Роль РНК-интерференции в подавлении транскрипции ретротранспозонов и тандемных повторов у D. melanogaster

Общая характеристика работы 1.1. Актуальность проблемы В последнее время активно изучаются функции некодируюпщх РНК в регуляции экспрессии генов. Значительная часть генома эукариот транскрибируется с образованием РНК, не являющихся матрицами для синтеза белков. Одной из разновидностей некодирующих РНК являются молекулы двуцепочечной РНК (дцРНК) и образуемые в результате их процессинга «короткие РНК». дцРНК подавляют экспрессию гомологичных по нуклеотидной последовательности генов в ходе процесса РНК-интерференции (Fire et al., 1998). Способность дцРНК специфично репрессировать гомологичные гены широко применяется в настоящее время как метод функциональной геномики. В этом случае используются «экзогенные» дцРНК или короткие РНК, которые могут быть синтезированы in vitro или же транскрибироваться с интегрированных в геном конструкций (Наппоп, 2002; Нашюп, Rossi, 2004). Регуляторная роль эндогенных молекул дцРНК и коротких РНК долгое время оставалась невыясненной. Работы последних нескольких лет показали, что короткие РНК участвуют в регуляции экспрессии множества генов организма, а также в репрессии мобильных элементов и поддержании функциональной структуры протяженных участков генома (Наппоп, 2002; Аравин и др., 2002; Bartel, 2004; Lippman, Martienssen, 2004; Mello, Conte, 2004). Молекулярный механизм РНК-интерференции представляется следующим образом. Длинные молекулы дцРНК нарезаются в клетке нуклеазами семейства Dicer на короткие РНК длиной около 20−25 нуклеотидов (siPHK short interfering RNA). Затем siPHK могут включаться в состав РНП комплекса RISC (RNA induced silencing complex), который обеспечивает взаимодействие одной из цепей короткой РНК с комплементарньа1и молекулами РНК, присутствующими в цитоплазме клетки, в частности, мРНК (Наппоп, 2002; Аравин и др., 2002; Meister, ТизсЫ, 2004). Комплекс RISC осуществляет разрезание молекул мРНК-мишени в участках, полностью комплементарных коротким РНК, в результате чего мРНК деградирует. Механизм разрезания мРНК с помощью коротких РНК показан у больпшнства групп эукариот, включая животных, растения и микроорганизмы (Наппоп, 2002; Аравин и др., 2002). Наряду с постгранскрипционной репрессией мРНК в цитоплазме, короткие РНК могут подавлять транскрипцию гомологичного гена в ядре. РНП комплекс, содержащий siPHK, обозначемый в этом случае как RITS (RNA-induced initiation of transcriptional silencing) (Verdel et al., 2004), вызывает локальное изменение структуры хроматина (Stevenson, Jarvis, 2003; Lippman, Martienssen, 2004). У делящихся дрожжей S. pombe короткие РНК индуцируют метилирование лизинов К9 гистона НЗ в хроматине гомологичных генов (Volpe et al., 2002). У растений короткие РНК вызывают репрессию хроматина комплементарных им генов, происходящую как за счет метилирования гистонов, так и в результате метилирования цитозинов в ДНК (Mette et al., 2000). Возможность воздействия коротких РНК на хроматин гомологичных генов у животных остается мало изученной. Центральным компонентом всех РНП комплексов, содержащих короткие РНК (RISC, RITS), являются белки семейства Argonaute (Ago) (Hammond et al., 2001; Martinez, ТшсЫ, 2004; Liu et al., 2004; Verdel et al., 2004). Помимо Ago, в формировании У этих комплексов обнаружены участвует РНК-хеликазы 81РЬЖ, и другие РНКсвязывающие белки (Meister, TuscM, 2004). эукариот эндогенные соответствующие повторов могут последовательностям мобильных элементов и гетерохроматиновых Plasterk, 2003; Xie et al., 2004). Мобильные элементы (Djikeng et al., 2001; Llave et al., 2002aAmbros et al., 2003; Aravin et al., 2003; Sijen, часто транскрибироваться как в прямом, так и в обратном направлении, что приводит к образованию дцРНК. Противоположенное направление транскрипции может определяться собственными «антисмысловыми» промоторами транспозонов или находящимися рядом с инсерцией элемента внешними промоторами (Lankenau et al., 1994). Источником дцРНК является также гетерохроматин, в котором мобильные элементы накапливаются в больших количествах и могут располагаться во взаимопротивоположенной ориентации (Lippman et al., 2004). Наличие дцРНК, гомологичных мобильным элементам, позволяет клеточному аппарату РНКинтерференции подавлять их экспрессию, которая зачастую вредна для организма, поскольку приводит к транспозициям и, как следствие, мутациям и хромосомным перестройкам (Tijsterman et al., 2002; Гвоздев, 2003). Нарушение системы РНКинтерференции у различных организмов, приводит к дерепрессии мобильных элементов, в том числе, ретротранспозонов у Drosophila melanogaster (Aravin et al., 2001). Однако остается невыясненным, участвует ли аппарат РНК-интерференции в репрессии хроматина ретротранспозонов у дрозофилы, или подавление экспрессии происходит исключительно на посттранскрипционном уровне в результате деградации транскриптов. Помимо подавления экспрессии мобильных элементов, эндогенные siPHK участвуют в регуляции собственных генов D. melanogaster. В семенниках самцов дрозофилы дцРНК, образующаяся в результате симметричной транскрипции повторов Su (Ste), направляет репрессию гомологичных повторов генов Stellate (Aravin et al., 2001). Удаление повторов Su (Ste) вызывает гиперэкспрессию генов Stellate и накопление в клетках сперматоцитов белковых агрегатов, представляющих, по-видимому, продукт трансляции Stellate, что приводит к стерильности самцов (Palumbo et al., 1994; Bozzetti et al., 1995). Дерепрессия генов Stellate, происходящая в результате делеции локуса Su (Ste), сопровождается исчезновением коротких РНК Su (Ste) (Aravin et al., 2001). Данных о том, каким образом короткие РНК Su (Ste) подавляют экспрессию генов Stellate: на посттранскринционном уровне, или же на уровне транскрипции, не было получено. 1.2. Задачи исследования Целью настоящей работы являлось исследование возможной роли аппарата РНК-интерференции в подавлении транскрипции и формировании репрессивной структуры хроматина ретротранспозонов и повторенных генов Stellate. Были поставлены следующие задачи: 1. Сравнить уровень экспрессии ретротранспозонов при мутациях в генах РНК-интерференции в терминальных и соматических тканях D. melanogaster. 2. Сравнить структуру хроматина ретротранспозонов в норме и при нарушении аппарата РНК-интерференции. 3. Проверить возможную роль повторов Su (Ste) в регуляции транскрипции генов Stellate. 4. Выяснить значение промотора и транскрибируемой области генов Stellate для осуществления их репрессии повторами Su (Ste).3. Научная новизна результатов исследования Показана роль гена piwi, кодирующего консервативный белок семейства Argonaute, в регуляции экспрессии ретротранспозонов D. melanogaster. Обнаружено, что механизм РНК-интерференции направлен на репрессию ретротранспозонов, преимущественно, в клетках зародьппевого пути, но не в соматических тканях. Впервые продемонстрировано участие аппарата РНК-интерференции в формировании «молчащей» структуры хроматина ретротранспозонов у животных. Показано, что повторы Su (Ste), транскрибируемые с образованием дцРНК, подавляют транскрипцию гомологичных генов Stellate. В то же время обнаружено, что репрессия генов Stellate может происходить в отсутствии их собственного промотора, тогда как наличие гомологии с повторами Su (Ste) в транскрибируемой области Stellate необходимо для осуществления регуляции. Полученные данные впервые показывают роль «естественной» РНК-интерференции в регуляции транскрипции генов у животных. 1.4. Практическая ценность Полученные в работе данные позволяют приступить к детальному исследованию механизма модификации структуры хроматина, индуцируемой короткими РНК в герминальных тканях дрозофилы. Результаты исследования механизмов РНК-интерференции на D. melanogaster могут быгь распространены на клетки человека и использованы в биомедицинских исследованиях. 1.5. Апробация работы Работа апробирована на лабораторном семинаре в отделе молекулярной генетики клетки (ОМГК) ИМГ РАН и на кафедре Молекулярной биологии МГУ им. М. В. Ломоносова. Данные, представленные в работе, докладывались на 44 и 45 конференциях по дрозофиле (США, 2003, 2004), на конференциях, посвященных механизмам РНК-интерференции (Keystone symposia, США, 2002, 2003, 2004), на конференции «Современные проблемы молекулярной генетики» (ИМГ, 2002), на конференции по изучению гетерохроматина (Италия, 2003), на 3-ом Биохимическом Съезде (Санкт-Петербург, 2002) и на других конференциях (Киев, 2003: Пущине, 2003; Москва, 2004).Обзор литературы РНК-интерференция и репрессия хроматина 2.1. История иззения РНК-интерференции В 1998 году была обнаружена способность молекул дцРНК, инъецированных в организм нематоды elegans, эффисгивно подавлять экспрессию гомологичных по нуклеотидной последовательности генов (явление РНК-интерференции RNA interference, RNAi) (Fire et al., 1998; Timmons, Fire, 1998). Этот феномен был открыт в ходе экспериментов по подавлению генов при помощи искусственно синтезированных антисмысловых РНК. Предполагалось, что антисмысловая РНК в результате узнавания комплементарной мРНК препятствует ее трансляции. Антисмысловая РНК, действительно, снижала уровень экспрессии гомологичного гена, однако с очень низкой эффективностью. Оказалось, что инъекции контрольной смысловой РНК вызывают такой же эффект подавления экспрессии гена, как и инъекция антисмысловой РНК (Fire et al., 1998). Более тщательный анализ показал, что агентом, нарущающим экспрессию, является не смысловая или антисмысловая РНК, а двуцепочечная (дцРНК), небольщая доля которой образовывалась при транскрипции in vitro и присутствовала в качестве примеси в обоих препаратах. К тому времени был уже подробно исследован механизм действия дцРНК в клетках млекопитающих (Clemens, 1997), приводящий к прекращению трансляции всех мРНК, независимо от последовательности дцРНК. В отличие от эффекта дцРНК в клетках млекопитающих, РНК-интерференция степенью гомологии с введенной дцРНК. Первые эксперименты по РНК-интерференции у elegans выявили ряд характерных особенностей этого явления: дцРНК способна действовать в очень низких концентрациях. Расчеты показали, что эффеюивными оказываются концентрации, соответствующие всего нескольким молекулам дцРНК на клетку (Fire et al., 1998; Montgomery et al., 1998). у С elegans эффект подавления активности гена может наследоваться после инъекции дцРНК. В случае введения дцРНК, соответствующей гену, экспрессирующемуся в соматических тканях, эффект наследуется только в первом поколении и пропадает в последующих, однако в случае генов. 10 предполагает специфическое нарущение экспрессии только тех генов, которые обладают достаточно большой экспрессирующихся герминальных тканях, наследование может происходить в течение двух и более поколений (Grishok et al., 2000). эффективное подавление экспрессии наблюдалось только при использовании дцРНК, соответствующей экзонам, в том числе 5 и 3 нетранслируемьпл областям (UTR), но не нитронам или нетранскрибируемой промоторной части гена (Montgomery et al., 1998). Эти свойства позволили сформулировать первую модель РНКинтерференции, согласно которой дцРНК приводит к постгранскрипционной деградации гомологичной мРНК в цитоплазме, не затрагивая последовательность ДНК и структуру хроматина гена (т.е. не влияя на его транскрипцию) а также количество пре-мРНК в ядре. Субстехиометрическое действие дцРНК на мРНК объяснялось либо амплификацией активной формы сигнала, либо каталитическим действием дцРНК на многие молекулы мРНК, либо комбинацией обоих механизмов. В последующие годы эффективность РНК-интерференции была продемонстрирована у разнообразных животных (Kennerdell, Carthew, 1998; Lohmann et al., 1999; Ngo et al., 1998; Sanchez Alvarado, Newmark, 1999), a также у растений, грибов и простейших (см. для обзора Hannon, 2002; Аравин и др., 2003; Meister, Tuschl, 2004; Mello, Conte, 2004). Было предположено, что биологическое значение механизма РНКинтерференции состоит в борьбе с РНК-вирусами, которые могут реплицироваться с образованием дцРНК интермедиатов, а также в подавлении экспрессии и размножения подвижных элементов, для которых также обнаруживаются молекулы дцРНК (Tijsteraian et al., 2002). Уже сразу после открытия РНК-интерференция стала использоваться как мопщый и удобный способ специфического подавления экспрессии генов, исходя из их нуклеотидной последовательности, в том числе для массового скрининга генов (Bargmann, 2001; Barstead, 2001; Maeda et al., 2001; Piano et al., 2000). В настоящее время РНК-интерференция является одним из наиболее часто используемых подходов функциональной геномики (Hannon, Rossi, 2004; Novina, Sharp, 2004). Подавление экспрессии гена можно индуцировать как при помощи инъекций или другого способа доставки искусственно синтезированной дцРНК в организм, так и путем введения в геном трансгенных конструкций, кодирующих дцРНК. Одновременно начались исследования самого механизма РНК-интерференции с использованием как генетического, так и биохимического подходов. По мере выяснения действия дцРНК в клетках беспозвоночных оказалось, что феномен РНК11 интерференции имеет много общего с другим явлением, открытым за несколько лет до этого у растений косупрессией (Napoli et al., 1990; Van der Krol et al., 1990). Косупрессия была обнаружена в ходе опытов по трансгенозу растений дополнительными копиями генов с целью получить увеличение экспрессии и в результате необходимый фенотип. У трансгенных растений часто обнаруживалось не увеличение, а подавление экспрессии генов, причем в таких случаях оказывались подавленными не только введенные трансгены, но и нормально экспрессирующийся до этого клеточный ген, обладающий гомологией с введенными трансгенами (см. для обзора Baulcombe, 2004). Генетический подход к изучению РНК-интерференции и косупрессии у растений заключался в скринингах генов, необходимых для этих процессов (Ketting et al., 1999; Tabara et al., 1999; Fagard et al., 2000). Некоторые гены, мутации в которых нарушали процесс РНК-интерференции, оказались гомологичными генам, идентифицированным в скринингах на косупрессию. Оказалось, что такие гены кодируют белки, характеризующиеся наличием консервативных доменов, функции которых до этого не были известны (Tabara et al., 1999; Fagard et al., 2000). В дальнейшем, для этого семейства белков было принято обозначение Argonaute. Молекулярный механизм РНК-интерференции, на первых этапах, был исследован, в основном, с использованием бесклеточных систем, полученных из эмбрионов или культуры клеток Drosophila melanogaster (Tusclil et al., 1999; Zamore et al., 2000; Hammond et al., 2000; Bernstein et al, 2001; Elbashir et al., 2001a). Ha такой системе было показано, что искусственно синтезированная мРНК подвергается специфической деградации при добавлении в систему гомологичной дцРНК в ходе АТР-зависимой реакции (ТизсЫ et al., 1999; Zamore et al., 2000). Преинкубация дцРНК с экстрактом усиливала эффект РНК-интерференции, При проведении дальнейших экспериментов на бесклеточной системе оказалось, что при инициации РНК-интерференции происходит нарезание длинной молекулы дцРНК на короткие РНК размером 21−23 нт. (Zamore et al, 2000), а на следующем этапе осуществляется расщепление соответствующей мРНК (Hammond et al., 2000; Zamore et al., 2000). Короткие молекулы РНК размером около 25 нуклеотидов были обнаружены также при изучении косупрессии у растений (Hamilton, Baulcombe, 1999). В этой работе было показано, что при различных случаях косупрессии, индуцированной трансгенами, в клетках растений обнаруживаются короткие смысловые и антисмысловые РНК, соответствующие по последовательности матричной РНКмишени, причем количество коротких РНК коррелирует с силой косупрессии. 12 Впоследствии, оказалось, что именно короткие РНК, образуюпщеся из длинных дцРНК дуплексов, являются активной формой сигнала при РНК-интерференции у животных и косупрессии у растений. Благодаря специально разработанной схеме удалось клонировать короткие РНК, образующиеся при процессинге дцРНК в бесклеточной системе из эмбрионов дрозофилы, оказалось, что около половины из них имеют размер 21 нт. (Elbashir et al., 2001а). Детальный анализ образующихся в результате процессинга дцРНК коротких РНК-дуплексов показал, что они характеризуются строго определенными параметрами: присутствием 5-концевого фосфата, З-концевой гидроксильный группы, а также 2 нт. выступающих 3 концов (Zamore et al., 2000; Elbashir et al., 2001a). Искусственно синтезированные дуплексы коротких РНК с 2-нт. выступающими 3 концами оказались эффективными в индукции РНК-интерференции у различных организмов, включая млекопитающих (Caplen et al., 2001; Elbashir et al., 2001b), У млекопитающих короткие РНК не вызывают неспецифичного интерферонового ответа, в отличие от более протяженных молекул дцРНК, а приводят к специфичной деградации гомологичных мРНК. Это позволило проводить дальнейшее изучение молекулярного механизма РНК-интерференции, в том числе и на культуре клеток млекопитающих (Elbashir et al., 2001bMartinez et al., 2002; Chiu, Rana, 2002). Наличие у продуктов процессинга дцРНК 5-концевой фосфатной группы и 3концевого гидроксильного остатка свидетельствовало, что фермент, осуществляющий расщепление дцРНК при РНК-интерференции в эукариотических клетках, аналогичен эндорибонуклеазе РНКазе Ш прокариотическому ферменту, который расщепляет дцРНК. Такой фермент, найденный у многих видов бактерий и наиболее хорошо изученный у E. coli, играет роль в процессинге РНКпредшественников рибосомальной РНК (Fierro-Monti, Mathews, 2000). Анализ геномов D. melanogaster и C. elegans показал, что у этих организмов присутствуют гены, кодирующие домен РНКазыШ (Bernstein et al., 2001). Соответствующие белки, кроме того, содержат домены связывания дцРНК (dsRBD) (Fierro-Monti, Mathews, 2000). Функции одного из таких белков D. melanogaster были исследованы на системе in vitro (Bernstein et al., 2001). Добавление очищенного белка к дцРНК в присутствии АТР приводило к расщеплению субстрата на короткие 21−23 нт. РНК. Обнаруженная нуклеаза получила название Dicer (от англ. to dice нарезать в форме кубиков) (Bernstein et al., 2001). Дальнейшие исследования показали консервативную 13 роль белков семейства Dicer процессинге дцРНК и образовании коротких РНК во всех группах эукариот. Было продемонстрировано, что белки Dicer ответственны за производство коротких РНК у растений (Park et al., 2002; Finnegan et al., 2003), нематоды (Ketting et al., 2001; Knight, Bass, 2001; Grishok et al., 2001), дрозофилы и млекопитающих (Hutvdgner, et al., 2001; Zhang et al., 2002; Provost et al., 2002). Комплекс, осуществляющий деградацию мР1Ж, был впервые вьщелен из культуры клеток дрозофилы. Этот комплекс получил название RISC (RNA-induced silencing complex), так как было показано, что он содержит короткие РНК, образованные белком Dicer на предыдущей стадии РНК-интерференции (Hammond et al., 2000; Zamore et al., 2000). Обнаружение коротких РНК в процессах РНК-интерференции и косупрессии не было беспрецедентным. У elegans задолго до этого была найдена эндогенная короткая РНК Ип-4 длиной 22 нт. (Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993). Было обнаружено, что lin-4 РНК является частично комплементарной к нескольким повторенным участкам в 3 UTR гена Ип-14, кодирующего белок, необходимый для раннего онтогенеза у С elegans, и экспрессирующийся только на строго определенной стадии развития (Lee et al., 1993; Wightman et al., 1993). При этом, оказалось, что комплементарные lin-4 последовательности в 3 UTR Ип-14 необходимы для регуляции экспрессии мРНК lin-14, а именно, для подавления ее трансляции на определенном этапе онтогенеза. Еще одна короткая РНК (let-7) длиной 22 нт., участвующая в регуляции трансляции мРНК другого «развитийного» гена у С elegans, была обнаружена в 2000 году (Reinhart et al., 2000; Slack et al., 2000). После открытия коротких РНК в процессе РНК-интерференции, стало понятно, что РНК lin-4 и Ш-7 могут образовываться из дцРНК предшественников с помощью такого же механизма, как и короткие РНК при РНК-интерференции, что, действительно, бьшо показано (Knight, Bass, 2001; Grishok et al., 2001; Hutvagner et al., 2001; Ketting et al., 2001). В результате клонирования коротких РНК из различных растений и животных было обнаружено, что у большинства многоклеточных эукариот существуют сотни видов эндогенных коротких РНК, участвующих в регуляции экспрессии определенных генов в ходе развития организмов (так назьшаемые микроРНК) (Pasquinelli et al., 2000; Lagos-Quintana et al., 2002; BashiruUah et al., 2003; Lim et al., 2003). МикроРНК регулируют экспрессию своих мРНК-мишеней либо за счет подавления их трансляции, либо за счет разрезания (см. для обзора Battel et al., 2004). Было показано, что тот или иной путь подавления определяется тем, насколько короткая молекула РНК комплементарна 14 мРНК-мишени. При полной комплементарности короткая РНК осуществляет разрезание гомологичной молекулы РНК, тогда как в случае частичной комплементарности происходит подавление трансляции (Hutvagner, Zamore, 2002), Эта закономерность наблюдается как для искусственно синтезированных коротких РНК-дуплексов, так и для эндогенных микроРНК (Hutvagner, Zamore, 2002; Saxena et al., 2003; Llave et al., 2002b). До некоторого момента все исследования механизма РНК-интерференции у животных были сфокусированы на изучении роли коротких РНК в посттранскрипционной репрессии комплементарных молекул мРНК, происходящей в результате их разрезания или подавления трансляции, В то же время, у растений было обнаружено, что молекулы дцРНК, наряду с репрессией мРНК в цитоплазме, могут подавлять транскрипцию гомологичного гена, вызьшая метилирование цитозинов в составе ДНК (Mette et al., 2000), Это явление было названо РНКзависимым метилированием ДНК, Позже было продемонстрировано, что короткие молекулы РНК могут индуцировать метилирование гистонов и формирование гетерохроматина у делящихся дрожжей S. ротЬе (Volpe et al., 2002; Schramke, AUsliire, 2003). Таким образом, бьш выявлен принципиально иной механизм действия дцРНК, который, однако, также предполагает специфическое влияние коротких РНК на экспрессию гомологичного гена. В настоящем обзоре кратко рассматривается механизм РНК-интерференции, происходящей на посттранскрипционном уровне, и более детально обсуждается участие дцРНК в подавлении транскрипции и репрессии хроматина. 2.2. Современные представления о механизме РНК-интерференции Общая модель механизма РНК-интерференции предполагает существование двух основных стадий (рис. 1), На первой стадии длинные молекулы дцРНК подвергаются в цитоплазме клеток процессингу нуклеазами семейства Dicer с образованием коротких РНК-дуплексов длиной 20−25 нт. (размер коротких РНК варьирует в зависимости от организма и типа коротких РНК). Короткие РНКдуплексы, как уже упоминалось, имеют структурные особенности, которые задаются белком Dicer и строго необходимы для функциональной активности коротких РНК: одноцепочечные выступающие динуклеотидные 3 ОН концы и фосфорилированные 5 концы (Bernstein et al., 2001; Elbashir et al., 2001a). Ha второй стадии происходит 15 расплетание дуплекса коротких РНК и одна из цепей включается в состав эффекторных РНП-комплексов. Короткая РНК в составе РНП-комплекса обнаруживает в клетке комплементарные ей нуклеиновые кислоты (мишени), после чего эффекторный комплекс катализирует ту или иную реакцию, направленную на подавление экспрессии мишени (рис. 1). Можно выделить 3 основных разновидности эффекторных РНП-комплексов, содержащих короткие РНК: комплекс RISC, осуществляющий разрезание РНК-мишени (которой может быть как мРНК, так и любая другая одноцепочечная РНК) — комплекс, направляющий подавление трансляции мРНК также обозначается как RISCа в том случае, если содержит микроРНК, обозначается как микроРНПкомплекс RITS, осуществляющий подавление транскрипции и репрессию хроматина. Комплексы RISC и микроРНП функционируют в цитоплазме, а комплекс RITS в ядре (рис. 1). Во всех случаях специфичность действия эффекторных определяется спариванием комплементарных нуклеиновых комплексов При кислот. посттранскрипционном механизме репрессии (комплексы RISC и микроРНП) спаривание происходит между короткой РНК и комплементарным участком в РНКмишени. В случае же комплексов RITS, обнаруживающих гомологичный локус в геноме, природа комплементарного взаимодействия остается невыясненной. Возможны два варианта того, как короткая РНК в составе RITS комплекса может «узнать» гомологичный ген (Verdel et al., 2004). Первый механизм предполагает гибридизацию молекулы короткой РНК непосредственно с ДНК. Второй возможный способ состоит в том, что короткая РНК взаимодействует с новообразованной (насцентной) РНК в ходе ее транскрипции или сразу после. Если в этот момент насцентная РНК находится в пространственной близости от кодирующего ее гена, то RITS комплекс может привлекать белки, осуществляющие репрессию хроматина этого гена и, следовательно, подавление транскрипции. Причины, определяюпще, в какой из трех типов эффекторных комплексов будет включаться короткая РНК после образования, остаются мало изученными. Мультибелковые эффекторные комплексы (RISC, микроРНП и RITS) различны по составу входящих в них белков, однако все они содержат белки семейства Argonaute (Ago) (Hammond et al., 2001; Окатш-а et al., 2004; Sigova et al., 2004; Verdel et al., 2004; Martinez, Tuschl, 2004; Liu et al., 2004). Гены, кодирующие белки этого семейства, были идентифицированы в 16 первых генетических скринингах компонентов РНК-интерференции, косупрессии и других процессов подавления генной экспрессии с участием дцРНК («РНК сайленсинга») у эукариот (ТаЬага et al., 1999; Fagard et al., 2000; Carmell et al., 2002; Catalanotto et al., 2002). Ha настоящий момент консервативные белки семейства Argonaute обнаружены у архей и практически у всех эукариот, за исключением почкующихся дрожжей S. cerevisiae. Мутации в генах, кодирующих Argonaute, нарушают дцРНК-зависимую деградацию мРНК (Hammond et al., 2001; Liu et al., 2004; Williams et al., 2002; Tabara et al., 1999; Okamura et al., 2004; Sigova et al., 2004), подавление трансляции при помощи коротких РНК (Bartel, 2004; Okamura et al., 2004; Grishok et al., 2001), a также вьпванное короткими РНК подавление транскрипции (Fagard et al., 2000; Volpe et al., 2002; Zilberaian et al., 2003), Различные группы эукариот имеют свои уникальные особенности аппарата РНКинтерференции. В частности, различия состоят в присутствии тех или иных эффекторных комплексов (таблица 1). Механизм разрезания мРНК с участием комплекса RISC показан у всех основных эукариотических модельных объектов (ТизсЫ et al., 1999; Elbashir et al., 2001aSigova et al., 2004). Механизм подавления трансляции обнаружен у большинства эукариот, но не у делящихся дрожжей S. pombe. Возможность подавления транскрипции генов с помощью дцРНК прямо показана, на данный момент, лишь для растений, S. pombe и на культуре клеток человека. На этих объектах было продемонстрировано, что образование коротких РНК, соответствующих активно транскрибируемому гену, приводит к снижению транскрипции, которое коррелирует с увеличением количества метилированных гистонов и, в случае растений и человека, с метилированием ДНК (Schramke, Allshire, 2003; Zilberman et al., 2003; Kawasaki, Taira, 2004). Прямой индукции транскрипционной репрессии при помощи гомологичной дцРНК у нематоды и дрозофилы показано не было. Тем не менее, ряд косвенных данных свидетельствует о том, что аппарат РНК-интерференции у этих организмов может влиять на структуру хроматина некоторых типов последовательностей (Pal-Bhadra et al., 2004; Grishok et al., 2005; Robert et al., 2005). 17 Dicer двунитевая РНК Dicer РНК шпилька расщепление и деградация мРНК подавление трансляции мРНК репрессия хроматиид II Чподявление транскрипции Г" Я в ЗДр| Рис. 1. Общий механизм РНК-интерференции. Молекулы дцРНК представляют собой РНК-шпильку или две комплементарные отожженные друг на друга цепи РНК. Длинные молекулы дцРНК нарезаются (процессируются) в клетке нуклеазами семейства РНКазы III Dicer на короткие двунитевые РНК длиной 20−25 нуклеотидов (siPHK short interfering RNAs). siPHK могут включаться в состав белкового комплекса RISC, который «выбирает» одну из комплементарных цепей РНК и обеспечивает ее взаимодействие с гомологичной мРНК. RISC осуществляет разрезание молекул мРНК-мишени в участках, полностью комплементарньпс коротким РНК, в результате чего мРНК деградирует. Если siPHK имеют несколько неспаренных с мРНК нуклеотидов, то мРНК не разрезается, но перестает транслироваться. Короткие РНК могут также осуществлять репрессию хроматина и подавление транскрипции гомологичного по нуклеотидной последовательности гена в ядре. Природа комплементарного взаимодействия (РНК-РНК или РНК-ДНК) в этом случае остается невыясненной. 18 Посттранскрипционная Объект регуляция (расщепление мРНК) Подавление трансляции подавление транскрипции (репрессия хроматина) 5″. pombe А. thaliana 9 9 elegans D. melanogaster H. sapiens Таблица 1. Распространение различных мезанизмов подавления экспрессии генов с участием коротких РНК у основных эукариотических модельных объектов Существуют некоторые другие аспекты механизма РНК-интерференции, характерные лишь для некоторых групп эукариот. Так, у elegans было обнаружено явление распространения сигнала РНК-интерференции, состоящее в том, что подавление экспрессии гена может происходить в любой ткани независимо от того, в какую ткань исходно была инъецирована дцРНК (Winston et al., 2002; Feinberg, Hunter, 2003). Например, введение в мьппечную ткань дцРНК, соответствующей последовательности мРНК зеленого белка GFP, приводит к подавлению экспрессии трансгена в нервной ткани. Явление распространения сигнала РНК-сайленсинга известно также у растений (Voinnet, Baulcombe, 1997; Baulcombe, 2004). У С elegans был идентифицирован трансмембранный белок S1D1, формирующий, по-видимому, активные межклеточные каналы для транспорта дцРНК (Winston et al., 2002). В то же время, у D. melanogaster такого механизма обнаружено не было, то есть у дрозофилы РНК-интерференция происходит «автономно» только в тех клетках, в которых присутствует дцРНК, инициирующая репрессию (Roignant et al., 2003). Интересно, что введение в геном дрозофилы трансгена, кодирующего белок 8Ш-1 из elegans, позволяет осуществлять 19 транспорт дцРНК между клетками и обеспечивает распространение сигнала РНКинтерференции у дрозофилы (Feinberg, Hunter, 2003). При РНК-интерференции у S. ротЪе, elegans и растений показана возможность зависимыми амплификации сигнала, (RdRp осуществляемой RNA-directed клеточными RNA РНКРНК-полимеразами polymerase), кодируемыми в геномах этих организмов (Smardon et al., 2000; Dalmay, et al., 2000; Mourrain et al., 2000; Volpe et al., 2002). RdRp способна синтезировать дцРНК на матрице однонитевой РНК. В некоторых случаях в качестве затравки для синтеза RdRp может использовать антисмысловую короткую РНК (Sijen et al., 2001аVaistij et al., 2002). Продукты реакции удлинения сами также представляют собой дцРНК. В соответствии с этим, они должны подвергаться дальнейшему процессингу с образованием «вторичных» молекул коротких РНК. Действительно, образование вторичных коротких РНК, не гомологичных исходной дцРНК, было показано при РНК-интерференции у С elegans (Sijen et al., 2001a). При этом было отмечено, что вторичные короткие РНК соответствуют исключительно 5 области относительно исходного сегмента дцРНК, что полностью соответствует модели праймирования мРНК первичными короткими РНК. Существование вторичных коротких РНК было доказано в элегантных экспериментах на С elegans (Sijen et al., 2001aAlder et al., 2003). Была обнаружена способность дцРНК осуществлять деградацию некомплементарных последовательностей. При наличии в организме трансгена, состоящего из двух сегментов, инъекция дцРНК к одному из них приводила к деградации мРНК гена, содержащего только один из сегментов, который не соответствовал по последовательности инъецированной дцРНК. Этот феномен был назван транзитивной (transitive) РНК-интерференцией (Sijen et al., 2001аAlder et al., 2003). Транзитивная РНК-интерференция имеет определенную направленность: деградации подвергается только сегмент, расположенный 5 (upstream), относительно исходной дцРНК, но не 3 (downstream). В то же время гены, кодирующие RdRp, не обнаружены в геномах дрозофилы и млекопитающих. Для этих организмов показано отсутствие возможности амплификации сигнала и транзитивной РНК-интерференции (Schwarz et al., 2002) 20 .3. Эндогенные короткие РНК у эукариот Эндогенные короткие РНК были выявлены, в основном, с помощью технологии «клонирования», которая состоит в получении кДНК библиотек всех клеточных РНК, находящихся в диапазоне размеров от 20 до 25 нт. и содержащих 3 ОН и 5 фосфат (Battel et al., 2004). Выделяют два класса эндогенных коротких РНК у эукариот: микроРНК и siPHK (short interfering RNA). МикроРНК образуются нуклеазой Dicer из кодируемых в геномах животных и растений РНК-предшественников, имеющих структуру шпильки. МикроРНК всегда представляет олигонуклеотид строго определенной последовательности, собой которая детерминируется структурой шпилечного предшественника (Battel et al, 2004). В отличие от микроРНК, вырезаемых из предшественника-шпильки по строго определенным позициям, siPHK представляют собой статистический набор олигонуклеотидов, образующихся при процессинге длинных молекул дцРНК. Все короткие РНК, имеющие искусственное происхождение, в том числе искусственно синтезированные короткие РНК-дуплексы, принято также называть siPHK. Микро РНК обнаружены у животных и растений (Bartel et al., 2004). Напрмер, у D. melanogaster бьшо выявлено 77 генов, кодирующих 71 уникальную микроРНК (Aravin et al., 2003; Lai et al., 2003). У человека обнаружено около 200 генов микроРНК (Griffiths-Jones, 2004). Многие микроРНК консервативны около 1/3 микроРНК elegans имеют близкие гомологи у человека, отличающиеся не более чем на несколько нт., (Bartel et al., 2004). Некоторые микроРНК кодируются в нитронах генов, тогда как другие находятся в составе самостоятельных транскрипционных единиц. МикроРНК участвуют в регуляции экспрессии различных мРНК, связываясь, как правило, с комплементарными сайтами в 3 нетраслируемых областях. Так же как и siPHK, микроРНК могут разрезать мРНКмишень, если их нуклеотидные последовательности полностью комплементарны, или останавливать трансляцию, если комплементарность частичная (рис. 2) (Bartel et al., 2004; Hutvagner, Zamore, 2002). Описаны экзотические случаи, когда у растений микроРНК, комплементарная промотору, может подавлять транскрипцию гена (Вао et al., 2004). Мишенями микроРНК являются различные клеточные мРНК. Особенно большое число мишеней микроРНК бьшо обнаружено среди мРНК тканеспецифичных транскрипционных факторов, активных на определенных этапах 21 онтогенеза (Bartel et al., 2004). Мишени для большинства микроРНК остаются не идентифицированными. Эндогенные siPHK соответствуют, в основном, последовательностям различных мобильных элементов и гетерохроматиновых повторов (Llave et al., 2002аAravin et al., 2003). Известно крайне мало siPHK, соответствующих последовательностям «нормальных» генов организма. Этот факт представляется удивительным, поскольку существует огромное количество примеров транскрипщ1И генов в двух направлениях, в том числе, в одних и тех же клетках. 2.4. Процессинг дцРНК образование коротких РНК Ферменты, осуществляющие процессинг дцРНК, относятся к семейству Dicer и содержат домены РНКазы III и дцРНК связьтающие домены (Bernstein et al., 2001; Grishok et al., 2001; Basyuk et al., 2003; Lee et al., 2003; Lee et al., 2004). Образование микроРНК происходит в два этапа (рис. 2). На первом этапе нуклеаза Drosha, также как и Dicer, несущая домены РНКазы III осуществляет разрезание первичного транскрипта микроРНК с образованием шпилечного предшественника, имеющего, обычно, длину около 70 нт. (Lee et al., 2002; Lee et al., 2003). Этот этап происходит в ядре клетки. Предшественники микроРНК переходят затем в цитоплазму при участии экспортина 5 через ядерный канал-рецептор (Bohnsack et al., 2004; Lund et al., 2004; Yi et al., 2003). Белки семейства Dicer, активные в цитоплазме, участвуют в формировании зрелых микроРНК из шпилечных предшественников (рис. 2). Образование siPHK из длинных молекул дцРНК также осуществляют белки Dicer в цитоплазме (Lee et al., 2004; Xie et al., 2004). Многие эукариотические нуклеазы, процессирующие дцРНК, работают в гетеродимерных комплексах с дцРНК связывающими белками Drosha в клетках человека с DGCR-8 (Gregory et al., 2004; Han et al., 2004aLandthaler et al., 2004), у D. melanogaster с Pasha (Denli et al., 2004) — Dicer в растениях работают вместе с HYL1 и HEN1 (Boutet et al., 2003; Vazquez et al., 2004) — в клетках человека с TRBP (Chendrimada Т. et al., 2005) — у C. elegans с Rde4 (Tabara et al., 2002) — у D. melanogaster с R2D2 (Liu et al., 2003) или Loq (Forstemann et al., 2005; Saito et al., 2005). Белок HENl в растениях необходим для метилирования 2ОН рибозы последнего нуклеотида на 3 конце микроРНК (Yu et al., 2005). В других случаях, дцРНК связьшающие белки нужны, очевидно, для инициации сборки эффекторного 22 комплекса (Forstemann К. et al., 2005; Liu et aL, 2003; Saito et al., 2005; Tabara et al., 2002), a также для выбора, какая из цепей дуплекса siRNA будет входить в состав RISC (Tomari et al., 2004a). У некоторых организмов показано существование нескольких белков Dicer, которые имеют различные функции. У D. melanogaster обнаружено два паралога: Dicer 1 продуцирует преимущественно микроРНК (Lee et al., 2004) и Dicer 2 необходим для нарезания длинных молекул дцРНК на siPHK (Lee et al., 2004; Liu et al., 2003; Pham et al., 2004). ген м и к р о Р Н К -1ервичный транскрипт ц" ни1||||||Ц|ша1|и< И1"Г1И11,ШГ111 111И111,11ц] шпилечный предшественник полная комплементарность микроРНК-мРНК частичная комплементарность микроРНК и З-UTR мРНК Рис. 2. Механизм образования и функционирования микроРНК. На первом этапе в ядре клетки нуклеаза Drosha осуществляет разрезание первичного транскрипта микроРНК с образованием шпилечного предшественника, имеющего, обычно, длину около 70 нт. Белки семейства Dicer активны в цитоплазме, участвуют в формировании зрелых микроРНК из шпилечных предшественников. Лишь одна из двух цепей в дуплексе микроРНК включается в состав RISC, вторая деградирует. 23 .5. Разрезание мРНК и подавление трансляции, направляемое короткими РНК Лишь одна из двух цепей в дуплексе коротких РНК включается в состав RISC. Выбор цепи, которая будет включаться в Ш8С, определяется термодинамическими особенностями расплетания дуплекса (Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003). Для расплетания дуплекса с разных концов затрачивается разная энергия. Выбор цепи осуществляется в пользу той одноцепочечной РНК, 5 конец которой находится со стороны дуплекса, наиболее энергетически вьподной для расплетания (Khvorova et al., 2003; Schwarz et al., 2003). Одноцепочечная короткая РНК в составе RISC узнает гомологичную мРНК, после чего RISC разрезает мишень ровно посередине участка комплементарности между siPHK и мРНК (Elbashir et al., 2001а). На этапе расплетания дуплекса предполагается возможное участие РНК-хеликаз. Центральным белковым компонентом комплекса RISC являются белки семейства Argonaute (AGO) (Hammond et al., 2001; Martinez, Tuschl, 2004; Liu et al., 2004), характеризующиеся наличием доменов PAZ и PIWI (Cerutti et al., 2000). Функция PAZ домена состоит в специфическом связьшании siPHK (Song et al., 2003; Lingel et al., 2004; Ma et al., 2004). Главным вопросом при изучении RISC долгое время бьш поиск гипотетической нуклеазы, осуществляющей разрезание мРНК. Рентгеноструктурный анализ белка Argonaute из архей показал, что структура домена PIWI схожа со структурой РНКазы Н, осуществляющей разрезание РНК в РНК-ДНК дуплексах (Song et al., 2004) (рис. 3). Эти данные позволили предположить модель, согласно которой PIWI домен вьшолняет роль нуклезы в комплексе RISC (рис. 3). Белок AG0−2 у человека может осуществлять расщепление мРНК (Liu et al., 2004; Meister et al., 2004). Однако 3 других белка, принадлежащих к семейству Argonaute у человека, оказались не способны направлять нуклеазную реакцию, несмотря на то, что они содержат те же аминокислоты в предполагаемом активном центре домена PIWI, что и AG02 (Liu et al., 2004; Meister et al., 2004). Предполагается, что другие члены семейства Argonaute человека могут вьшолнять другие функции, в частности, подавление трансляции. Различные функции белков Argonaute показаны у D. melanogaster. белок Agol участвует в трансляционной репрессии, направляемой микроРНК, тогда как белок Ago2 осуществляет разрезание мРНК-мишеней (Okamura et al., 2004). Для двух других белков дрозофилы, также принадлежащих к семейству Argonaute (PIWI и AUB) показано участие в поддержании стабильности комплексов коротких РНК (Pal-Bhadra et al., 2002; 24 Aravin et al., 2004), однако их конкретные биохимические функции остаются невыясненными. Помимо AGO, в составе RISC комплексов у различных организмов был обнаружен ряд других белков. В комплексе RISC дрозофилы были найдены РНКсвязывающие белки VIG, dFXR, стафилококковая-микрококковая нуклеаза TudorSN, DEAD-box РНК-хеликаза RM62, а также рибосомальные белки (Caudy et al., 2002; Caudyetal., 2003). Обнаружение рибосомальных белков в составе RISC, а также тот факт, что, что RISC у дрозофилы и простейших ассоциирован с полисомами (Caudy et al., 2002; Hammond et al., 2001; Ishizuka et al., 2002; Kennerdell et al., 2002; Djikeng et al., 2001; Shi et al., 2004b), указывает на сходство (или даже на идентичность) комплексов, осуществляющих подавление трансляции и расщепление мРНК. Механизм подавления трансляции с помощью коротких РНК изучен намного хуже, чем разрезание мРНК. Трансляция блокируется более вероятно на стадии элонгации или терминации, чем на стадии инициации (Olsen, Ambros, 1999; Seggerson et al., 2002). Рис. 3. Схема белка Argonaute в комплексе с 81РЬЖ и мРНК-мишенью (Song et al., 2004). PAZ домен специфично удерживает 3 конец 81Р1Ж, PIWI домен привносит разрыв в комплементарный участок мРНК. 25 .6. Репрессия хроматина, направляемая короткими РНК 2.6.1. Общие представления о структуре хроматина Модификации гистонов в составе нуклеосом являются универсальным способом регуляции структуры хроматина и транскрипции генов эукариот. Разнообразие возможных модификаций гистонов и их сочетаний позволяет создать так называемый «гистоновый код» эпигенетические метки, специфически узнаваемые активирующими или репрессирующими факторами (Jenuwein, Allis, 2001). Например, одной из важных модификаций, характерной для неактивного хроматина, является метилирование лизина (К) гистона НЗ по положению 9 от Nконца молекулы МеШз (К9) (Litt et al., 2001; Peters et al., 2001; Nakayama et al., 2001). Напротив, в составе хроматина активно транскрибируемых генов гистон НЗ имеет, как правило, ацетилированный лизин 9 АсНз (К9), а также метилированный К4 МеНз (К4). Эти, а также многие другие модификации гистонов вьшолняют сходные функции репрессии или активации генов у дрожжей, нематоды elegans, дрозофилы, млекопитающих и растений (Lachner, Jenuwein, 2002; Strahl, Allis, 2000; Zhang, Reinberg, 2001; Kouzandes, 2002; Lachner et al., 2003). Неактивный хроматин у растений, некоторых грибов и у позвоночных, наряду с MetH3(K9), может быть ассоциирован с наличием 5-метил-цитозина в составе ДНК, что способствует дополнительной более глубокой репрессии. Однако метилирование ДНК является менее консервативным в эволюции способом эпигенетической регуляции по сравнению с «гистоновым кодом» и отсутствует (или практически отсутствует) у дрожжей, нематоды и дрозофилы (Bird, 2002; Tariq, Paszkowski, 2004; Lyko, 2001). Геномы эукариот содержат протяженные области активно транскрибируемого эухроматина и «молчащего» компактизованного гетерохроматина, который.

6. выводы.

Исследована роль аппарата РНК-интерференции в подавлении транскрипции и формировании репрессивной структуры хроматина ретротранспозонов и повторов семенник-специфичных генов Stellate у Drosophila melanogaster.

Установлено, что:

1. Мутация в гене piwi, кодирующем белок семейства Argonaute, приводит к увеличению количества транскриптов LTR-содержащих и LTR-несодержащих эндогенных ретротранспозонов. Мутации в генах РНК-интерференции piwi и spn-E вызывают возрастание экспрессии репортерной конструкции LTRcopia-lacZ. Дерепрессия эндогенных ретротранспозонов и конструкции LTRcopia-lacZ при мутациях piwi и spn-E происходит преимущественно в терминальных тканях дрозофилы.

2. Нарушение аппарата РНК-интерференции, вызванное мутацией в гене spn-Е, приводит к декомпактизации хроматина ретротранспозонов в яичниках, ассоциированной с увеличением количества ацетилированных по положению К9 гистонов НЗ и возрастанием количества компонента транскрипционного комплекса TFIID TAF250 (TAF1) в промоторах ретротранспозонов.

3. Удаление повторов Su (Ste), образующих короткие РНК, приводит к увеличению количества несплайсированных транскриптов паралогичных генов Stellate. Копии генов Stellate, расположенные в сайте 12Е, подвергаются более сильной дерепрессии при удалении Su (Ste) по сравнению с генами Stellate, находящимися в конститутивном гетерохроматине. Полученные данные указывают на существование механизма репрессии транскрипции Stellate с помощью коротких РНК.

4. Для осуществления репрессии генов Stellate локусом Su (Ste) необходимо наличие гомологии с Su (Ste) в транскрибируемой области генов Stellate. Регуляция экспрессии гена Stellate может осуществляться в отсутствии собственного промотора — если транскрипция направляется гетерологичным промотором.