Упорядоченный дифференциальный дисплей кДНК

Методы, направленные на идентификацию транскриптов дифференциально экспрессирующихся генов (Т-ДЭГ, то есть мРНК, представленных в разной концентрации в сравниваемых образцах), представляют итерес для целого ряда областей биологии — эмбриологии, клеточной биологии, иммунологии и других. Кроме того, в настоящее время изучение ДЭГ становится одной из основных задач крупномасштабных геномных проектов.

Технические подходы, предназначенных для сравнения выделенных препаратов РНК in vitro с целью поиска Т-ДЭГ, несмотря на чрезвычайное разнообразие, имеют одну основу: метод дифференциальной гибридизации, или дифференциального скрининга (Rebagliati et al., 1985). Не вдаваясь в подробности, можно сказать, что он состоит в проверке уровня представленности случайно выбранных последовательностей (клонов) кДНК в сравниваемых образцах РНК с помощью гибридизации. Целью при этом является обнаружение последовательностей, присутствующих в одном из сравниваемых образцов РНК в гораздо большей концентрации, чем в другом. Самое очевидным неудобством этого метода была огромная трудоемкость: поскольку популяция Т-ДЭГ редко составляет более 1% от всей РНК, на каждый обнаруженный Т-ДЭГ могли приходиться сотни раундов гибридизации с общими последовательностями. Чтобы преодолеть это затруднение, был предложен прием вычтиающей гибридизации, целью которого является обогащение сравниваемых образцов Т-ДЭГ перед собственно дифференциальным скринингом. Было разработано (и успешно применено) множество вариантов техники вычитающей гибридизации.

В 1992 году был предложен альтернативный подход к дифференциальному скринингу (Liang and Pardee, 1992; Welsh et al., 1992), который теперь известен под общим названием «дифференциальный дисплей» (ДД). В общем, он состоит из следующих стадий: (а) из каждого из сравниваемых образцов РНК производятся упрощенные образцы фрагментов кДНК (т.е. включающие только небольшую часть из всех исходно имеющихся кДНК) таким образом, что их состав жестко определяется конкретными условиями их получениятакие образцы называются суб-популяциями- (б) аналогичные суб-популяции, полученные из сравниваемых образцов РНК, разделяются на соседних дорожках полиакриламидного геля (получаемые картинки из исторических соображений называются фингерпринтами) — (в) полосы фрагментов кДНК, видимые только в одном из сравниваемых образцов (или гораздо более выраженные в одном образце чем в другом) вырезаются из геля и изучаются (такие фрагменты и происходят из Т-ДЭГ) — (г) изменяя параметры получения суб-популяций, производятся суб-популяции другого состава и изучаются вышеописанным образом, чтобы сравнить уровень экспрессии для возможно большего числа генов. Преимущество такого подхода по сравнению с дифференциальным скринингом очевидно: вместо проведения отдельного раунда гибридизации для каждой из случайно выбранных последовательностей, сравнивается уровень представленности сразу нескольких десятков видов мРНК. Еще одним очень важным свойством ДД является возможность совместно анализировать более двух образцов РНК, что практически невыполнимо в случае дифференциального скрининга с использованием вычитающей гибридизации. В последующие годы ДД очень широко применялся для решения разнообразных задач, что привело к появлению нескольких сотен публикаций. Тем не менее выяснилось, что техника.

ДД скрывает гораздо больше подводных камней, чем можно было предположить исходя из первых описаний (Debouck, 1995). Для преодоления обнаружившихся затруднений был предложен целый ряд модификаций исходного метода ДД (см. последние обзорные статьи Liand and Pardee, 1995; McClelland etal, 1995; детали современного экспериментального протокола даны у McClelland et al., 1997). Помимо этого, было разработано несколько перспективных методов, также использующих дисплей фрагментов кДНК, но имеющих принципиальные отличия от исходной техники ДД.

Таким образом, перед исследователем, планирующим поиск Т-ДЭГ, открывается весьма широкий выбор методов. При этом ни один из них не может быть рекомендован как идеальный, во всех случаях превосходящий другие. Выбор оптимального методического подхода должен диктоваться свойствами изучаемой биологической системы, а также целями конкретного научного проекта. Нижеследующий литературный обзор посвящен рассмотрению методов, относящихся к группе дифференциального дисплея, с целью обозначить области наибольшей продуктивности каждого из них и тем самым облегчить исследователю выбор метода для решения конкретной задачи.

Целью данной работы являлось создание нового метода дифференциального дисплея, который был бы достаточно прост в исполнении и при этом лишен большинства недостатков, свойственных разработанным ранее аналогичным методам.

ВЫВОДЫ.

1. Разработан новый метод дифференциального дисплея кДНК, получивший название упорядоченного дифференциального дисплея (УДД), позволяющий осуществлять поиск дифференциально экспрессированных транскриптов систематически. В отличие от аналогичных разработок в этом направлении, УДД специально приспособлен для работы с микроколичествами исходного материала. При этом он сравнительно прост в исполнении и отличается высокой воспроизводимостью.

2. В эксперименте по поиску молекулярных региональных маркеров пресноводной планарии при помощи УДД был клонирован ряд транскриптов, специфически маркирующих определенные участки ее тела. Было установлено, что один из них кодирует полидоменный лектин С-типа, другой — металлокарбоксипептидазу и еще один — металлопротеазу астацинового типа. Для последнего транскрипта была клонирована полноразмерная кДНК и участок соответствующей промоторной области.

3. В эксперименте по сравнению профилей генной экспрессии в головах муравьев разных поведенческих групп было констатировано отсутствие различий, превышающих уровень вариабельности внутри каждой из анализировавшихся групп. Было также установлено, что при помощи УДД возможно сравнивать образцы РНК очень высокой сложности.

4. В модельном эксперименте было продемонстрировано, что присутствие в образце сверх-представленных транскриптов сказывается на эффективности УДД весьма незначительно. Для тех редких случаев, когда влияние все же заметно, был разработан прием «виртуальной нормализации», позволяющий полностью исключить нежелательные эффекты.