Фармако-токсикологические свойства и применение левотила при колибактериозе телят

Актуальность темы

В настоящее время возрастает значение фарма-копрофилактики и лечения болезней сельскохозяйственных животных в связи с появлением инфекций со сложной этиологией, обусловленной повышением вирулентности условно-патогенных микроорганизмов. Часто эти болезни имеют общую симптоматику поражения дыхательных путей или пищеварительного тракта, приобретают характер смешанных инфекций, отличающихся от классических форм проявления той или иной болезни, осложненным течением. (В.А.Мищенко с соавт., 2000, 2001).

В специализированных хозяйствах, особенно в. межхозяйственных предприятиях, широкое распространение получили желудочно-кишечные болезни молодняка сельскохозяйственных животных, на долю которых приходится до 80% общей заболеваемости (В.П.Иноземцев с соавт., 1997, 2000). Комплексное изучение их этиологии показало, что на фоне нарушения^ технологии получения" и выращивания молодняка, возбудителями диарей. у телят. являются энтеропатогенные и энтеротоксигенные эшерихии, псевдамонады, энтеробактеры, протеи, стрептококки, сальмонеллы и др. (А.Г. Шахов 1999; I

О.В. Вавина с соавт. 1999; А. Ф. Иванов 1999; В. В. Субботин, М. А. Сидо-ров, 2004).

Огромный экономический ущерб, причиняемый животноводческим. хозяйствам желудочно-кишечными заболеваниями, вызывает необходимость поиска путей и методов совершенствования и изыскания’новых эффективных средств в их профилактике и лечении.

В-комплексе мероприятий по’борьбе с желудочно-кишечными болезнями бактериальной этиологии у молодняка сельскохозяйственных животных широкое применение нашли такие химиотерапевтические средства, как ' ч. сульфаниламиды, антибиотики, нитрофураны и др. (В.Ф. Ковалев с соавт., 1988; А. В. Голиков с соавт., 1994; Н. Т. Климов с соавт., 2000; И. ШСондрахин, 2003). Однако длительное и бессистемное применение их в животноводстве привело к появлению резистентных штаммов микроорганизмов (М.И. Немченко, 1987; И. Х. Рахмонов, 1988; А. Г. Шахов с со-авт., 1996).

Одним из путей, повышающих эффективность лечения животных и уменьшающих расхода лекарств, при этом, является создание комплексных препаратов.

Известно, что широкий спектр антимикробной активности препаратов, как правило, достигается путем комбинирования нескольких лекарственных субстанций на базе одной или нескольких групп химических веществ. При этом сочетание различных химических структур в композиции позволяет достичь синергического эффекта и получить препараты с новыми полезными свойствами. (М.Д. Машковский, 1998; С. В. Шабунин, 1999; Т. Н. Ракова, 1999). При использовании пролонгатора создается депо действующих веществ в месте введения препарата.

В. связи с этим перспективным является создание комплексных препаратов г прологированного действия, обладающих широким спектром антимикробной1,. активности и высокой эффективностью, при лечении желудочно-кишечных заболеваний бактериальной этиологии у молодняка крупного рогатого скота. *

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка, изучение фармако-токсикологических свойств нового антибактериального препарата левотил, клиническое изучение препарата при лечении ко-либактериоза у молодняка крупного рогатого скота.

Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Изучить распространение желудочно-кишечных болезней телят.

2. Изучить этиологическую структуру желудочно-кишечных болезней у телят и чувствительность выделенных микроорганизмов к антимикробным I препаратам;

3.Разработать состав и лекарственную форму пролонгированного композиционного препарата левотил;

4. Изучить антимикробную активность левотила;

1,4 5. Изучить фармако-токсикологические свойства левотила;

6. Изучить терапевтическую эффективность левотила при колибакте-риозе у телят;

7. Разработать нормативную документацию по контролю и применению левотила.

Научная новизна. Разработан и экспериментально обоснован состав нового препарата левотил на основе левомицетина и тилозина, изучены его фармако-токсикологические свойства, разработано применение, определена его эффективность при терапии желудочно-кишечных болезней бактериальной этиологии у телят.

Практическая значимость и внедрение. Изучена этологическая структура желудочно-кишечных болезней телят. Разработан и изучен новый комплексный антибактериальный препарат для лечения желудочно-кишечных болезней бактериальной этиологии у телят — левотил. Разработаны методы контроля его качества, схемы применениями определены оптимальные дозы левотила, сроки возможного убоя животных после леченияшевотилом. Разработана и утверждена* в установленном порядке нормативная документация. наг левотил (Технические условия, Временное наставление по применению препарата при желудочно-кишечных болезнях бактериальной этиологии у телят ьООЮ51-ОП от 25.05.2002 г.) 1

Основные положения, выносимые на защиту:

— распространение желудочно-кишечных болезней телят;

— этиологическая структура желудочно-кишечных болезней телят;

— разработка и. обоснование состава препарата левотил;

— фармако-токсилогические свойства левотила;

— терапевтическая эффективность левотила при колибактериозе телят.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены:

— на 4-ой Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного конI троля сельскохозяйственной продукции», Москва, 2002 г.;

— на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях», Воронеж, 2002 г.;

— на заседаниях научно-технического совета научно-производственного предприятия «Агрофарм» 2000;2002 г. г.;

— на заседании Ветфармсовета Департамента ветеринарии (протокол № 2 от 12 апреля 2000 г.).

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 7 статьях, в том числе 1 в издании, рекомендованном ВАК РФ.

7. ВЫВОДЫ

1. Желудочно — кишечные болезни телят широко распространены в РФ и ЮФО. Ежегодно ими заболевает только в Краснодарском крае 28,3 — 29,6% от приплода. Отход от болезней органов пищеварения составил: падеж -48,27%±0,78, вынужденный убой — 46,02%±0,16 от количества погибших телят. Наиболее часто у телят регистрируют колибактериоз. Ежегодно коли-бактериозом заболевает 14 300 — 19 600 телят, летальность телят от колибак-териоза колеблется в пределах 35,6 — 38,9%,

2. Видовой состав бактерий, изолированных от больных диареей телят широк, включает 19 видов. Наиболее часто, в 24,3% выделяли Е. coli, в том числе патогенных — 79%. Адгезивные антигены присутствовали у 36,8% выделенных культур. У 14% - А-20, 10,5% - К-88, в 5,3% - Е. coli F-41 и 3,5% -Р987, К-99 выявлен у 3,5% культур. Из карпускулярных антигенов наиболее часто выявляли Oiв 15,8%. Выделенные культуры Е. coli высоко резистентны к антимикробным препаратам: только 5 из 30 антибиотиков! были активны в отношении всех культур Е. coli.

3. Разработан новый комплексный инъекционный препарат левотил для лечения желудочно-кишечных заболеваний бактериальной этиологии у телят, в состав которого входят левомицетин и тилозин, растворенные в полиэтиле-ноксиде-400 и 1,2-пропиленгликоле. Препарат представляет собой вязкую л жидкость с удельным весом 1,19 г/см от темно-желтого до красновато-желтого цвета, без запаха, горького вкуса. Стабилен в течение 12 месяцев хранения. Фракциональная ингибирующая концентрация (ФИК-индекс) тило-зина с левомицетином в левотиле в соотношении 5:5 составляет 0,018−0,024, что показывает высокую синергидность компонентов препарата.

4. Левотил обладает широким спектром антимикробной активности в отношении грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, основных возбудителей желудочно-кишечных болезней телят, с минимальной бак-териостатической концентрацией левотила 3,12−12,5 мкг/мл.

5. Комплексный антибактериальный препарат на основе левомицетина и тилозина по параметрам острой токсичности согласно ГОСТ 12.1.007−76 относится к 4 классу опасности — вещества малоопасные: среднелетальную дозу- 1Л350 левотила при пероральном введении определить не удалось, т.к. как при введении препарата в максимально возможных объемах 0,6 мл — белым мышам и 6,0 мл — белым крысам, не отмечалось гибели животных. ЛД50 левотила при подкожном введении составила для мышей 6,19 мл/кг, а для белых крыс — 5,51 мл/кг массы тела.

6. Внутримышечное введение левотила в дозе, превышающей в 5 раз терапевтическую, белым крысам в течение 14 дней повышает нагрузку на почки и печень животных и частично проявляет нефротоксическое и гепатотоксиче-ское действие при отсутствии клинических признаков интоксикации. Коэффициент по методу Лима превышает 12. Левотил не обладает эмбриотоксиче-ским и тератогенным свойствами. Не оказывает отрицательного влияния на продолжительность беременности и плодовитости крыс, не вызывает уродств, аномалий развития внутренних органов и скелета плодов, не обладает кожно-раздражающим и кожно-резорбтивным действием. Многократные аппликации левотила на кожу кроликов в течение 14 дней не выявили аллергенных свойств препарата. По токсикологической оценке препарат относится к малоопасным веществам — 4 класс токсичности. Многократное внутримышечное применение левотила телятам в дозах, равной терапевтической, 3-х и 5-ти кратно превышающей терапевтическую дозу, не оказывает негативного влияния на клиническое состояние, поведение и аппетит животных, не снижает скорости роста телят. Длительное применение левотила в течение 15 суток клинически здоровым телятам не оказывает отрицательного влияния на морфологические и иммунобиохимические показатели крови, улучшает эритро-поэз, повышает уровень общего белка и, особенно, гамма-глобулинов. Левотил не оказывает отрицательного влияния на качество мяса и мясопродуктов. Убой животных на мясо возможен через 10 дней после прекращения применения препарата.

7. Лечебная эффективность левотила при колибактериозе телят при внутримышечном введении в дозе 0,3 мл/кг массы тела один раз в сутки с интервалом 48 часов составляет 92%. Экомический эффект применения лево-тилапри колибактериозе у телят составляет 15,69 рублей на 1 рубль затрат.

8. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Левотил для терапии колибактериоза телят следует применять внутримышечно в дозе 0,3 мл/кг массы тела один раз в сутки с интервалом 48 часов. При тяжелом течении болезни препарат вводят трехкратно с интервалом между введениями 24 часа.

2. Разработано Временное наставление по применению левотила в ветеринарии (Утверждено Главным управлением ветеринарии Минсельхоза России за № ООЮ51-ОП от 25.05.2002 г.)

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее в скотоводческих хозяйствах серьезной проблемой являются желудочно-кишечные болезни телят, в том числе колибактериоз, наносящие огромный экономический ущерб животноводству.

Анализ заболеваемости телят желудочнокишечными болезнями свидетельствует, что % болезнями органов пищеварения в РФ за последнее время ежегодно переболевало- 29,2% телят, а отход по этой причине составил 9,1%. Полученные данные согласуются с результатами исследований, приведенных А. Г. Шаховым (2002), который указывает, что до 85% телят гибнет от болезней органов пищеварения и дыхания.

Наиболее часто заболевают и гибнут телята до месячного возраста, в период развития острых расстройств органов пищеварения. В возрасте младше месяца заболевает 69,7% телят, а падеж в этой возрастной группе составляет 64,6% от числа павших телят. В возрасте старше 30 дней эти показатели снижаются до 30,3% и 35,4% соответственно. Аналогичные данные приводят В. С. Шйпилов с соавт.,(1981; 1988), П. П. Голыщенков, (1983), В. Г. Зароза,(1989; 1991), С. И. Джупина (2002), В. И. Терехова (2002), К. Геров с соавт (1978).

По данным В. И. Терехова (2002) при анализе значительного количества случаев заболеваний молодняка в хозяйствах Краснодарского края установлено, что непосредственно алиментарно-функциональная диарея имеет место в 9 т 10%, обусловленная смешанной кишечной инфекцией — 80−85% и моно инфекциями — 5−10%. По нашим наблюдениям смешанное течение болезни наблюдали в болыпенстве случаев — 89−93% при диареях от телят изолоро-вали бактериальные ассоциации.

При изучении серологической структуры эшерихий, выделенных от больных диареей новорожденных телят установили, что адгезивные антигены присутствовали у 36,8% выделенных культур. У 14% присутствовали антигены А-20, 10,5% - К-88, в 5,3% - Е. coli F-41 и 3,5% - Р987. Характерный для телят адгезивный антиген К-99 выявлен у 3,5% культур.

Роль E. coli, как возбудителя заболеваний молодняка крупного рогатого скота подчеркивали В. А. Малов, С. Г. Пак, (1996). Ведущая роль в развитии диареи новорожденных телят, по их данным, принадлежит энтеротоксиген-ным штаммам эшерихий с адгезивными антигенами К88, К99, 987 Р, F41, F18, А 20, Att 25.

Изучив чувствительность бактериальных культур, выделенных от больных телят с синдромом диареи, установили их высокую резистентность к антибиотикам. В. Д. Соколов, (1977) так же указывает, что при лечении молодняка животных антибиотиками необходимо учитывать закон специфичности: определенные препараты действуют на определенных возбудителей. Исходя из этого, особенно важны правильная диагностика, раннее выявление этиологического фактора, оценка клинического разнообразия инфекции. В соответствии с задачами терапии осуществляется выбор антибиотика с учетом спектра его антимикробного действия и дозы.

Многие проблемы отечественного животноводства обусловлены низкой' эффективностью проводимой фармакотерапии и профилактики заболеваний животных, а также острым дефицитом эффективных ветеринарных препаратов (С.М. Навашин с соавт., 1982; Е. П. Бернасовская с соавт., 1984; A.B. Вальдман, 1986; В. А. Антипов, 1995). Поэтому в мировой и отечественной практике задачи, связанные с низкой эффективностью и дефицитом, решались, решаются и должны решаться путем синтеза новых препаратов, использования синергидных сочетаний, применения антимикробных средств с препаратами, способствующими лучшему проникновению в ткани, более длительной циркуляции в организме антибиотических веществ, а также с использованием средств, повышающих защитные силы организма (С.И. Дьяков с соавт., 1988; В. Д. Соколов, 1977; 1984; 1989; 1990; 1992; 1997; В. Ф. Ковалев, 1991).

Если говорить о синтезе новых антимикробных средств, например антибиотиков, нитрофуранов или сульфаниламидов, то в этом направлении за последнее десятилетие достижения очень незначительны. В самом деле, можно лишь упомянуть фрадизин, который выпускается в мизерном количестве, фуракрилин, выпуск которого еще не налажен. Поэтому вполне правомерно утверждение о том, что в процессе поиска путей борьбы с устойчивостью патогенной микрофлоры рассчитывать на синтез новых, неизвестных ранее, препаратов не приходится (В.Ф. Ковалев, 1983; В. Д. Соколов, 1990 и ДР-)

В этой связи оправдало себя наше предположение о том, что антимикробный спектр действия препаратов необходимо повышать при комбинировании нескольких лекарственных препаратов на основе одной группы химических веществ, таких, как тилозин.

Известно, что сам тилозин в последние годы довольно интенсивно применяется в ветеринарии, как антимикробный препарат против различных аэробных и анаэробных микроорганизмов (Е.М. Сазонова с соавт.- 1994 Е. Чалева с соавт., 1996) как в отдельности, так и в сочетании с другими антимикробными препаратами;

С учетом данных литературы (В.А. Антипов с соавт., 1991; В.И. Дорож-кин с соавт., 1993; Е. М. Сазонова с соавт., 1994; В. А. Миронова с соавт., 1997 и др.) и результатов собственных исследований разработан новый тилозин-содержащий препарат левотил, обладающий синергидным действием и новыми полезными свойствами. Исследования по изучению антимикробной активности, острой, подострой токсичности и кумулятивных свойств, кожно-резорб-тивного, аллергенного, тератогенного и эмбриотоксического действия препарата, его влияние на функциональное состояние органов и-систем-, а также на качество продуктов питания после его применения проведены на лабораторных и сельскохозяйственных животных.

Нами обосновано оптимальное соотношение компонентов) левотила по ФИК-индексу (О.М. ЕИоп еЬ а!., 1954; 8.Ы.М. ВшЬЬу еЬ. а1., 1968) — которое позволило определить величину ФИК для. каждого компонента препарата.

Известно, что если ФИК-индекс меньше единицы, то наблюдается синер1 гизмчем меньше сумма, тем больше синергизм. Такой подход позволил т vitro определить или выбрать оптимальный вариант соотношения в левотиле его компонентов.

В эксперименте установлено, что наиболее выраженным антимикробным действием обладает комбинация тилозина и левомицетина в соотношении 5:5 (ФИК-индекс этой комбинации в опыте с Salmonella dublin составил 0,018- с культурой Escherichia coli (А-20/08) — 0,019- с Staphylococcus aureus -0,024.

В опытах in vitro нами выявлен устойчивый эффект усиления антимикробного действия тилозина при его комбинированном применении с левоми-цетином. Следовательно, сочетанное применение тилозина с левомицетином позволяет снизить дозы этих препаратов в несколько раз, сохранив при этом их бактерицидные свойства.

Но некоторые исследователи отмечают, что антибактериальный эффект препаратов in vitro не всегда совпадает с эффектом in vivo (С.М. Навашин с соавт., 1982). Испытание левотила с соотношением составляющих компонентов 5:5 в клинических опытах при колибактериозе у телят показало его высокую лечебную эффективность, что подтверждает правомерность выбранного нами соотношения компонентов препарата в опытах in vivo.

Проведенное, согласно общепринятым стандартам, изучение токсикологических свойств левотила установило его слабую токсичность. Так, в частности, для белых мышей LD50 левотила составила 6,19 мл/кг, a LDioo — 9,00 мл/кг. Для белых крыс LD50 левотила составила 5,51 мл/кг. При этом токсичность левотила определялась при подкожном введении, позволяющем инъецировать большие дозы.

При изучении подострой токсичности левотила на белых крысах нами было установлено, что внутримышечное применение препарата в терапевтической и в 5 раз превышающей, терапевтическую дозах в течение 14 дней не оказывает токсического действия на организм животных. Изменений в морфологическом составе крови, биохимических показателях и показателях иммунного статуса по сравнению с показателями крови животных контрольных групп установлено не было. Средние результаты содержания эритроцитов, лейкоцитов, цветового показателя и лейкоцитарной формулы были характерны для физиологической нормы растущих животных. При длительном применении препарата в пятикратной терапевтической дозе у крыс опытной группы достоверно возрастало содержание в сыворотке крови мочевины, в среднем на 40,5%, креатинина — на 26,0%, активность АлАТ повышалась на 64,3% и уровень билирубина — на 91,7%. Однако среднее значение этих показателей у крыс опытной группы не выходило за верхние границы нормы для данного вида животных. С увеличением дозы левотила наблюдалось также достоверное возрастание бактерицидной активности сыворотки крови.

При проведении патоморфологических исследований у лабораторных животных как опытных, так и контрольной групп, макроскопически не было выявлено отклонений и особенностей в строении внутренних органов. Их расположение было анатомически правильным, нормальных объемов, серозные оболочки полостей имели ярко-розовый цвет, гладкую и блестящую поверхность. Однако увеличение терапевтической дозы препарата в 5 раз повышает нагрузку на почки и печень животных, не выводя при этом их функциональное состояние за верхние границы нормы. Эти изменения носили обратимый характер и отражали адаптационно-компенсаторные сдвиги в органах в ответ на сравнительно длительное воздействие препарата.

Анализ данных подострого эксперимента на клинически здоровых телятах не выявил отрицательного влияния терапевтической дозы левотила на основные показатели крови животных. Исследования биохимических показателей сыворотки крови установили недостоверное возрастание концентрации общего белка и его гамма-глобулиновой фракции в пределах физиологической нормы. На наш взгляд, это может быть связано с неблагополучием хозяйств по желудочно-кишечным болезням телят этого возрастного периода, с одной стороны, и отсутствием угнетающего действия левотила на процессы иммуногенеза в организме, с другой. Остальные показатели не претерпевали существенных изменений и не отличались от контрольных.

Изучение кожно-резорбтивного действия и аллергизирующих свойств левотила на белых крысах, морских свинках и кроликах при однократном и многократном нанесении, а также путем воспроизведения анафилактического шока и выявления кожных реакций (отека, зуда) у предварительно сенсибилизированных животных не выявило негативного влияния препарата, как в месте нанесения, так и на общую ответную реакции организма. Это характеризует его как препарат, не оказывающий патологически значимых изменений местного аллергического характера на животных.

Результаты проведенных исследований по оценке эмбриотоксического и тератогенного действия установили, что назначение левотила в терапевтической дозе беременным животным не оказывает негативного влияния на течение беременности и роды. Потомство, рожденное от крыс, получавших препарат во время беременности, не отличалось от крысят контрольных животных. Различий в их росте, развитии и поведении обнаружено не было.

Исходя из результатов токсикометрической оценки установлено, что по всем параметрам левотил относится к 4 классу токсичности, то есть является малотоксичным веществом, что соответствует литературным данным (Б. Донев с соавт., 1998).

Проведение ветеринарно-санитарной экспертизы продуктов убоя, в ходе которой оценивался комплекс органолептических показателей, не установил отрицательного действия препарата на качество и вкусовые свойства мяса.

Проведенные исследования по изучению активности компонентов! левотила (левомицетин, тилозин) в органах, тканях и биологических жидкостях телят после 5-ти кратного применения препарата показали, что бактериоста-тическая концентрация антибиотиков в крови сохраняется в течение 48 часов, достигая максимума через 3 часа после инъекции.

Установлено, что левотил в течение 7 суток полностью выводится из организма, что было доказано при определении его остаточных количеств в биологическом материале. При этом сам тилозин, входящий в состав препарата, полностью выводится из организма в течение 1−2 суток (В.А. Антипов, 1987).

При изучении антимикробной активности левотила установлено его выраженное действие в отношении как грам позитивных, так и грам негативных бактерий, в отношении которых действие тилозина не значительно (М.Д.Машковский, 1997).

Таким образом, проведенные всесторонние экспериментальные исследования по изучению специфической активности, острой, подострой и хронической токсичности, аллергенных свойств, кожно-резорбтивного действия, фармакокинетики, эмбриотоксического и тератогенного действия, общего действия на организм животных, влияния на качество мяса и других свойств левотила позволяют заключить, что:

— композиция тилозина и левомицетина обладает синергидными свойствами- - в опытах in vitro и in vivo определены наиболее эффективные антибактериальные соотношения состава левотила;

— левотил обладает широким спектром антибактериальной активности в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмовосновных возбудителей острых желудочно-кишечных болезней молодняка телят;

— левотил по токсикометрическим параметрам относится к 4 классу токсичности, то есть является малотоксичным;

— препарат не обладает кожно-раздражающим и кожно-резорбтивным действием, кумулятивными и. аллергизирующими свойствами;

— левотил не оказывает отрицательного влияния на морфологический состав крови, иммунологический статус и неспецифическую резистентность организма клинически здоровых животных. При длительном его применении качество мяса и мясопродуктов не изменяется.

С учетом указанных выше особенностей левотила разработаны и утверждены Наставление по применению левотила и Технические условия (№ ООЮ51-ОП от 25.05.2002 г.)

Эффективность применения левотила при колибактериозе у телят достаточно высока. Результаты клинических исследований свидетельствуют, что левотил обладает более выраженной терапевтической эффективностью при колибактериозе у телят, по сравнению с зинапримом и байтрилом. При его применении клиническое улучшение (прекращение диареи и улучшение аппетита) наступало на 3−4 дни лечения. В контрольной группе, где применяли зинаприм и байтрил, клинические признаки заболевания исчезали на 4−5 дни лечения.

При применении левотила значительно снижался падеж телят — с 26,5% в контрольной группе до 7,7% - в опытной. Среднесуточный прирост массы тела у телят опытной. группы был выше на 24,7%.

Таким образом, левотил является эффективным средством для лечения колибактериоза у телят.

Экомический эффект применения левотилапри колибактериозе у телят составляет 15,69 рублей на 1 рубль затрат, в то время как при применении зинаприма — всего 5,84 рублей.