым вариантом 0, а варианты ОТХ и ТОХ — с вариантами ОТ и ТО соответственно- 2) в варианте ТОХ при Т = 60 °C усиление поражения.