Низкая селективность микробных сенсоров как основа для осуществления анализа многокомпонентных смесей

Детекция различных органических соединений — ростовых субстратов и продуктов ферментации на биотехнологических производствах, углеводов и спиртов в пищевой промышленности и клиническом анализе, а также ксенобиотиков при оценке состояния окружающей среды является важной для практических приложений задачей. Несмотря на то, что определение концентраций субстратов можно производить, используя методы современной аналитической химии (хроматография, масс-спектрометрия, оптические методы анализа и т. п.), интерес к разработке портативных, недорогих и удобных в работе анализаторов, позволяющих осуществлять быструю и точную детекцию органических веществ, по-прежнему высок. Это обусловлено, в первую очередь, сложностью и высокой стоимостью перечисленных типов анализа. В то же время исследования в области биосенсорной детекции открывают широкие возможности для конструирования аналитических систем (биосенсоров), отличающихся невысокой стоимостью. К преимуществам биосенсоров можно отнести малое время ответа, высокую специфичность определения, малый размер, удобство в работе, отсутствие специальных требований к приготовлению исследуемого образца, а также возможность анализировать окрашенные образцы.

Среди различных типов биосенсоров особое положение занимают микробные сенсоры. Уникальная комбинация ферментов или высокочувствительные физиологические рецепторы в клетках позволяют создавать измерительные системы, которые невозможно воспроизвести, используя отдельные ферменты. Микробные сенсоры также обладают меньшей чувствительностью к ингибиторам и лучше переносят отклонения рН и температуры, чем ферментные. Кроме того, для сенсоров на основе микроорганизмов, как правило, характерно большее время жизни и меньшая стоимость по сравнению с ферментными сенсорами.

Вместе с тем, для микробных сенсоров характерна широкая субстратная специфичность — чувствительность к большому количеству веществ. Для преодоления данного недостатка предлагается использовать набор сенсоров с различающимися характеристиками и элементы теории распознавания образов. Актуальность исследований.

Интенсивное развитие биотехнологического производства привело к появлению большого количества предприятий, в производственном цикле которых широко используются различные биологические вещества. В качестве примера можно привести получение этанола из гидролизата древесины, производство белково-витаминных л л препаратов на основе микробной биомассы, получение различных сахарозаменителей и т. п. Для эффективной трансформации веществ необходимо контролировать концентрации суГстрата и продукта, а также иногда и промежуточных метаболитов. Традиционные методы детекции, используемые в стационарных лабораториях (масс-спектрометрия, хроматография, модификации физико-химического анализа состава образца) достаточно эффективны, но довольно дороги и, к тому же, требуют наличия сложного оборудования и специально подготовленного персонала. Кроме того, при их использовании практически невозможно получение результатов в режиме реального времени.

Эффективным решением проблемы может оказаться применение биосенсоров для определения концентраций анализируемых веществ. С этой точки зрения перспективно использование микробных сенсоров. Микробные сенсоры обладают высокой ч увствительностью, не уступающей чувствительности ферментных сенсоров, и часто п ревосходят последние по стабильности. Кроме того, микробные сенсоры обладают рядом других преимуществ (простота получения биомассы, наличие готовых ферментных комплексов внутри клетки и т. п.). Основным препятствием для широкого использования микробных сенсоров является низкая селективность.

Подобная проблема существует при использовании химических сенсоров. В этом случае для повышения селективности используют набор сенсоров и различные математические процедуры. К настоящему времени накоплен значительный опыт по применению элементов теории распознавания образов (ТРО) для обработки данных, полученных при помощи набора химических сенсоров. Вместе с тем, использование подобного математического аппарата в области биосенсоров (и, в частности, микробных сенсоров) носит ограниченный характер. Применение элементов ТРО для обработки сигналов микробных сенсоров может существенно расширить область их применения, позволит осуществлять количественный анализ сложных смесей, а также сократить время л анализа.

Цель работы.

Цель данной работы состояла в разработке метода анализа многокомпонентной смеси при помощи микробных сенсоров. Для достижения указанной цели в работе решались следующие задачи:

1. Исследование поведения отдельных сенсоров при анализе образца, содержащего более одного субстрата.

2. Разработка и апробация методики анализа двухкомпонентных смесей (на примере смесей «глюкоза — этанол», «глюкоза — ксилоза») и идентификации состава смеси, содержащей до трех веществ (глюкоза, ксилоза, этанол).

3. Исследование эффективности аппроксимации ответов биосенсора уравнениями различного вида.

Научная новизна В ходе выполнения настоящей работы впервые получены следующие результаты: 1 На основе теоретического анализа физиологических и биохимических характеристик микроорганизмов культур Gluconobacter, Pichia, Hansenula и Escherichia сформированы измерительные системы для осуществления анализа двухкомпонентных смесей «глюкоза — этанол» и «глюкоза — ксилоза», а также трехкомпонентной смеси «глюкоза — ксилоза — этанол», включающие исключительно микробные сенсоры.

2. Разработана процедура определения концентраций составляющих смесь компонентов (на примере двухкомпонентных смесей «глюкоза — этанол» и «глюкозаксилоза»).

3. Показана возможность идентификации состава смеси, содержащей до трех компонентов (глюкозу, ксилозу и этанол) при помощи системы проточно-инжекционного.

Л Л типа, содержащей три микробных сенсора (для увеличения количества определяемых компонентов необходимо увеличение количества составляющих систему сенсоров).

4. Исследованы области линейности и аддитивности сигналов микробных сенсоров, 31 ание которых необходимо для упрощения калибровки сенсора.

5. Исследована возможность аппроксимации калибровочных зависимостей биосенсоров различного типа при помощи уравнения, аналогичного уравнению Хилла, а также рассмотрены источники ошибок в определении концентрации анализируемого всщества.

Практическая ценность.

Создана лабораторная модель 4х-канальной измерительной системы для анализа многокомпонентных смесей. Результаты исследования закладывают основы для конструирования аналитических систем типа «электронный язык» на базе микробных сонсоров. Использование микроорганизмов в рецепторных элементах позволяет создать измерительные системы для определения концентрации широкого спектра органических соединений, утилизируемых микробными клетками. Полученные в ходе выполнения работы результаты представляют практический интерес в связи с перспективами использования набора микробных сенсоров для контролябиотехнологических процессов.

Апробация работы.

Основные положения диссертационной работы были доложены на 2-ой и 3-ей городских конференциях молодых ученых (Путцино, Россия, 1997, 1998), Международной конференции Biocatalysis-98 (Pushchino, Russia, 1998), The fifth world congress on biosensors — Biosensors-98 (Berlin, Germany, 1998), Международной конференции «Молекулярная генетика и биотехнология», (Минск, Беларусь, 1998) — The sixth world coigress on biosensors — Biosensors-2000 (San Diego, USA, 2000) — The seventh world congress on biosensors — Biosensors-2002 (Kyoto, Japan, 2002). Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 8 статей, 7 сообщений в тезисной форме.

Структура и объем диссертации

.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения и обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Изложена на 112 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц, иллюстрирована 21 рисунками.

Список литературы

включает 116 наименований.

ВЫВОДЫ.

1. Предложен алгоритм анализа многокомпонентной смеси и последовательно изучены особенности метода на моделях, содержащих биосенсоры в комбинациях «ферментныйнеселективный микробный», «селективный микробный — неселективный микробный», «два неселективных микробных» и «три неселективных микробных» — для указанных моделей на основе теоретического анализа метаболических характеристик микроорганизмов выбраны штаммы Gluconobacter oxydans № 6, Escherichia coli F, Pichia methanolica MH4 и Hansenula polymorpha DL1, обладающие оптимальными параметрами для селективной оценки компонентов в смесях «глюкоза-этанол», «глюкоза-ксилоза», «глюкоза-этанол-ксилоза» .

2. Измерительная система, состоящая из ферментного электрода и микробного сенсора на основе бактерий G. oxydans, использована для проведения селективной оценки содержания глюкозы и этанола в смеси этих веществ. Среднеквадратичная ошибка определения концентрации составила для глюкозы -0.0033 мМ и для этанола -0.0005 мМ в диапазоне 0 — 0.3 мМ по каждому из субстратов.

3. Создана система двух микробных сенсоров с иммобилизованными клетками G. oxydans и P. methanolica для селективной оценки содержания глюкозы и этанола в смеси этих веществ. Применение искусственных нейронных сетей позволило осуществить селективный анализ в диапазоне концентраций от 0.5 мМ до 8 мМ по каждому из субстратов. Полученное значение коэффициента смешанной корреляции A2 составляет 0.99 для обоих веществ.

4. Измерительную систему двух микробных сенсоров на основе клеток G. oxydans и E. coli использовали для селективной детекции глюкозы и ксилозы в смеси этих компонентов. Значение коэффициента смешанной корреляции R2 составило 0.95 для концентрации глюкозы, и 0.91 — для ксилозы. Диапазон определяемых концентраций составляет от 0 мМ до 2.5 мМ по каждому из субстратов.

5. Разработан алгоритм анализа смеси «глюкоза-этанол-ксилоза». Показано, что система сенсоров на основе штаммов G. oxydons, Е. coli и H. polymorpha позволяет определить наличие или отсутствие каждого из компонентов.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Я искренне признателен и глубоко благодарен всем, кто способствовал улучшению данной работы ценными советами, обсуждением результатов, моральной поддержкой и т. д. Особую признательность я хотел бы выразить своим родителям за постоянную помощь и поддержку, Н. О. Дещеревской за помощь в осуществлении экспериментов, И. А. Борисову за консультации по нейронным сетям и своему научному руководителю А. Н. Решетилову. Благодарю также Б. И. Курганова, совместно с которой были проведены исследования по аппроксимации калибровочных зависимостей. Большое спасибо всем сотрудникам лаборатории биосенсоров, а также сотрудникам других лабораторий института, принимавших участие в обсуждении результатов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Анализ литературных данных показывает, что, несмотря на тот факт, что элементы теории распознавания образов эффективно используются для повышения селективности детекции многокомпонентных смесей при помощи набора химических сенсоров или спектрофотометрии, их применение для повышения селективности микробных сенсоров еще не получило должного распространения. Вместе с тем, именно микробные сенсоры являются одним из основных кандидатов на роль входных элементов подобной системы распознавания, поскольку: к IV.

1) именно для микробных сенсоров проблема низкой селективности стоит острее, чем для остальных биосенсоров;

2) наличие в микробных клетках большого количества разнообразных ферментов позволяет создавать сенсоры практически на любой утилизируемый клетками субстрат;

3) ряд других преимуществ микробных сенсоров (простота получения биомассы, возможность обслуживания измерительной установки неквалифицированным персоналом, возможность использования многостадийных реакций для осуществления анализа и пр.) повышают перспективность их использования для контроля биотехнологических процессов и мониторинга окружающей среды.

В связи с изложенным выше, представлялось целесообразным проведение исследований, направленных на осуществление селективного анализа многокомпонентных смесей при помощи системы микробных биосенсоров. Для этого были предприняты следующие шаги:

1. На первом этапе для реализации наиболее простого случая — анализа двухкомпонентной смеси «глюкоза — этанол» , — была использована измерительная система, состоящая из двух сенсоров. Первый сенсор представлял собой кислородный электрод, с иммобилизованными клетками Gluconobacter oxydans. В качестве опорного электрода был использован высокоселективный ферментный электрод на основе глюкозооксидазы. Концентрация глюкозы определялась при помощи ферментного электрода на основании ранее полученной калибровочной зависимости. По полученному значению концентрации глюкозы и величине ответа микробного сенсора по калибровочной зависимости определяли концентрацию этанола.

2. Второй этап заключался в переходе к системе, состоящей исключительно из микробных сенсоров. Для упрощения ситуации в качестве микробного сенсора был использован высокоселективный микробный сенсор на основе штамма Pichia methanolica, обладающий чувствительностью к этанолу, но не обладающий чувствительностью к глюкозе. Алгоритм определения концентраций практически не отличался от предыдущего этапа. Сначала при помощи селективного электрода (на основе Pichia methanolica) определяли концентрацию этанола, а затем по полученному значению концентрации и показаниям неселективного сенсора (на основе Gluconobacter oxydans) вычисляли концентрацию глюкозы. Использование полиномиальной аппроксимации позволило расширить диапазон анализируемых концентраций.

3. Также для обработки результатов эксперимента были применены искусственные нейронные сети. Это позволило получить значения концентраций компонентов смеси с высокой степенью точности (коэффициент смешанной корреляции составлял 0.99 для обоих субстратов). Кроме того, обучение нейронных сетей на накопленном экспериментальном материале позволило учесть изменение величины ответа сенсоров с течением времени.

4. На следующем этапе был реализован наиболее общий случай — для анализа двухкомпонентной смеси «глюкоза — ксилоза» была создана измерительная система на базе неселективных микробных сенсоров. При создании измерительной системы были использованы штаммы Gluconobacter oxydans и Escherichia coli. Для аппроксимации калибровочных зависимостей применили полиномы второй степени. Определение концентраций компонентов смеси осуществлялось при помощи решения системы уравнений методами вычислительной математики.

5. Завершающий этап исследований состоял в создании модели измерительной системы для анализа трехкомпонентной смеси. В качестве компонентов смеси были выбраны глюкоза, ксилоза и этанол. При создании рецепторных элементов использовались штаммы Gluconobacter oxydans, Escherichia coli и Hansenula polymorpha. Обработку экспериментальных данных проводили при помощи кластерного анализа. После проведения экспериментов по калибровке измерительной системы были выделены восемь кластеров, отражающих все возможные комбинации трех веществ. Характеристикой, на основании которой принималось решение о принадлежности образца к одному из кластеров, являлось расстояние от образца до центра кластера, описанная система позволяла успешно идентифицировать состав анализируемой смеси.

6. Кроме того, в ходе выполнения работы была исследована возможность аппроксимации калибровочных зависимостей биосенсоров различного типа при помощи уравнения, аналогичного уравнению Хилла.

Полученные в ходе ее выполнения результаты показали, что применение элементов теории распознавания образов (кластерного анализа, искусственных нейронных сетей) для обработки сигналов системы микробных биосенсоров позволяет осуществлять определение концентраций составляющих смесь веществ.