Каталазная активность углеводородокисляющих бактерий

Актуальность работы. Проблема поиска микроорганизмов-деструкторов актуальна, поскольку загрязнение окружающей среды сырой нефтью и продуктами ее переработки носит глобальный характер. Самоочищение водоемов от нефтяного загрязнения — сложный, многоступенчатый процесс, включающий микробную трансформацию нефти и нефтепродуктов (Миронов О.Г., 2000; Куликова И. Ю., 2005; Жуков Д. В., Мурыгина В. П., Калюжный C.B. 2006; Buckley et al., 1976).

Основным источником углеводородокисляющих микроорганизмов являются пресноводные и морские экосистемы, как загрязненных, так и незагрязненных территорий (Израэль Ю.А., Цыбань A.B., 1989; Бердичев-ская М.М., 1991; Коронелли Т. В., 1994). В плане поиска активных деструкторов, наряду с исследованием биологических свойств монокультур и ассоциаций бактерий, оценивается их способность к деструкции нефти и нефтепродуктов (Ившина И.Б., Бердичевская М. В., 1995; Куюкина М. С. и др., 1999; Звягинцева И. С., 2001; Плотникова Е. Г., 2001; Сопрунова О. Б., 2005; Atlas R.M. et al., 1992; Kaledine L., 1997).

В аэробных условиях разные группы микроорганизмов способны к биодеградации углеводородов, входящих в состав нефти. При этом важнейшим фактором окисления является достаточное количество кислорода, расход которого достигает 3300 г на 1 л сырой нефти (Миронов О.Г., 2002; Перетрухин И. В. и др., 2006). Несмотря на то, что для каждого микроорганизма характерен свой специфический набор ферментов и особый путь окисления углеводородов, этот процесс катализируется системами оксиге-наз и оксидаз (Готтшалк Г., 1982). Кроме того в природной среде наряду с биоокислением протекают и процессы самоокисления нефти и нефтепродуктов, которые проходят по свободно-радикальному механизму и связаны с образованием пероксидов (Петров A.A., 1984; Мочалова О. С., Антонова K.M., Гурвич Л. М., 2002; Rojo F., 2009). При этом окислительный стресс, спровоцированный действием внешних факторов и формированием кислородных радикалов, сопровождается сильными изменениями в метаболизме бактерий, что может приводить, с течением времени, к гибели клетки (Современная микробиология ., 2005; Белозерская Т. А., Гесслер H.H., 2006). Поэтому в процессе эволюции микроорганизмы выработали механизмы защиты, основанные на детоксикации активных форм кислорода с участием каталазы, пероксидазы и супероксиддисмутазы (Чеснокова Н.П., Пону-калина Е.В., Бизенкова М. Н., 2006). Исходя из этого, реакция ферментных систем является важным показателем активности процесса нефтедеструк-ции.

Также известна реакция ферментных систем почв на нефтяное загрязнение. По данным Киреевой с соавторами (2001), наиболее чутко на загрязнение реагирует каталазная активность почв. Степень обогащенно-сти почв ферментами зависит, в том числе, и от микробной составляющей, однако, данные о каталазной активности микроорганизмов, входящих в состав почвенного биоценоза отсутствуют. Недостаточно изучена роль ферментов окислительного стресса в процессе микробной деструкции нефти.

Все вышеизложенное определило цель и задачи данного исследования.

Цель работы. Определить значение каталазной активности углево-дородокисляющих бактерий в процессе деструкции нефти и нефтепродуктов.

Основные задачи:

1. Выделить углеводородокисляющие бактерии из микробных ассоциаций водоемов с различным уровнем антропогенной нагрузки и определить их видовой состав.

2. Определить биологические свойства углеводородокисляющих бактерий выделенных из водоемов.

3. В эксперименте оценить динамику каталазной активности чистых культур и ассоциаций углеводородокисляющих бактерий в процессе деструкции нефти и нефтепродуктов.

4. Разработать способ отбора активных деструкторов нефти и нефтепродуктов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Каталазная активность способствует адаптации и выживанию бактерий, а также является индикатором их способности к биодеградации нефти и нефтепродуктов.

2. Каталазная активность углеводородокисляющих микроорганизмов, обладая диапазоном реакции, чутко реагирует на изменение содержания нефти и нефтепродуктов в среде и может быть использована при поиске новых активных штаммов-деструкторов.

Научная новизна. В результате исследования изучена распространенность и видовой состав углеводородокисляющих бактерий в эвтрофных и мезотрофных водоемах в зависимости от сезонной динамики и антропогенной нагрузки на них. Определены доминирующие виды планктонных углеводородокисляющих бактерий. Показано, что значительную долю в общей численности углеводородокисляющих микроорганизмов эвтрофных озерных экосистемах занимали грампозитивные бактерии (включая группу нокардиоформных актиномицет, а также роды Bacillus, Micrococcus), тогда как в мезотрофных — грамотрицательные бактерии, представленные видами рода Pseudomonas. В реке Илек, испытывающей высокую антропогенную нагрузку, видовой состав верхнего и среднего течения представлен видами группы нокардиоформных актиномицет, тогда как в нижнем течении доминировали виды Pseudomonas и Alcaligenes.

Распространенность и выраженность каталазной активности зависела от таксономической принадлежности выделенных бактерий и антропогенной нагрузки испытываемой водоемами. В мезотрофных водоемах численно доминировали штаммы с более высокими значениями каталазной активности (более 4,6 усл.ед.), по сравнению с эвтрофными (от 3,1 до 4,5 усл.ед.). Наиболее высокие значения каталазной активности были отмечены среди грамнегативных штаммов рода Pseudomonas, а среди грампози-тивных — у Xanthobacter sp.

На основании изучения биологических свойств показано, что доля углеводородокисляющих бактерий с уровнем антилизоцимной активности от 6 до 10 мкг/мл была ниже в мезотрофных водоемах и составила 20%, по сравнению с эвтрофными (более 30%), свидетельствуя об их экологическом неблагополучии.

На модели альго-бактериальной ассоциации показано, что каталазная активность бактерий симбионтов способствовала их сохранению и выживанию.

Впервые выявлено изменение каталазной активности штаммов-деструкторов в процессе потребления углеводородов. Установлена тесная корреляционная связь между степенью снижения каталазной активности штамма-деструктора и эффективностью потребления нефти или нефтепродуктов. Разработан новый подход к отбору штаммов активных деструкторов нефти и нефтепродуктов (патент РФ № 2 396 340 (2010) — патент РФ № 2 426 781 (2011)).

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые сведения, имеющие теоретическое значение для понимания процессов биодеструкции углеводородов. Выявлено, что каталазная активность углеводородокисляющих бактерий является отражением интенсивности процесса деструкции нефти микроорганизмами.

Прикладным аспектом работы является использование разработанных подходов для выбора штаммов-деструкторов нефти и нефтепродукта. Изолированы из объектов внешней среды и поддерживаются в чистой культуре 40 штаммов углеводородокисляющих бактерий. Штамм Gordona terrae — активный деструктор нефти и нефтепродуктов, размещен во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГосНИИ Генетики (ВКПМ, г. Москва) под номером Ас-174.

Апробация работы. Основные результаты исследования доложены и обсуждены на Международной конференции «Биоиндикация в мониторинге пресноводных экосистем» (Санкт-Петербург, 2006) — IX Съезде Гидробиологического общества при РАН (Тольятти, 2006) — 2-ом Байкальском Микробиологическом симпозиуме с международным участием (Иркутск, 2007) — X Съезде Гидробиологического общества при РАН (Владивосток, 2009) — XI Всероссийской конференции «Персистенция микрорганизмов 2009» (Оренбург, 2009) — Межрегиональной научной конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии» (Оренбург, 2011) — школе-конференции молодых ученых «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2011).

Инновационные разработки отмечены дипломами на Международном форуме по нанотехнологиям «Роснанотех» (Москва, 2010) — Международном научно-промышленном форуме «Единая Россия» (Нижний Новгород, 2010) — «Региональном молодежном инновационном конверте» (Оренбург, 2011) — золотой медалью X Московского международного салона инноваций и инвестиций (Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 4 работы — в изданиях рекомендованных ВАК, получено 2 патента РФ на изобретение: «Штамм Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 для разложения нефти и нефтепродуктов» (№ 2 396 340, 2010) и «Способ выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов» (№ 2 426 781,2011).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Одним из подходов к решению проблемы широкомаштабного загрязнения окружающей среды нефтью и продуктами ее переработки является использование микроорганизмов-деструкторов для очистки загрязненных экосистем (Израэль Ю.А., Цыбань A.B. 1989; Патин С. А. 1997).

Углеводородокисляющие микроорганизмы это постоянный компонент природного биоценоза, не являясь узкоспециализированной группой, они участвуют в разложении органического вещества в процессе естественного самоочищения экосистемы, и присутствуют как в загрязненных, так и в незагрязненных водах и почвах. От других компонентов гетеротрофного сообщества они отличаются наличием комплекса ферментов окисляющих углеводороды и способностью к поглощению гидрофобного субстрата (Коронелли Т.В. и др., 1989; Кураков A.B., и др., 2006; Павлова О. Н. и др., 2008; Зайцева Т. А. и др., 2010). Все это обеспечивает им преимущество над остальными группами микроорганизмов при загрязнении среды нефтью и нефтепродуктами.

Исходя из этого, углеводородокисляющие сообщества наземных экосистем являются источником новых аборигенных микроорганизмов-деструкторов нефти или нефтепродуктов (Ившина И.Б., Бердичевская М. В. 1995; Звягинцева И. С. 2001, Плотникова Е. Г. 2001; Куликова И. Ю. 2005, Сопрунова О. Б. 2005).

В изучаемых водоемах присутствовали как грампозитивные, так и грамнегативные углеводородокисляющие бактерии. За период исследования нами было обнаружено 34 вида углеводородокисляющих бактерий. Наибольшее разнообразие в составе углеводородокисляющего бактерио-планктона среди исследованных лентических водоемов было характерно для озера Беленовское, а наименьшее — для озера Рудничное. Среди углеводородокисляющих бактерий как загрязненных так и не загрязненных озерных экосистем, доминировали грамотрицательные микроорганизмы, представленные видами рода Pseudomonas (Бердичевская М.В. и др., 1984; Коронелли Т. В., 1996; Миронов О. Г., 1999, 2000; Кураков A.B. и др., 2006; Belyaev S.S. et al., 1993). В озере Беленовское отмечена высокая доля угле-водородокисляющих бактерий в общей численности гетеротрофного бак-териопланктона и большая доля грампозитивных бактерий, среди которых присутствует группа нокардиоформных актиномицет.

На разных участках реки Илек отмечено присутсвие в бактерио-планктоне углеводородокисляющих бактерий. В верхнем и среднем течении реки доминировали бактерии группы нокардиоформных актиномицет, а в нижнем течении — виды рода Pseudomonas. Присутствие в гетеротрофном бактериопланктоне группы нокардиотрофных актиномицет свидетельствует о поступлении в водоем нефтепродуктов. Индикаторная значимость этой группы углеводородокисляющих бактерий подтверждается рядом исследователей (Рубцова С.И. 2002; Коронелли Т. В., 1996аМиронов О.Г., 1970), показавших, что присутствие в воде этих микроорганизмов позволяет судить о наличии в воде нефти или нефтепродуктов. Кроме того, по берегам р. Илек в верхнем течении располагаются крупные населенные пункты и промышленные предприятия, являющиеся по официальным данным, источниками загрязнения вод, в том числе и нефтепродуктами (Государственный доклад ., 2010), что напрямую подтверждают’результаты микробиологических исследований.

Численность и разнообразие углеводородокисляющих бактерий в пресноводных экосистемах подвержено сезонной изменчивости, под влиянием смены температурного режима, а также динамики содержания биогенных веществ, что согласуется с данными других исследователей (Мар-цинкевич С.Я., 1983; Кураков A.B. и др., 2006; Delille D., Valliant N., 1990).

Тем не менее, наиболее показательным периодом, свидетельствующим о загрязнении водоема нефтью и нефтепродуктами, является зима. Установлено, что в зимний период в эвтрофном оз. Беленовское, доминировал штамм Pseudomonas putida. Одновременно в бактериопланктоне ме-зотрофного водоема (оз. Рудничное) углеводородокисляющие бактерии не выявлены. В реке Илек, подверженной антропогенной нагрузке, в зимний период преобладали грамнегативные бактерии с доминированием по численности видов рода Pseudomonas. Высокая численность углеводородо-кисляющих бактерий в зимний период косвенно свидетельствует о присутствии углеводородов в экосистеме (Миронов О.Г. и др., 1985; Atlas R.M. et al., 1978).

Ранее для пресноводных экосистем были описаны функциональные взаимодействия «лизоцим-антилизоцим» и «перекись водорода-каталаза бактерий» (Бухарин О.В., Немцева Н. В. 2002; 2003; Игнатенко М. Е., 2008), которые не изучены применительно к углеводородокисляющим микроорганизмам. Среди выделенных углеводородокисляющих бактерий антили-зоцимная активность встречалась только у грамнегативных изолятов, тогда как каталазная активность была характерна для всех изученных культур микроорганизмов. По нашим данным, распространенность и выраженность антилизоцимной активности углеводородокисляющих бактерий была выше в эвтрофных водоемах (озеро Беленовское, река Илек), чем в мезо-трофном (озеро Рудничное). Учитывая, что по данным ряда авторов анти-лизоцимная активность служит диагностическим признаком для оценки санитарного состояния водоемов (Немцева Н.В., 1998; Бухарин О. В., Немцева Н. В., 2008), то присутствие видов с антилизоцимной активностью в углеводородокисляющем бактериоценозе, может также указывать на не благополучное экологическое состоянии водоемов.

При изучении каталазной активности выявлено, что в эвтрофных экосистемах (озеро Беленовское, река Илек) численно преобладали углеводородокисляющие штаммы со значениями каталазной активности от 3,0 до 4,5 усл.ед., а в мезотрофном оз. Рудничное численно доминировали штаммы с более высокими значениями каталазной активности от 4,5 до 6,0 усл.ед.

В альго-бактериальной ассоциации зеленой водоросли Chlamydomo-nas reinhardtii выявлены бактерии симбионты с уровнем каталазной активности от 3,4 до 4,0 усл.ед., оказывающие на водорослевые клетки рост стимулирующее влияние, выражающееся в увеличении скорости роста более чем в два раза и более длительном сохранении культуры водоросли. Показано, что высокий уровень каталазной активности бактерий-симбионтов обеспечивает их сохранение в альгосообществе. Аналогичные данные, подтверждающие значение высокого и среднего уровня каталазной активности бактерийных симбионтов для выживания и поддержания симбиотических связей с различными водорослями были получены Игна-тенко М.Е. (2008).

Известно, что в процессе окисления углеводородов образуются пе-роксиды (Петров A.A., 1984; Жуков Д. В., Мурыгина В. П., Калюжный C.B., 2006), в детоксикации которых участвует каталаза (Полесская О.Г., 2007). В результате проведенных исследований было установлено, что для бактерий активных деструкторов в присутствии нефти и нефтепродуктов характерно увеличение численности и снижение каталазной активности. В то же время, у бактерий не способных использовать нефтяные углеводороды в качестве единственного источника углерода и энергии, численность и ка-талазная активность практически не изменяются, оставаясь на уровне близком к исходному. Аналогичные данные получены и при исследовании ассоциации углеводородокисляющих бактерий Acinetobacter sp. и G. terrae, имеющих разные подходы к потреблению углеводородов. Было показано, что при совместном потреблении нефти Сорочинского и Бугурусланского месторождений на начальном этапе доминировал грамнегативный штамм {Acinetobacter sp.), тогда как грампозитивный штамм (G. terrae) доминировал после 12 суток. Наблюдаемое явление, вероятно, связано с разной стратегией потребления углеводородов. Известно, что особенности строения клеточной стенки G. terrae обеспечивают поглощение углеводородов путем пассивной диффузии и окисление углеводородов начинается после полного пропитывания клеточной стенки бактерий. Acinetobacter sp. в силу особенностей строения не имеет толстой гидрофобной клеточной стенки подобно G. terrae, поэтому для этих микроорганизмов присущ другой тип стратегии. Они выделяют во внешнюю среду биоэмульгатор, для снижения гидрофобности углеводородов и способствуя их солюбилизации (Коронел-ли Т.В., 1996; Кураков A.B. и др., 2006; Hisatsuka К. and el., 1977).

Обнаруженное нами последовательное доминирование микроорганизмов при деструкции нефти и нефтепродуктов согласуется с данными Ильинского В. В. с соавторами (1998), полученными при исследовании уг-леводородокисляющего сообщества Можайского водохранилища.

В результате проведенного исследования была установлена прямая зависимость между уровнем каталазной активности бактерий-деструкторов и содержанием нефти или нефтепродукта в субстрате. Ранее подобная зависимость была найдена между уровнем каталазной активности почвы и содержанием в ней нефтепродуктов. При этом нефтяное загрязнение почв приводило к снижению их ферментативной активности. (Киреева H.A., Водопьянов В. В., Мифтахова A.M., 2001; Киреева Н. В. и др., 2006; Киреева H.A., Кабиров Т. Р., Дубовик И. Е. 2007; Сулейманов P.P. с соавторами, 2008). Представленные данные касаются суммарной каталазной активности почв без учета активности микробной компоненты. Выявленная нами роль каталазной активности углеводородокисляющих бактерий в процессе деструкции нефти вносит существенный вклад в понимание формирования суммарной каталазной активности почв при нефтедест-рукции, что имеет существенное значение для развития теории самоочищения почв.

В работе выявлен эффект снижения каталазной активности бактерий на фоне одновременного увеличения их численности, наблюдаемый в условиях накопления активных форм кислорода. Учитывая, что в условиях окислительного стресса наблюдается быстрая инактивация ферментов и для их повторного накопления требуется значительный промежуток времени, ферментная защита бактериальной клетки с помощью каталазы становится менее эффективной (Кения М.В., Лукаш А. И., Гуськов Е. П., 1993; Чеснокова Н. П., Понукалина Е. В., Бизенкова М. Н., 2006). Исходя из этого, следует предположить наличие альтернативных механизмов клеточной защиты от активных форм кислорода.

В нашем исследовании удалось обнаружить эффект снижения каталазной активности углеводородокисляющими бактериями в процессе неф-тедеструкции, что, вероятно, связано с внутрипопуляционными процессами. Можно предположить, что в определенные периоды деструкции углеводородов бактериями неферментные антиоксиданты (трегалоза, гликоген, полисахариды и миколаты трегалозы) осуществляют эффективную защиту от активных форм кислорода, позволяя бактериям не расходовать энергию на синтез антиоксидантных ферментов, в частности каталазы (Феофилова Е.П., 1992).

Полученные результаты позволили выделить в процессе 'бактериальной деструкции углеводородов две фазы.

В первую фазу происходило взаимодействие бактерий с субстратом и окисление углеводородов с участием растворенного кислорода и оксиге-наз бактерий. Этот период сопровождался увеличением численности угле-водородокисляющих бактерий, а также регистрировалась высокая светимость культуральной среды в реакции хемилюминесценции, свидетельствуя о присутствии активных форм кислорода. Это сопровождадось снижением каталазной активности бактерий, а также убылью углеводородов в среде. Как правило, эта фаза длилась от 12 до 23 суток. высокая интенсивность хемилюминесценции.

С ^ низкая интенсивность хемилюминесценции.

V', У увеличение численности бактерий снижение численности бактерий снижение каталазной активности увеличение каталазной активности.

Рис. 36 — Схема бактериального процесса деструкции углеводородов.

Во вторую фазу происходила утилизация продуктов окисления нефтепродуктов, сопровождавшаяся постепенным снижением концентрации углеводородов в среде. Одновременно наблюдалось снижение светимости среды в реакции хемилюминесценции, численности бактерий и увеличение их каталазной активности. Продолжительность фазы составляла от 23 до 35 суток (рис. 36).

Практическим аспектом работы является разработка способа выбора штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов. В основе способа лежит способность бактерий снижать каталазную активность при потреблении углеводородов. К активным деструкторам нефти и нефтепродуктов предложено относить бактерии, каталазная активность которых в течение первых 12 суток культивирования снизилась на 30% и более. Исходя из этого, каталазная активность углеводородокисляющих микроорганизмов может служить индикатором процесса деструкции, что позволяет использовать ее для отбора эффективных деструкторов нефти и нефтепродуктов.

Продуктом инновации является новый штамм углеводородокисляющих бактерий Gordona terrae ВКПМ Ас-1741 пригодный для высокоэффективной очистки загрязненных объектов внешней среды от нефти и нефтепродуктов. Его эффективность потребления нефти и нефтепродуктов составляет от 70% до 90%, в зависимости от вида углеводородов. Штамм размещен во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и ему присвоен номер ВКПМ Ас-1741), получен патент РФ № 239 640 на «Штамм Gor dona terrae ВКПМ Ас-1741 для разложения нефти и нефтепродуктов.

Подводя итог, следует выделить два основных момента:

• Каталазная активность углеводородокисляющих бактерий является индикатором их способности к биодеградации нефти и нефтепродуктов, а также способствует их адаптации и выживанию в природной среде.

• Обладая диапазоном реакции, каталазная активность углеводородокисляющих микроорганизмов чутко реагирует на изменение содержания нефти и нефтепродуктов в среде и может быть использована при поиске новых активных штаммов — деструкторов.