Экспрессия и характеристика новых изоформ лиганда Wnt11

1.1 Введение.

Среди характерных свойств злокачественных новообразований особого внимания заслуживают инвазивный рост и метастазирование. Именно благодаря этим качествам опухоль поражает не только исходный орган или ткань, но проникает в соседние ткани и распространяется в организме пациента. В основе инвазивного роста лежат взаимосвязанные изменения в организации цитоскелета, нарушается взаимодействие клеток между собой и с межклеточным матриксом. Метастазирование — образование вторичных очагов опухолевого роста — наиболее опасное проявление опухолевой прогрессии, являющееся основной причиной смерти онкологических больных. Чтобы дать метастаз клетка должна приобрести ряд свойств: умение проникать в глубину окружающих нормальных тканей, в том числе в кровеносные или лимфатические сосудыспособность выживать после попадания в сосуды, а затем выходить из них и размножаться в несвойственном для данного типа клеток микроокружении, давая новый очаг опухолевого роста [1].

Инвазивный рост и метастазирование объединяет способность клеток к движению. Это свойство также как и некоторые другие черты опухолевой клетки (высокий пролиферативный потенциал, отсутствие клеточной дифференцировки) характерно для клеток эмбриональных тканей. Сигнальные пути, регулирующие эмбриональное развитие, часто активированы в опухолевых клетках, например, Notch, BMP и Wnt [113]. Роль лигандов Wnt в формировании меланоцитов в образовании, а затем в прогрессии меланомы активно исследуется и может иллюстрировать общность процессов эмбрионального развития и злокачественного перерождения. Сочетание лигандов Wnt контролирует образование нервной трубки и нервного гребня [210]. Также активацией различных компонентов сигнального каскада Wnt сопровождается процесс созревания, позиционирования и дифференцировки клеток нервного гребня, будущих меланоцитов [57]. В то же время установлено, что нарушения в регуляции сигнальных каскадов, запускаемых лигандами семейства Wnt, играют ключевую роль в злокачественном перерождении меланоцитов — образовании меланомы [106, 158].

Меланобласты пролиферируют и мигрируют, тогда как меланомные клетки пролиферируют и метастазируют. Растет число свидетельств того, что эти процессы, контролируются одними и теми же сигнальными путями [194]. В эмбриональном развитии движение клеток нервного гребня, предшественников меланоцитов, регулируется лигандом Wnt 11 [50, 120]. Однако роль этого лиганда в процессе метастазирования меланом остается не изученной. Усиление экспрессии Wntll 6 детектировано в клетках различных опухолей, в том числе колоректального рака [98, 137]. В норме этот лиганд задействован в регуляции пролиферации, трансформации и миграции клеток эпителия кишечника [143]. Естественно предположить, что Vntll играет непосредственную роль в процессах формирования и, особенно, прогрессии колоректального рака. Для различных сигнальных каскадов описаны механизмы, регулирующие активность лигандов за счет альтернативного сплайсинга [4, 146]. Однако, в случае сигнального пути Viit, информация о существовании изоформ лигандов Уп1 ограничивается несколькими фактами [61, 169]. Экспериментальные данные о существовании изоформ лиганда Ь? пШ отсутствуют, хотя они потенциально могут иметь другое функциональное значение и играть роль, в том числе, и при развитии опухолевых заболеваний.

В связи с вышеизложенным, цель настоящей работы состояла в изучении экспрессии лиганда ЬЛУпЙ 1 в клеточных линиях опухолей различного происхождения и его роль в регуляции сигнальных путей ¥-п1:. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. исследовать экспрессию лиганда 1г\/п1−11 в опухолевых клеточных линиях;

2. провести поиск изоформ лиганда ИАУп! 11;

3. исследовать функциональные свойства изоформ лиганда 1Л^п1−11;

2. Обзор литературы.

Современные представления о механизмах регуляции сигнальных путей Wnt и их роль в канцерогенезе.

2.1 Белки Wnt.

В восьмидесятых годах прошлого века было положено начало исследованиям, которые ведутся по сей день и становятся все более и более актуальными. Речь идет об изучении сигнального пути Wnt. В 1982 году в журнале Cell была опубликована статья, в которой сообщалось о гене int-1, активируемом в результате интеграции вируса (инсерционной мутации), происходящей при заражении вирусом опухоли молочной железы мышей (Mouse Mammary Tumor Virus, MMTV) [140]. В 1987 году было показано, что белок int-1 является гомологом белка wingless плодовой мушки Drosophila melanogaster, относящегося к классу белков, регулирующих полярность каждого сегмента тела насекомого [155, 192]. Объединение названий этих белков образовало имя Wnt. Сейчас семейство белков Wnt активно изучается, с точки зрения строения генов, кодирующих белки, структуры и свойств самих белков и, главное, эффектов, вызываемых ими [126].

Уже первые исследования белка int-1 дали основания полагать, что этот белок является секретируемым. Данное предположение было сделано на основании анализа аминокислотной последовательности (наличие лидерного пептида) и посттрансляционных модификаций (гликозилирование). В дальнейшем было подтверждено, что int-1 секретируется, но остается связанным с поверхностью клетки, не являясь при этом трансмембранным белком. Было высказано предположение, что его функции сродни ростовым факторам, причем с паракринным или аутокринным типом сигнала [144, 145]. Сейчас известно о существовании белков семейства Wnt у различных многоклеточных животных. Число типов белков семейства разнится от пяти (С. elegans) до девятнадцати (Я. sapiens). Для всех членов семейства характерна определенная консервативность в структуре генов (обычно четыре экзона), аминокислотной последовательности (около 370 аминокислот, лидерный пептид, консервативно расположенные цистеины) в строении и свойствах белка (гликозилирование, гидрофобность, презентация на поверхности клетки) [126].

Рассмотрение белков wg и int-1 как членов одного семейства предполагает, что информация об одном из них хотя бы отчасти справедлива и для другого. Исходно int-1 был обнаружен в опухолевых клетках, позднее было показано, что экспрессия int-1 (Wntl) характерна для эмбриональных тканей, в частности, для формирующейся нервной системы [138, 204]. Свою естественную функцию белок int-1 выполняет в развивающихся тканях, а во взрослом организме только инсерционная мутация переводит int-1 из молчащего гена в состояние низкоэкспрессируемого [62]. С другой стороны, ген wg был открыт при нарушениях нормального развития крыльев у мух, вызванных рецессивной мутацией [163]. Исследования wg дали основания полагать, что действие белка Wingless обеспечивает взаимодействие клеток между собой, и показали, что он является внеклеточным фактором дифференциации, в частности, регулирующим полярность сегментов тела (т.е. относящимся к классу генов segment-polarity) [54, 131].

6. Выводы.

• Экспрессия лигаида ИАУпН 1 детектируется в 75% исследованных клеточных линий меланомы человека.

• Впервые показано, что в опухолевых клетках и нормальных тканях существует механизм альтернативного сплайсинга лиганда 1.

• Изоформа ЬУпЦ 1 зрЗ лиганда й^УпИ 1, в отличие от полноразмерного белка, не является секретируемым белком.

• Изоформа 1 ер 1 лиганда 1тУп1:11 сохраняет способность секретироваться, а также взаимодействовать с секретируемым ингибитором сигнального пути белком ХУД7.

• Обнаруженные изоформы лиганда ИУ/пЦ1 в отличие от полноразмерного белка теряют способность ингибировать активацию канонического сигнального пути.

5.

Заключение

.

Меланома принадлежит к числу быстро прогрессирующих и агрессивных опухолей. Клетки меланомы имеют общие свойства с предшественниками меланоцитов. Среди общих характерных черт — подвижность клеток и их пролиферативный потенциал. Установлено, что сигнальные пути Wnt принимают участие в контроле этих свойств, как в клетках меланомы так и в меланобластах. Активация канонического сигнального пути считается хорошим прогностическим признаком для пациентов с диагнозом меланома [41]. По мнению исследователей это может быть обусловлено существенной ролью канонического сигнального пути Wnt в процессе созревания меланоцитов. Активация неканонических сигнальных путей Vflt может влиять на перестройку цитоскелета и подвижность клеток. Это существенно как для процессов инвазии и метастазирования, так и для эмбрионального развития. Например, лиганд Vntl 1 участвует в регуляции миграции клеток нервного гребня, которые являются предшественниками нескольких типов клеток, включая нейроны и меланоциты [50, 120]. Лиганд Vntl 1 считается «неканоническим», потому что преобладают данные о том, что он активирует неканонический сигнальный путь планарной клеточной полярности.

Активация пути планарной клеточной полярности контролирует организацию цитоскелета, подвижность клеток, их взаимодействие между собой. Вероятно, что активация сигнального пути планарной клеточной полярности может способствовать приобретению клетками фенотипа, характерного для злокачественной опухоли. Негативный эффект от активации неканонических сигнальных путей \fnt усугубляется тем, что одним из следствий их активации является ингибирование канонического сигнального пути Несмотря на то, что УпП 1 считается классическим активатором пути планарной клеточной полярности, отсутствуют данные о его роли в регуляции инвазии и метастазировании меланомы. Детальное исследование особенностей экспрессии лиганда в клетках меланомы является первым шагом к пониманию его роли в формировании агрессивного фенотипа клеток.

В данной работе были исследованы особенности экспрессии лиганда ИМ^пШ в различных опухолевых и нормальных клетках. Для исследования экспрессии 1гУпШ в клетках меланомы были выбраны клеточные линии меланомы человека. Клеточные линии меланомы представляют собой отдельные популяции опухолевых клеток, каждая из которых является потомком конкретного клона меланомы, полученного из опухоли пациента. Поэтому они характеризуются различными генетическими и биохимическими особенностями, свойственными различным стадиям развития меланомы.

Исследование экспрессии ЬЛУпШ методом ОТ-ПЦР показало, что в 9 из 12 клеточных линий меланомы наблюдаются специфические ПЦР-продукты. Анализ экспрессии Ь? пЦ1 в клеточных линиях меланомы человека дает основания утверждать, что в 75% исследованных клеточных линий меланомы происходит экспрессия этого лиганда. Исследование экспрессии ЬУпИ1 с применением праймеров, фланкирующих более протяженную область последовательности кДНК (ВР+СЫ по сравнению с АБ+СЯ, см приложение, А панель А) выявило присутствие ампликонов различного размера. Соответствие нуклеотидной последовательности наблюдаемых ПЦР-фрагментов последовательности кДНК ИЛУпИ 1, подтверждено секвенированием.

В патогенезе колоректального рака также задействованы сигнальные пути Уп1-. Однако, их участие отличается от такового в клетках меланомы. Для колоректального рака активация канонического сигнального пути является не только плохим признаком, но в 90% случаев — причиной возникновения опухоли. Тогда как активация неканонических сигнальных путей, во всяком случае, активируемых лигандом Wnt5a, ассоциирована с хорошим прогнозом для пациентов. Исследование экспрессии лиганда 11Уп1−11 в клетках колоректального рака может прояснить роль данного лиганда в формировании злокачественного фенотипа клеток. Учитывая результаты ОТ-ПЦР анализа экспрессии 11УпИ 1 в клетках линий меланомы и роль неканонических сигнальных путей в прогрессии колоректального рака, исследование экспрессии «неканонического» лиганда 1гУпШ в клетках колоректального рака представляет особый интерес.

Результаты анализа экспрессии ЬХУпИ 1 в клеточных линиях колоректального рака человека методом ОТ-ПЦР позволяет заключить, что присутствие нескольких ампликонов разного размера, не является явлением специфичным только для клеток линий меланомы человека. Аналогичным образом, методом ОТ-ПЦР в клетках нормальных тканей человека с применением нескольких пар праймеров, установлено, что это явление не является опухоль-специфичным. Результат ОТ-ПЦР анализа экспрессии лиганда ИЛУпи 1 в клетках нормальных тканей также представляет собой набор ампликонов разного размера.

Обнаруженные ампликоны разных размеров были секвенированы, что подтвердило их соответствие нуклеотидной последовательности кДНК 11УпШ. В результате т &-Шсо анализа последовательностей, полученных в результате секвенирования, было установлено, что ампликоны, не соответствующие расчетной величине, свидетельствуют о присутствии в клетках нескольких изоформ мРНК 11УпИ 1.

В данной работе впервые экспериментально показано, что экспрессия лиганда 1зУпШ может сопровождаться альтернативным сплайсингом. Обнаруженные сплайс-варианты кодируют белки, отличающиеся от полноразмерного лиганда, что опровергает предсказанные в работе других авторов возможные результаты альтернативного сплайсинга [87]. Использованные в ОТ-ПЦР анализе праймеры, позволили детектировать четыре сплайс-варианта отличные от мРНК полноразмерного лиганда. Два сплайс-варианта имеют практически одинаковую кодирующую последовательность (ЪУп1−118р1 и Ь? пШ8р4). Формирование изоформы 11УпШ8р2 сопровождается сдвигом рамки считывания, аминокислотная последовательность этого сплайс-варианта еще не установлена. В качестве объектов исследования были выбраны изоформы Ь? пи 1эр1 и ИУп1:118рЗ.

Для исследования свойств изоформ лиганда ЬХУпО 1 получены антитела к лиганду, позволяющие детектировать рекомбинантный и эндогенный белки ЬУп1:11.

Изучение свойств белковых продуктов ИХУпШвр! и 11? п1:118рЗ дало следующие результаты. Оба сплайс-варианта сохраняют способность связываться с веществом внеклеточного матрикса гепарином, что является одним из характерных свойств секретируемых молекул, в том числе семейства У/гй. Изоформа 11УпШ8р1 является секретируемым белком. В результате трансляции сплайс-варианта ЬМ/пШврЗ образуется несекретируемая форма, тогда как полноразмерный лиганд ЬАУпШ относится к секретируемым белкам.

Изоформа ЬУпШ, кодируемая сплайс-вариантом ЬУп1−118р1, также как и полноразмерный лиганд способна взаимодействовать с секретируемым регуляторным белком «ШТ.

Для исследования функциональной активности изоформ в качестве критерия была выбрана способность ингибировать канонический сигнальный путь Уп1-. Это свойство лиганда 11¥-пШ было подтверждено исследованием эффектов, которые оказывает на активацию канонического сигнального пути подавление экспрессии эндогенного лиганда 11¥-пи 1 или экспрессия рекомбинатного ИХУпи 1.

В результате изучения функциональной активности обнаруженных изоформ ЬУпШ установлено, что ни 1гУп1−118р1 ни 11УпШ8рЗ не ингибируют активацию канонического сигнального пути Wnt. Таким образом, обе исследуемые новые изформы лишены функциональной активности, характерной для полноразмерного белка 11Уп1−11.

Различные свойства исследованных изоформ ЬЛУпШ дают основание предположить, что они выполняют разные функции. Тот факт, что 1гУпШ8р1 и И^УпШзрЗ лишены функциональной активности, характерной для полноразмерного белка ЬЛУпП1, не означает, что они лишены любой функциональной активности.

Результаты данной работы подчеркивают необходимость при исследовании сигнальных путей учитывать возможное существование сплайс-вариантов компонентов. Так как альтернативный сплайсинг может привести к образованию белков имеющих абсолютно другие функции, чем полноразмерная изоформа.