Дифференциация лептоспир различных экологических групп на основе гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны LipL32

Лептоспирозы — группа нетрансмиссивных природно-очаговых инфекций, занимающая первое место в мире среди зоонозов по широте распространения природных и антропургических очагов [96]. Массовость заболеваний среди населения характерная для одних этиологических форм (Pomona, Grippotyphosa) — тяжелое течение с высокой летальностью, отличающее другие (Icterohaemorrhagiae и Canicola), ставят эти инфекции в один ряд с особо опасными [19].

По ориентировочным оценкам международных экспертов ежегодно в мире более 100 000 людей заболевают тяжелыми формами лептоспирозов, требующих госпитализации' [96]. Однако значительная часть случаев официально не регистрируется или проходит под другими диагнозами ввиду сложности клинической диагностики и ее лабораторного подтверждения. По этой причине лептоспирозы отнесены к группе так называемых «пренебрегаемых» (neglected) инфекций.

В Российской Федерации лептоспирозы также относятся к числу широко распространенных природно-очаговых инфекций человека, что обусловлено наличием почти на всех территориях, как в сельской местности, так и в городах, природных и хозяйственных очагов. Им принадлежит одно из первых мест среди зоонозов по тяжести клинического течения и частоте летальных исходов. При средних показателях летальности в Российской Федерации 3 — 4,5% на отдельных территориях эндемичных по лептоспирозам Icterohaemorrhagiae и Canicola, они достигают 20% и более [12].

Убиквитарное распространение лептоспирозов в мире обусловлено широким спектром резервуарных хозяев патогенных лептоспир и восприимчивых к ним видов животных, равно как и высокой степенью биоразнообразия возбудителей — антигенного, экологического и генетического [42, 4, 159].

По данным современной филогенетики лептоспиры относятся к древнейшим эубактериям, находящимся в прикорневой развилке эволюцинных путей [72]. В пределах этого семейства имеются представители разнообразных экологических групп: свободноживущие непатогенные, включая галофилы, и патогенные — возбудители лептоспирозов людей и животных. Последние также отличаются по хозяинной и органной специфичности, способности к существованию во внешней среде и другим ' признакам, значимым в клинико-эпидемиологическом контексте.

Высказывалось мнение о принадлежности всех патогенных лептоспир [40, 20] или их отдельных представителей, например, grippotyphosa, к возбудителям сапронозов [4].

В течение многих десятилетий в пределах рода Leptospira выделяли два вида — Leptospira interrogans (паразитические) и Leptospira biflexa (свободноживущие), дифференцируемые на основе некоторых не вполне достоверных фенотипических признаков (патогенности для лабораторных t животных и культурально-биохимических тестов).

Современная видовая дифференциация лептоспир основана на концепции определения вида у бактерий, в соответствии с которой в один вид объединяются штаммы с ДНК-ДНК гомологией 70% и выше и более 98, 7% гомологии 16S рРНК [159, 153]. На ее основе в начале 90-х гг. зарубежными лептоспирологами была разработана, а впоследствии утверждена Международным подкомитетом по таксономии лептоспир (1991, Осака), альтернативная система их видовой дифференциации, в соответствии с которой выделено 17 геномных видов.

Однако при генотипировании значительного числа штаммов (более 300) в ряде случаев к одному виду относили как патогенныетак и свободноживущие лептоспиры, а практически идентичные по фенотипу t штаммы — к различным видам. Сапрофитические лептоспиры контаминанты питательных сред, «изолированные» от людей и животных в результате технических ошибок (!Turneria parva, L. inadai и пр.), 6 причислялись к новым родам и видам патогенных лептоспир [71] или к штаммам с неясным таксономическим статусом — status insertae sedis [96]. Очевидно, что включение последних в панели эталонов для реакции микроагглютинации (РМА — «золотой стандарт») значительно снижает достоверность лабораторной диагностики лептоспирозов людей и животных.

Таким образом, новый подход к классификации и таксономии, основанный на произвольных количественных критериях, не подкрепленных фенотипическими и экологическими характеристиками таксонов, поставил и новую проблему — разработку надежных методов генетической демаркации основных экологических групп лептоспир.

В последние годы в практику молекулярно-генетических научных и диагностических исследований вошел метод секвенирования ДНК для ряда бактерий, в том числе и лептоспир [128, 118, 122], секвенированы полные геномы. Знание полногеномных последовательностей и информативность их сравнительного анализа позволяет найти новые подходы к решению многих проблем общей и медицинской микробиологии, а так же выявлять частные особенности геномов отдельных микроорганизмов, например, связанных с патогенностью и др.

Однако получение исчерпывающей информации о вариабельности геномов, которая необходима для однозначной идентификации не просто видов, а штаммов и изолятов бактерий, с помощью прямого секвенирования практически нереальна из-за чрезвычайной вариабельности микроорганизмов и наличии генов, функции которых неизвестны. Кроме того, наличие сиквенсов полных геномов в ряде случаев является, как бы «избыточной информацией» в научной и практической работе, например, при анализе определенных генов и диагностике возбудителей инфекций. Поэтому встает вопрос о развитии «несеквенирующих» методов анализа геномов, в которых можно использовать уже секвенированные геномы в качестве стандартного сравнения [1].

Использованиме метода мультилокусного секвенирования — 7 типирования* (MJICT или MLST) требует подбора маркерных генов. Для многих микроорганизмов, в том числе и для лептоспир, не существует рекомендаций, какие гены можно использовать в качестве маркерных.

Представляется целесообразным анализ возможности применния генов белков внешней мембраны в качестве маркерных, так как поверхностная структура бактериальной клетки по своей локализации занимает пограничное положение (interface) между клеткой и окружающей средой. Для многих грамотрицательных бактерий показана ведущая роль полиморфизма белков внешней мембраны в обеспечении патогенности и других свойств.

К моменту начала наших исследований у патогенных лептоспир были обнаружены белки наружной мембраны с различным уровнем экспрессии in vitro и in vivo, отсутствующие у сапрофитов [84, 83, 136]. Последнее дало основание предположить их важную роль в этиопатогенезе лептоспирозной инфекции. Особый интерес, с точки зрения разработки генетической дифференциации лептоспир различных экологических групп, представляет липопротеин LipL32 — основной белок наружной мембраны, демонстрирующий высокую степень экспрессии в организме инфицированного хозяина [117] и in vitro [83]. Установлена также его иммуногенность и связь с продукцией гемолизина — одного из факторов патогенности лептоспир [107].

Исходя из изложенного, основной целью нашей работы стала: Разработка метода дифференциации свободноживущих и паразитических лептоспир на основе детекции генов, кодирующих синтез липопротеинов внешней мембраны.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие Задачи исследования^.

1. На основе нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих липопротеины внешней мембраны LipL32 и LipL41, разработать тест-системы ПЦР для индикации лептоспир.

2. Изучить распространенность гена lipL32 в геноме лептоспир различных 8 таксонов, выделенных (1915;2004 гг.) от людей и животных и из объектов окружающей среды в различных географических регионах мира.

3. На основании полученных данных провести анализ современных таксономических схем лептоспир.

4. На модельных системах (биологический материал от людей и экспериментальных животных, вода, почва) изучить возможность применения разработанной тест-системы для индикации патогенных лептоспир в объектах внешней среды, а также в организме людей и животных.

5. Оценить параметры диагностической эффективности ПЦР тест-системы на основе гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны лептоспир 1ЛрЬ32, на клиническом материале, полученном в очагах лептоспирозной инфекции.

Научная новизна.

Впервые на репрезентативной выборке штаммов (90 в их числе 68 паразитических и 22 сапрофитных) различных надвидовых и подвидовых таксонов, изучена распространенность гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны лептоспир 1лрЬ32. С этой целью на основе нуклеотидных последовательностей фрагментов гена (размером 677 и 204 п.н.), кодирующего синтез липопротеина 1лрЬ32 — основного белка наружной мембраны — разработана ПЦР тест-система (в том числе пез1ес1-вариант).

В результате исследования «исторической» коллекции типовых и полевых штаммов, отличавшихся по месту, времени и источнику выделения, установлено, что ген, кодирующий синтез липопротеина 1лрЬ32, представлен в ДНК патогенных лептоспир всех известных геномовидов, в том числе отнесенных к возбудителям сапронозов {Ь.Ыгзскпеп, серовар рро1ур1ю8а).

Указанные фрагменты не определялись в ДНК лептоспир-сапрофитов.

Ь.Ы/1еха, Ь. м>о1Ьаскп и др.), равно как и у ряда штаммов с неопределенным 9 таксономическим статусом — species insertae sedis.

Таким образом, показано, что lipL32 характеризутся высокой консервативностью среди паразитических лептоспир, включая возбудителей сапронозов. Детекция гена, кодирующего липопротеин LipL32, может быть рекомендована для дифференциации основных экологических групп лептоспир в таксономических целях.

Фрагмент гена (164 п.н.), кодирующего липопротеин наружной мембраны LipL41, определялся в ДНК как паразитических, так и свободноживущих лептоспир. При этом в отличие от паразитических, у сапрофитов, а также штаммов со спорным таксономическим статусом, отмечен значительный полиморфизм длин ампликонов, проявлявшийся в индивидуальном для каждого штамма профиле.

Последнее подтверждает полученные ранее данные о выраженном геномном полиморфизме свободноживущих представителей Leptospiraceae.

Таким образом, нашло подтверждение мнение, основанное на изучении фенотипического профиля, о принадлежности типовых лептоспир родов Leptonema и Turneria и некоторых представителей видов L. inada и L. meyeri к свободноживущим [104]. Последнее свидетельствует о необходимости ревизии действующей классификации и номенклатуры лептоспир, принятой Международным подкомитетом по таксономии.

Практическая значимость.

На различных модельных системах (моча, сыворотка крови людей, спинномозговая жидкость, паренхиматозные органы экспериментальных животных, вода, почва) показана возможность применения разработанного «nested» -варианта ПЦР для индикации патогенных лептоспир в объектах внешней среды и биологических образцах.

На клиническом материале, полученном при расследовании вспышек лептоспирозов среди людей на юге России, определены параметры высокой.

10 диагностической эффективности «nested» ПЦР — тест-системы, разработанной на основе гена lipL32 .

Таким образом, в перспективе сферами возможного применения ПЦРтест-системы, разработанной на основе гена lipL32, могут стать:

— индикация патогенных лептоспир в объектах окружающей среды и их дифференциация от свободноживущих (в таксономических целях и при эпидемиологическом анализе);

— генодиагностика лептоспирозов людей, вызываемых патогенными лептоспирам всех известных геномовидов, включая эпидемически значимые (Sejroe, Icterohaemorrhagiae) и новые для РФ возбудители (например, серогруппа Austral is, серовар muenchen).

Последнее представляется особенно важным в контексте разработки методов контроля и снижения угрозы трансграничного завоза на территорию страны ранее неизвестных эндемичных лептоспир, антигены которых не представлены в отечественных диагностических тест-системах и вакцинных препаратах.

Универсальность разработанной тест-системы, позволяющей выявлять ДНК всех патогенных лептоспир номенвида L. interrogans sensu lato, дает основание рекомендовать испытание тест-системы не только в клинической, но и ветеринарной практике, в том числе для прижизненного контроля животных на лептоспироносительство.

Результаты работы используются при чтении лекций для врачей бактериологов на кафедре инфектологии МПФ ПОО ММА им. И. М. Сеченова.

Публикации.

1. Самсонова А. П., Петров Е. М., Земская М. С., Ананьина Ю.В.

Генотипирование лептоспир: новые методические подходы. // Материалы конференции «Современные средства иммунодиагностики, иммунои экстренной профилактики актуальных инфекций». Москва. — 2004. — С.230.

2. Самсонова А. П., Петров Е. М., Земская М. С., Ананьина Ю. В. Изучение полиморфизма генов белков внешней мембраны в разработке схем типирования лептоспир. // Сборник трудов 5-й всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней. Москва. 2004. — С.32−34.

3. Самсонова А. П., Петров Е. М., Земская М. С., Вышивкина Н. В., и др. Методические подходы к идентификации, лептоспир на. основе полиморфизма генов белков внешней мембраны. // Материалы Южнороссийской научно-практической конференции. Геленджик. 2005. — С. 114−116.

4. Земская М: С., Самсонова А. П. Методические4 подходы к разработке системы внутривидового генотипирования лептоспир. // Материалы I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье». Суздаль. 2005. — С.342−344.

5. Самсонова А. П., Петров Е. М., Земская М. С., Лебедев В. В., Лысенко И. В, Ананьина Ю. В. Методический подход к генетическому типированию лептоспир на различных таксономических уровнях. // Клиническая лабораторная диагностика. 2005. — № 9 — С. — 38−39.

6. Самсонова А. П., Петров Е. М., Аляпкина Ю. С., Земская М. С., Ананьина Ю. В. Дифференциация лептоспир различных геномовидов на основе гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны 1лрЬ32. // Материалы российской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины». Санкт-Петербург. 2006.-С. 267−268.

7. Самсонова А. П., Земская М. С., Петров Е. М., Ананьина Ю. В. Полиморфизм генов кодирующих белки наружной мембраны: новые возможности для индикации и дифференциации лептоспир. // Материалы Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней общих для людей и животных». Ульяновск. 2006.12.

С. 138 — 142.

8. Самсонова А. П., Петров Е. М., Аляпкина Ю. С., Земская М. С., Ананьина Ю. В. Распространенность гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны LipL32, у лептоспир различных таксонов. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. — № 4 — С. 29−32.

9. Ananyina Yu.V., Petrov Е.М., Samsonova A.P., Zemskaya M.S., Shaginyan I.A. Ecological and genetic diversity within the Leptospiraceae family: implication for epidemiology // Molecular Biology of Spirochetes IOS, Press Science series, 2006, p.200−208.

10. Ананьина Ю. В., Самсонова А. П., Петров E.M., Земская М. С. Лептоспирозы в России: проблемы контроля и диагностики. // Материалы Московской международной научно-практической конференции «Диагностика профилактика и лечение лептоспирозов людей и животных», М., 2007, с. 10−11.

11. Земская М. С., Самсонова А. П. индикация лептоспир в объектах окружающей среды на модельных системах с помощью ПЦР — тест-систем на основе гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны // Там же, С. 26−27.

12. Ананьина Ю. В., Петров Е. М., Самсонова А. П., Земская М. С. Завоз возбудителей лептоспирозов: проблемы контроля и диагностики // МатерЛХ Всероссийского съезда н.-практ. об-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, М., «Санмедиа», 2007, с. 80.

13. Земская М. С., Самсонова А. П. Разработка системы генотипирования лептоспир различных экологических типов на основе детекции гена липопротеина наружной мембраны лептоспир LipL32. Матер. II Всероссийской научно-практической конференции. молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье», Рязань, 2007, с. 50 — 51.

14. Самсонова А. П., Петров Е. М., Аляпкина Ю. С., Алексеева Н. В., Земская.

М.С., Терехов А. А., Гинцбург А. Л., Ананьина Ю. В. Ген, кодирующий липопротеин внешней мембраны LipL32 как генетическая мишень для.

13 разработки схем генотипирования летпоспир// Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. — 2008, № 1 — С. 3−8.

15. Земская М. С., Самсонова А. П. Диагностические возможности ПЦР тест-систем на основе гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны лептоспир LipL32. //Тезисы V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Москва. -2008 — С. 158.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 117 страницах, иллюстрирована 11 рисунками и 21 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (164 источников, в их числе 46 отечественных и 118 иностранных).

7. ВЫВОДЫ.

1. На основе нуклеотидных последовательностей фрагментов гена*(размером 677 и 204 п.н.), кодирующих синтез липопротеина LipL32 — основного белка наружной мембраны лептоспир — разработана ПЦР тестсистема (в том числе nested-вариант) для индикации представителей семейства Leptospiraceae.

2. В результате исследования «исторической» коллекции типовых и полевых штаммов, отличавшихся по месту, времени и источнику выделения, установлено, что ген lipl32, представлен в ДНК патогенных лептоспир известных геномовидов, в том числе отнесенных к возбудителям сапронозов (L.kirschneri, серовар grippotyphosa). В ДНК лептоспир-сапрофитов (L.biflexa, L. wolbachii и др.)? равно как и у ряда штаммов с неопределенным таксономическим статусом (species insertae sedis) родов Leptonema и Turneria и некоторых представителей видов L. inadai (lyme, lichuan), L. meyeri (ranarum) фрагмент гена lipl32 размером 677 п.н. не определялся.

3. На различных модельных системах показано, что разработанная ПЦР тест-система (nestedвариант) может использоваться для индикации патогенных лептоспир в объектах внешней среды (вода, почвенная вытяжка) и биологических материалах (моча, сыворотка крови людей, спинномозговая жидкость паренхиматозные органы экспериментальных животных).

4. На клиническом материале, полученном при расследовании вспышек лептоспирозов среди людей на юге России, показана высокая диагностическая эффективность «nested» ПЦР — тест-системы, разработанной на основе гена lipL32 на ранних строках заболевания (100% - первой неделе заболевания, 57% - на 2-й).

5. Универсальность и показатели диагностической эффективности разработанной тест-системы на основе гена lipL32, позволяющей выявлять ДНК всех патогенных лептоспир номенвида L. interrogans sensu lato, дает основание рекомендовать ее испытание как относительно простого метода для:

— индикации патогенных лептоспир в объектах окружающей среды и их дифференциации от свободноживущих (в таксономических целях и при эпидемиологическом анализе);

— генодиагностики лептоспирозов людей, вызываемых патогенными лептоспирам всех известных геномовидов, включая эпидемически значимые ^е^ое, IcterohaemoIтhagiae) и новые для РФ возбудители (например, серогруппа Аш^аНв, серовар тиепсЬеп).

— прижизненного контроля животных на лептоспироносительство.

6.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

По определению ВОЗ (WHO Recommended Surveillance Standards, WHO, 2003) «Лептоспирозы относятся к зоонозам с мировым распространениемоднако во многих странах они выявляются и регистрируются неполностью из-за сложности клинической диагностики и отсутствия возможности лабораторного подтверждения диагноза» [96].

В значительной степени, указанные трудности связаны со значительным биоразнообразием лептоспир: экологическим, антигенным и генетическим.

В течение-многих десятилетий лептоспиры, подобно другим спирохетам, оставались «вне фарватера» фундаментальных молекулярно-генетических исследований. В. последние годы в связи с бурным развитием молекулярных технологий лептоспир стали рассматривать как перспективную модель для исследования молекулярных механизмов эволюции и видообразования у эубактерий, структурно-функциональных особенностей их геномов, разработки новых молекулярно-генетических подходов к классификации, таксономии и типированию.

По данным современной филогенетики, лептоспиры относятся к древнейшим эубактериям, находящимся в прикорневой развилке эволюцинных путей. В пределах этого семейства имеются разнообразные экологические группы: свободноживущие непаразитические формы, включая галофилы, представители сапронозов, паразитические — возбудители лептоспирозов людей и животных. Последние также отличны по хозяинной и органной специфичности, патогенности, способности к существованию во внешней среде и другим признакам, значимым в клинико-эпидемиологическом контексте.

Высказывалось мнение о принадлежности всех паразитических лептоспир [40, 20] или их отдельных представителей, например, grippotyphosa, [4] к возбудителям сапронозов.

В течение многих десятилетий в пределах рода Leptospira выделяли два.

92 вида — Leptospira interrogans (паразитические) и Leptospira bi? exa (свободиоживущие), дифференцируемые на основе некоторых фенотипических признаков (патогенности для лабораторных животных и культурально-биохимических тестов).

Современная видовая дифференциация лептоспир основана на концепции определения вида у бактерий, в соответствии с которой в один вид объединяются штаммы с ДНК-ДНК гомологией 70% и выше и более 98, 7% гомологии 16SpPHK [153]. На ее основе в начале 90-х гг. зарубежными лептоспирологами была разработана, а впоследствии утверждена Международным подкомитетом по таксономии лептоспир (1991, Осака), альтернативная система их видовой дифференциации, в соответствии с которой выделено 17 геномных видов.

Однако при генотипировании значительного числа штаммов (более 300) в ряде случаев к одному виду относили как паразитические, так и свободноживущие лептоспиры, а практически идентичные по фенотипу штаммы — к различным видам. Сапрофитические лептоспиры — контаминанты питательных сред, «изолированные» от людей и животных в результате технических ошибок (L.ranarumлягушка, Leptonema illini — из мочи быка, L. inadai — из кожного биоптата больного Лайм-боррелиозом), причислялись к новым родам и видам паразитических лептоспир [71] или к штаммам с неясным таксономическим статусом — status insertae sedis [96]. Очевидно, что включение последних в панели эталонов для реакции микроагглютинации (РМА — «золотой стандарт») значительно снижает достоверность лабораторной диагностики лептоспирозов людей и животных. Более того, современная систематика и классификация лептоспир, по мнению многих исследователей, находится в состоянии близком к «таксономическому хаосу».

Таким образом, новый подход к классификации и таксономии, основанный на произвольных количественных критериях, не подкрепленных фенотипическими и экологическими характеристиками таксонов, поставил и.

93 новую проблему — разработку надежных методов генетической демаркации основных экотипов лептоспир.

Представляет определенный интерес попытка использования нового молекулярно-таксономического подхода (количественная ПЦР в реальном времени на основе сегмента гена 16S рРНК размером 1200 — п.н. и сравнительный анализ сиквенсов 16S рРНК изолятов от людей и из воды) для исследования поверхностных вод на паразитические лептоспиры и оценки риска заражения человека [76]. Критически оценивая результаты своей работы, авторы отмечают, что предлагаемый ими подход имеет ряд ограничений. Первое. Технические трудности, связанные с культивированием лептоспир, которые не поволили им провести идентификацию сероваров лептоспир в пробах воды. Второе. Авторы использовали ПЦР (TaqMan) тест-систему в реальном времени, ранее разработанную Smithe L.D. et al. (2002) и предложенную для дифференциации паразитических лептоспир от свободноживущих [138]. По данным C.A.Ganoza et.al.(2006) эта тест-система оказалась недостаточно специфичной, так как с ее помощью были выявлялись лептоспиры неизвестные как патогенныемонофилетическая группа С (от себя добавим, что в группе паразитических оказались свободноживущие лептоспиры Ranarum). И наконец, к серьезным ограничениям предлагаемой методики ее авторы относят ее высокую стоимость и недоступность оборудования [76].

Разработка простных и надежных методов дискриминации лептоспир различных экологических групп представляет не только таксономический интерес, но и важна для проведения эпидемиологического анализа и подбора диагностических панелей.

К моменту начала наших исследований у патогенных лептоспир были изучены некоторые белки наружной мембраны с различным уровнем экспрессии in vitro и in vivo, играющие важдную роль в этиопатогенезе лептоспирозной инфекции. По ряду причин первоначальный выбор пал на ген липопротеина LipL32 — основного белка наружной мембраны лептоспир.

На первом этапе исследований нами были разработаны 2 варианта тест-системы на основе нуклеотидных последовательностей гена (размером 677 и 204 п. н)), кодирующего синтез липопротеина LipL32 — основного белка наружной мембраны лептоспир — разработаны ПЦР тестсистемы (в том числе nested-вариант), а также LipL41(фрагменты 254 и 164 п.н.) для индикации представителей семейства Leptospiraceae. Изучение распространенности генов lipL32 и lipL41 среди представителей различных таксонов и экотипов лептоспир проводилась на хранящейся в лаборатории лепттоспирозов «исторической» коллекции штаммов лептоспир (67 патогенных и 23 сапрофита), относящихся к известным надвидовым, видовым таксонам патогенов и сапрофитов отличных по месту, времени и источнику выделения. Последнее обеспечивало статистическую1 поддержку исследования.

С помощью разработанных нами1 вариантов тест-системы ПЦР проведен анализ распространения гена, кодирующего липопротеин LipL32 в геноме представителей семейства Leptospiraceae. Установлено его наличие только у патогенных лептоспир всех известных геномовидов, в том числе отнесенных к возбудителям"сапронозов {L.kirschneri, серовар grippotyphosa), выделенных на территориях разных стран и континентов, в течение более 80 лет (1925 — 2004 гг.). Это дает основание для заключения, что данный участок в геноме патогенных лептоспир является консервативным. Указанные фрагменты не’определялись в ДНК свободноживущих лептоспир (L.biflexa, L. wolbachii и др.), равно как и у ряда штаммов с неопределенным таксономическим статусом (L.meyeri, геномовиды 3 и 5, Turneria parva и ДР-) — .

Таким образом, нашло подтверждение, высказанное нами. ранее мнение на основе анализа фенотипических признаков [4] о принадлежности представителей родов Leptonema и Turneria и видов L. inadai, и L. meyeri.

95 к свободноживущим лептоспирам. Последнее свидетельствует о необходимости ревизии действующей классификации и номенклатуры этих спирохет.

Поскольку «первый» вариант тест-системы (с праймерами ЬЕР21/ЬЕР22) не обладала достаточной чувствительностью (100−1000 клеток в пробе) нами была синтезирована внутренняя пара праймеровЬЕР2−351/ЬЕР2−534, которая позволила повысить аналитическую чувствительность до 10−100 клеток в пробе. На основе двух вариантов был разработан пе81е<1-вариант (1−10 клеток в пробе) с целью применения в диагностике и эпидемиологическом анализе.

Фрагмент гена (164 п.н.), кодирующий липопротеин наружной мембраны 1лрЬ41, определялся в ДНК паразитических и свободноживущих лептоспир. При этом в отличие от паразитических лептоспир, у сапрофитов, а также штаммов со спорным таксономическим статусом, отмечен значительный полиморфизм длин ампликонов, проявлявшийся в индивидуальном для каждого штамма профиле.

Следующий этап работы включал исследование на модельных — системах (биологического материала от экспериментальных животных, вода, почва). Была изучена возможность применения, разработанной тест-системы для индикации патогенных лептоспир в объектах внешней среды, а также в организме людей и животных. При обработке образцов модельных систем, чувствительность на порядок была ниже, чем в чистых культурах, поэтому при исследовании клинических образцов наиболее пригоден вариант пе81ес1-ПЦР и II метод выделения ДНК. ' Таким образом, разработанная нами тест-система может быть использована для индикации лептоспир в объектах окружающей среды и их дифференциации, от свободноживущих, что может быть использовано, как в таксономических целях, так и при эпидемиологическом анализе;

Задачей третьего этапа работы стала оценка параметров диагностической эффективности ПЦР тест-систем на основе гена,.

96 кодирующего липопротеин наружной мембраны лептоспир LipL32, на клиническом материале, полученном в очагах лептоспирозной инфекции.

Аналитическая чувствительность nested-варианта ПЦР, по крайней мере, на порядок превышает таковую ранее разработанной ПЦР тест-системы с праймерами G1/G2, что позволяет повысить диагностическую эффективность методов диагностики лептоспироза в целом. При исследовании сывороток больных в зависимости от сроков^ с момента заболевания показано, что диагностическая эффективность nested-ПЦР (100%) на ранних сроках заболевания (1 неделя) почти в 2 раза превышает таковую РМА (57%). Поэтому nested-ПЦР позволяет еще более повысить эффективность диагностики лептоспирозов, прежде всего в ранние сроки с момента заболевания при небольших концентрациях возбудителя в биологических материалах.

Диагностическиме возможности разработанных ранее ПЦР тест-систем [79, 30] ограничивались их относительно узкой таксономической специфичностью. Например, Самсоновой А. П. (1994) был разработан вариант тест-системы (с праймерами G1/G2) на основе родоспецифичной тест-системы ПЦР Gravekamp С. et al. (1990) авторам удалось осуществить индикацию патогенных лептоспир большинства эпидемически значимых серогрупп. Ее использование дает возможность в короткие сроки при относительно несложной методике обнаружить наличие патогенных лептоспир в исследуемом материале. Однако к недостаткам разработанной тест-системы ПЦР следует отнести невозможность выявления ДНК лептоспир ряда серогрупп и прежде всего одной из наиболее распространенных Grippotyphosa и Australis [79].

На территории РФ циркулируют представители 3 геномовидов: L. interrogans, L, kirschneri и L. borgpeterseni. Однако нельзя исключить возможность завоза на территорию страны новых ранее неизвестных возбудителей. Преимущество предлагаемой нами ПЦР тест-системы является ее универсальностьвозможность ПЦР диагностики лептоспирозов людей,.

97 вызываемых патогенными лептоспирам всех известных геномовидов, включая эпидемически значимые (Sejroe, leterohaemorrhagiae) и «новые» возбудители, по нашим данным недавно завезенные на территорию России (серогруппа Australis, серовар muenchen) [25].

Последнее представляется особенно важным в контексте разработки методов контроля и снижения угрозы трансграничного перемещения на территорию страны ранее неизвестных эндемичных лептоспир, антигены которых не представлены в диагностических тест-системах и вакцинных препаратах. Универсальность разработанной тест-системы, позволяющей i выявлять ДНК всех патогенных лептоспир номенвида L. interrogans sensu lato, дает основание рекомендовать испытание разработанной тест-системы не только в клинической, но и в ветеринарной. практике, в том числе для прижизненного контроля животных на лептоспироносительство.

Завершенные в последние годы проекты по секвенированию полных геномов патогенных и сапрофитных лептоспир, а также множества отдельных генов, создали основу для сравнения межвидовых и. внутривидовых особенностей лептоспир различных экологических групп и таксонов на основе объективных критериев.

Для лептоспир пока не разработаны рекомендации по набору маркерных генов для мультилокусного типирования. В этих целях могут быть использованы гены липопротеинов наружной мембраны лептоспир, «репертуар» которых хорошо изучен, и которые играют важную роль во взаимоотношениях лептоспир с окружающей средой и иммунном ответе при лептоспирозах.

Сравнительный анализ структурных особенностей генов, кодирующих липопротеины наружной мембраны свободноживущих и паразитических лептоспир, даст возможность получить новые данные о структурнофункциональных особенностях генома лептоспир, отличающихся по экологическим признакам и патогенности, а также разработать новые методы видовой дифференциации и внутривидового генотипирования, том числе, с.

98 целью геномной паспортизации коллекций.