Биосинтез янтарной кислоты дрожжами из этанола

Актуальность проблемы.

Янтарная кислота (ЯК) широко используется в химической промышленности в качестве исходного сырья для производства различных четырехуглеродных соединенийна её основе получают биодеградируемые полимеры, применяемые при производстве пищевых плёнок и упаковок, средств личной гигиены и одноразовой посуды. В пищевой промышленности ЯК применяется в качестве пищевой добавки, подкислителя и консерванта. В последние годы ЯК стала применяться в здравохранении. Исследованиями научной школы М. Н. Кондрашовой (ИТЭБ РАН) показано, что ЯК является сигнальным веществом, связывающим энергетическую и гормональную системы организма. На основании этих исследований разработан ряд биологически активных добавок и лекарственных средств на основе ЯК. Производство ЯК ежегодно возрастает не менее, чем на 10% (Sauer et al., 2008).

В настоящее время ЯК получают методом-химического синтеза из малеиновой кислоты или ее ангидрида, с использованием дорогостоящего катализатора ванадия. Известно, что малеиновая кислота и соединения ванадия являются клеточными ядами, и даже небольшие их примеси резко снижают качество ЯК. Также для получения ЯК используется процесс термического разложения янтаря и его очистки путем многократной перекристаллизацииоднако этот процесс является дорогостоящим.

В последние годы наиболее перспективным рассматривается микробиологический синтез ЯК, при котором произведенный продукт характеризуется высокой чистотой и по своему конформерному составу близок к природной субстанции. По оценке специалистов замена химического-метода получения’ЯК на микробиологический снизит не только риск загрязнения окружающей среды, но и увеличит производство ЯК с 16 до 270 ООО т/год, что, в свою очередь, может существенно расширить сферы применения ЯК и химических соединений, полученных на её основе.

В литературе имеется мало сведений о сверхсинтезе ЯК микроорганизмами. В лабораториях США, Китая и Франции предпринимались попытки разработать промышленный процесс получения ЯК с помощью различных генетически-модифицированных мутантных штаммов анаэробных бактерий Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Escherichia coli и Mannheimia succiniciproducens при их росте на углеводах. Эти работы не привели к положительным результатам в связи с тем, что мутанты со временем теряли свою кислотообразующую активность. Имеются данные о сверхсинтезе ЯК у аэробных организмов — дрожжей и грибов (Sato et al., 1972; Ермакова, Мандева, 1981), но дальнейшего развития эти исследования не получили. Большая потребность в. ЯК при всей сложности её химического синтеза, делает проблему разработки микробиологического способа её получения весьма актуальной.

Цель и задачи исследования

.

Целью настоящей работы было изучение закономерностей синтеза ЯК дрожжами из этанола и разработка способа получения и выделения этого продукта. В число основных задач входило:

1. Изучение способности дрожжей различного таксономического положения синтезировать ЯК;

2. Определение условий культивирования дрожжей, оптимальных для получения ЯК;

3. Исследование физиолого-биохимических особенностей роста дрожжей в среде с этанолом в условиях сверхсинтеза ЯК;

4. Разработка микробиологического способа получения ЯК из а-кетоглутаровой кислоты (КГК) с участием тиаминауксотрофных дрожжей Yarrowia lipolytica',.

5. Разработка метода выделения и очистки препарата ЯК высокой чистоты;

6. Сравнение биологической активности полученного препарата с коммерческими* синтетическими препаратами.

Научная новизна работы'.

Впервые установлена’принципиальная возможность направленного, синтеза ЯК дрожжами из этанола при лимитировании их роста источником азотаотобраны наиболее активные продуценты Candida zeylanoides ВКМ Y-2324 и С. catenulata ВКМ Y-5- оптимизированы условия культивирования (рН среды, концентрация растворенного кислорода) и состав питательной среды (концентрации азота, этанола и микроэлементов), обеспечивающие максимальный синтез ЯК.

Показано, что сверхсинтез ЯК у С. zeylanoides ВКМ Y-2324 и С. catenulata ВКМ Y-5 обусловлен особенностью функционирования глиоксилатного цикла, в частности высокой активностью ферментов цитратсинтазы, аконитат-гидратазы и изоцитрат-лиазы.

Впервые разработан принципиально новый способ получения ЯК, включающий последовательный микробиологический синтез КГК из этанола тиаминауксотрофными дрожжами1 Y. lipolytica ВКМ Y-2412 и ее дальнейшее эквимолярное окисление до ЯК под воздействием перекиси водорода. Разработана схема выделения ЯК из культуральной жидкости и очистка её до высокой чистоты.

Практическая значимость исследования «.

Предложенный микробиологический способ получения ЯК может заменить дорогостоящий химический синтез. ЯК, полученная данным способом, обеспечивает требуемый уровень чистоты и биологической активности, позволяющий использовать её в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве (протокол о проведении процесса биосинтеза и приготовлении опытной партии янтарной кислоты на базе Опытной технологической установки ИБФМ РАН от 20.04.11, протокол о проведении испытаний янтарной кислоты на содержание токсичных элементов ООО «ИЛ Тест-Пущино» № 2695 от 25.04.11, отчёт о проведении доклинических испытаний ГОУ ВПО РГМУ Росздрава № 22/10 от 15.04.10).

Апробация работы.

Основные материалы диссертации были представлены на Международных Пущинских школах-конференциях для молодых учёных (2007, 2008, 2010), ежегодных стендовых сессиях ИБФМ РАН (2007;2009), Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва, 2008), Первом научно-практическом симпозиуме «Научная молодёжь — биотехнологии России», (Пущино, 2008), Российском молодёжном инновационном конвенте (Москва, 2008), Форуме молодых учёных и 35-ом РЕВБ конгрессе (Гётеборг, Швеция, 2010). '.

Структура и объём диссертации.

Диссертационная — работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований, изложение полученных результатов и их обсуждение, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, приложений. Работа изложена на 124 страницах, содержит 17 таблиц и 17 рисунков.

Список литературы

включает 251 наименований, из них 177 — публикации в иностранных изданиях.

ВЫВОДЫ.

1. Установлена способность дрожжей различного таксономического положения синтезировать янтарную кислоту из этанола. Показано, что многие виды родов Candida, Pichia, Yarrowia образуют, наряду с другими органическими кислотами, янтарную кислоту в условиях лимитирования роста азотом. Наиболее активными продуцентами янтарной кислоты являлись штаммы Candida zeylanoides ВКМ Y-2324 и Candida catenulata ВКМ Y-5.

2. Показано, что условия культивирования продуцентов (концентрация растворенного кислорода, азота, этанола и ионов Zn2+) определяют качественный и количественный состав экскретируемых веществ. Для продуцентов С. zeylanoides ВКМ Y-2324 и С. catenulata ВКМ Y-5 подобраны оптимальные условия для роста и синтеза янтарной кислоты: высокая аэрация средысодержание этанола не выше 1,0 г/л для С. catenulata и 3,0 г/л для С. zeylanoides-, повышенное содержание ионов цинка — 0,4 мг/л для С. zeylanoides и 26,0 мг/л для С. catenulata.

3. Показано, что сверхсинтез янтарной кислоты у С. zeylanoides ВКМ Y-2324 и С. catenulata ВКМ Y-5 обусловлен особенностью функционирования глиоксилатного цикла. В условиях лимитирования роста азотом сохраняется высокая активность ферментов цитратсинтазы, аконитат-гидратазы, и изоцитрат-лиазы, обеспечивающих образование ЯК.

4. Разработан способ получения янтарной кислоты из этанола, включающий микробиологический синтез а-кетоглутаровой кислоты тиаминауксотрофными дрожжами Yarrowia lipolytica 212 (ВКМ Y-2412) и ее дальнейшее химическое декарбоксилирование до янтарной кислоты под воздействием перекиси водорода. Максимальная концентрация янтарной кислоты составила 63,4 г/л.

5. Разработан способ выделения янтарной кислоты, включающий стадии разложения остаточных количеств перекиси водорода, подкисления и концентрирования культуральной жидкости, экстракции янтарной кислоты этанолом и дальнейшей её перекристаллизации с целью очистки до высокой чистоты.

6. Высокое качество полученного препарата и его соответствие квалификации «biochemical grade» подтверждено результатами исследования его окисления митохондриями животных в сравнении с коммерческим препаратом фирмы Sigma.

Глава 4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В итоге настоящей работы. показана возможность практического получения ЯК из этанола при культивировании дрожжей.

В результате исследований было установлено, что способность к экскреции ЯК характерна для многих видов дрожжей, относящихся к родам Candida, Debaromyces, Pichia, Yarrowia, Kluyveromyces, Torulopsis и Saccharomyses при росте в среде с этанолом.

В качестве наиболее активных продуцентов ЯК были отобраны штаммы С. zeylanoides ВКМ Y-2324 и С. catenulata ВКМ Y-5 и с ними проводилась дальнейшая работа по подбору условий культивирования оптимальных для роста и накопления ЯК.

Следует отметить, что использование этанола в качестве источника углерода для культивирования создаёт определённые трудности из-за токсичности этого соединения для клеток дрожжей. Поэтому исследовали влияние этанола на рост дрожжей С. catenulata и С. zeylanoides в широком дипазоне концентраций. Было установлено, что этанол следует вносить в среду культивирования дробно в количестве не превышающем 1,0 г/л для С. catenulata и 3,0 г/л для С. zeylanoides.

При исследовании потребности дрожжей С. catenulata в азоте была получена линейная зависимость между плотностью биомассы и концентрацией сульфата аммония в среде, которая имела следующий вид: Y = 4,3 5х + 0,673. Использование данной зависимости может быть полезной при масштабировании процессов культивирования дрожжей с целью определения концентрации азота для получения запланированной рабочей биомассы в ферментере.

В дальнейших экспериментах была показана важная роль цинка, который входит в активный центр НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы — первого фермента окисления этанола. Было определено, что различные концентрации цинка в среде оказывают влияние на рост и синтез ЯК дрожжами. Так, у С. zeylanoides концентрация ионов Zn2+ ниже 0,2 мг/л лимитировала рост культуры, и синтез. ЯК отсутствовал. Концентрация ионов Zn, равная 0,4 мг/л, была оптимальной для роста С. zeylanoides и продукции ЯК. Дальнейшее повышение концентрации ионов цинка вызывало снижение накопления биомассы и синтеза ЯК. Для С. catenulata обнаружен более широкий I диапазон концентраций ионов Zn (0,02 — 200 мг/л), оптимальных для роста клеток и биосинтеза ЯК. Наибольшая продукция ЯК наблюдалась при концентрации ионов Zn2+, равной 26 мг/л.

Установлено, что важным фактором, влияющим на рост дрожжей и синтез ЯК, является аэрация, и активное кислотообразование наблюдается в условиях интенсивной аэрации среды.

При проведении" процесса ферментации в оптимальных условиях в аппаратах АНКУМ-2М на 68 ч роста С. сШепиШа экскретировали 5,2 г/л ЯК, а С. 2еу1апо'к1е>ч — 9,4 г/л ЯК. Выход ЯК для С. сШепиШа и С. геу1апо1с1ех составлял 32,6% и 39% соответственно. В значительных количествах в качестве побочного продукта происходило накопление яблочной кислоты. Эти данные указывали на активное функционирование ГЛЦ в продукции ЯК из этанола.

Действительно, было установлено, что активности ферментов ЦТК — НАД-изоцитратдегидрогеназы и кетоглутаратдегидрогеназы были низкими, а активность изоцитрат-лиазы (ключевого фермента ГЛЦ) сохранялась на высоком уровне в экспоненциальной фазе и поддерживалась достаточно высокой в период синтеза ЯК (0,64 Ед./мг белка).

Также проводили сравнительное изучение активности изоцитрат-лиазы у 11 штаммов дрожжей, способных к продукции ЯК на этаноле. В качестве контроля использовали рост этих штаммов на глюкозе, когда синтез ЯК был незначительный. У всех штаммов при росте на этаноле активность изоцитрат-лиазы была существенно выше активности фермента у клеток, растущих на глюкозе. Таким образом, полученные данные позволяют сделать заключение, что сверхсинтез ЯК у исследуемых дрожжей являлся результатом активного функционирования ГЛЦ на среде с этанолом.

Следующим этапом работы явилась разработка метода получения ЯК, включающий синтез КГК с использованием дрожжей У Иро1уНса 212 и её дальнейшее окисление до ЯК в присутствии перекиси водорода.

Был отобран продуцент КГК — дрожжи У. Нро1уИса 212, и подобраны условия, которые обеспечивали максимальное кислотообразование штамма при росте в среде с этанолом: высокая аэрация среды и рН=3,5−6,0.

Была также проверена и доказана возможность проведения реакции декарбоксилирования КГК до ЯК в фильтрате культуральной жидкости и подобрана концентрация перекиси водорода (100 мМ/л), которая не ингибировала рост дрожжей.

На базе опытной технологической установки ИБФМ РАН проведена апробация процессов биосинтеза КГК из этанола дрожжами Уаггоц>1а Иро1уНса 212 и ее дальнейшее химическое декарбоксилирование до ЯК под воздействием перекиси водорода. Проведено три цикла биосинтеза ЯК в ферментерах объемом 10 — 100 л, а также выделения и очистки ЯК. Накопление продукта при биосинтезе составило около.

63 г/л, выход готового продукта, соответствующего требованиям СанПиН 2.3.2.1078−0 после выделения и очистки в среднем составил 55%. (Приложение 1) — чистота кристаллов ЯК составила 99,9%.

На заключительном этапе работы препарат ЯК сравнивали по биохимическим параметрам с ЯК фирмы Sigma. Было показано, что различия между препаратом ЯК, полученным нами и коммерческим препаратом ЯК фирмы Sigma минимальны.

В связи с тем, что ЯК планировалось использовать в доклинических испытаниях, эта кислота была проанализирована на содержание токсичных элементов аккредитованной организацией ООО «ИЛ ТЕСТ-ПУЩИНО». Установлено, что их содержание в препарате было в 5−10 раз ниже ПДК (Приложение 2).

Также на базе Испытательного лабораторного центра Российского государственного медицинского университета (г. Москва) было проведено изучение острой токсичности и характера вредного действия ЯК на организм животных. Было сделано заключение о том, что ЯК является малоопасным веществом при введении в желудок лабораторным животным (4 класс опасности по ГОСТ 12.1.007−76), не обладает кожно-резорбтивным действием, оказывает раздражающее действие на кожу и слизистые оболочки. Сенсибилизирующее действие кислоты не обнаружено. Предварительное введение в желудок белым мышам ЯК в дозе 1000 мг/кг оказывало антигипоксическое действие (Приложение 3).