Влияние вакционного и «дикого» штаммов вируса кори на репаративную активность клеток человека

Актуальность проблемы. Значительные успехи, достигнутые за последнее десятилетие в области молекулярной биологии и генетики, открытие рапаративных процессов в клетках человека, представили возможность осуществить новый подход в изучении механизмов гомеостаза организма и, в частности, позволили определить роль клеточных систем репарации ДНК в устойчивости клетки к химическим, физическим и биологическим мутагенам. Установлено, что снижение эффективности и точности работы репаративных систем приводит к возрастанию частоты мутационных изменений и повышенной гибели клетки.

В настоящее время обнаружено, что вирусы, в зависимости от их видовой принадлежности и типа течения вызываемого инфекционного процесса, могут ингибировать, стимулировать или не оказывать влияния на репаративную активность клеток (О.Г.Анджапаридзе и др., 1972,1976,1977; Г. Д. Засухина, 1979; Г. Д. Засухина и др., 1978,1979,1981,1983; KLshiyama Т., Варр F., 1981; Altmann Н. et al., 1982).

Анализ данных литературы показал, что сведения об особенностях репарации индуцированных повреждений ДНК в клетках человека, инфицированных вирусами, немногочисленны и посвящены, как правило, изучени отдельных этапов репарационного процесса. Исследование всех этапов эксцизионной репарации в одной системе вирус-клетка не проводилось. В то же время представляется возможным, что вирусы могут неодинаково влиять на те или иные этапы процесса репарации, обеспечиваемые активностью различных ферментов.

В литературе также полностью отсутствуют сведения об особенностях влияния различных штаммов одного и того же вируса, обладающих неодинаковыми генетическими свойствами, на репаратив-ную активность клетки. Вместе с тем известно, что именно генетические свойства вируса могут определять степень его вирулентности, характер влияния на основные функции клетки.

Роль вакцинных штаммов вирусов в устойчивости клетки, обеспечиваемой согласованной и безошибочной работой репаративных систем, к мутагенам и канцерогенам, в том числе и естественным факторам окружающей среды, каким является УФ-облучение, до настоящего времени не была исследована.

В то же время детальная биологическая характеристика атте-нуированных вирусов, применяющихся для вакцинации людей, является необходимым этапом в проблеме общей оценки безопасности вакцинных препаратов. Новым критерием определения степени безвредности вакцин могут служить результаты исследования влияния аттенуированных вирусов на репаративные процессы в клетке.

Влияние коревой инфекции на эксцизионную систему репарации в клетках человека до сих пор не изучалось. В связи с тем, что в настоящее время проводится массовая иммунопрофилактика кори с использованием живой вирусной вакцины, а также с тем, что корь остается довольно распространенным и тяжелым заболеванием у детей раннего возраста, сведения о влиянии вакцинного и «дикого» штаммов вируса кори на одну из основных функций клеткиспособность восстанавливать повреждения ДНК, могут иметь не только теоретический, но и практический интерес. В частности, они могут способствовать познанию механизмов влияния РНК-содер-жащих инфекционных вирусов на репаративную активность клеток человека и дать представление о том, как вакцинация детей отражается на репаративной функции клетки, участвующей в поддержании стабильности генетического материала.

Цель и задачи исследования

Цель исследования — дать сравнительную оценку аттенуированного и «дикого» штаммов вируса кори по новому параметру — способности влиять на процесс восстановления клеточной ДНК, поврежденной УФ-лучами.

Основные задачи исследования:

I. Изучить влияние аттенуированного и «дикого» штаммов вируса кори на основные этапы эксцизионной репарации ДНК клетки, поврежденной УФ-лучами: а) вырезание повреждений, индуцированных УФ-облучениемб) репаративный синтез ДНКв) ресинтез разрывов ДНК.

Z, Исследовать ряд характеристик аттенуированного и «дикого» штаммов вируса кори: цитопатическуго активность, способность влиять на митотическую активность клеток, на продолжительность клеточного цикла и отдельных его фаз.

Научная новизна. Впервые исследовано влияние вируса кори на репаративную активность клеток человека. На одной модельной системе — вирус кори-клетки человека впервые проведено комплексное исследование основных этапов эксцизионной репарации ДНК клеток, поврежденной УФ-лучами.

Впервые показана роль индивидуальных различий аттенуированного (Ленинград-16) и «дикого» (Эдмонстон) штммов вируса кори, связанных со степенью их аттенуации, в характере оказываемых эффектов на способность клеток человека восстанавливать индуцированные повреждения ДНК.

Полученные данные дают представление об особенностях протекания процесса эксцизионной репарации УФ-индуцированных повреждений ДНК в клетках человека, инфицированных различными штаммами вируса кори, и вносят определенный вклад в познание механизмов влияния вирусов на способность клеток восстанавливать повреждения собственной ДНК.

Результаты исследований, свидетельствующие о сниженной способности клеток, инфицированных «диким» вирусом кори, восстанавливать индуцированные повреждения ДНК, дают дополнительную информацию для понимания механизмов мутагенного действия вируса.

Научно-практическая значимость работы. На основе проведенных исследований предложен новый критерий для оценки безвредности применения как традиционно используемых, так и вновь конструируемых вакцинных препаратов: влияние на системы репарации, восстанавливающие повреждения клеточной ДНК.

Установленные различия в эффектах, оказываемых вакцинным и «диким» штаммами вируса кори на репаративный синтез ДНК, индуцированный УФ-облучением, в силу доступности метода, используемого для его оценки, могут служить одним из критериев степени аттенуации вируса кори при создании вакцинных препаратов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА I.

ОСНОВНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РЕПАРАЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА И МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

I.I. Значение репарации ДНК в нормальной жизнедеятельности клеток человека.

Способность клетки к репарации повреждений ДНК, вызванных мутагенами различной природы, является эволюционно сложившимся механизмом, определяющим естественный уровень резистентности клетки к ряду экзогенных воздействий и уровень мутационного процесса. Универсальность и широкая распространенность восстановительных процессов у клеток различного происхождения, поврежденных УФ-светом и ионизирующей радиацией, была отмечена уже в 50-е годы. В дальнейшем было обнаружено, что механизмы репарации ДНК, открытые при исследовании обратимости повреждений, вызываемых излучениями (Setlow Е.В., Carrier W.L., 1964; Вйусе Е. Р., Howard-Flanders р., 1964), направлены не только на удаление индуцированных повреждений, но и на репарацию «спонтанно» возникающих дефектов. В интактной клетке в условиях нормальной жизнедеятельности образуются однонитевые разрывы ДНК, апуриновые и апи-римидиновые участки, неспариваемые и ошибочно спариваемые основания. Их накопление, если бы не было соответствующих ферментных систем репарации, привело бы к фатальным нарушениям генома (Н.А.Федоров, 1983; Lindahl Т., 1972,1982; Kornberg А., 1974).

В настоящее время установлено, что репарация ДНК тесно связана с основными матричными процессами — репликацией и рекомбинацией: все эти процессы частично обеспечиваются одними и теми же ферментами и генными структурами (С.Е.Бреслер, 1976; В. А. Ланцов, 1977; В. Д. Жестяников, 1979). Особенно важной представляется связь репарации и репликации. Авторепродукция ДНК с ее развитым ферментативным аппаратом, как и репарация ДНК, является механизмом генетической стабильности. По мнению В. Д. Жестяникова (1979), репарация и репликация, возможно, представляют собой две стороны одного и того же процесса с преимущественным проявлением одной из них при тех или иных повреждениях.

С нарушениями репарации ДНК связано возникновение редких наследственных заболеваний — пигментной ксеродермы, анемии Фан-кони, атаксии-телеангиэктазии и некоторых других.

Характерной особенностью этих заболеваний является хромосомная нестабильность, проявляющаяся в повышенном уровне спонтанных и индуцированных хромосомных аберраций. Кроме того, этот феномен чаще всего коррелирует и с увеличением числа спонтанных и индуцированных сестринских хроматидных обменов. Типичным для этих заболеваний является большая вероятность развития злокачественных новообразований и лейкозов.

Многочисленные исследования клеток, полученных от больных пигментной ксеродермой, показали, что активность репаративных процессов в них значительно снижена или отсутствует, что коррелирует с чувствительностью этих клеток к действию ДНК-поврежда-ющих агентов (В.Д.Жестяников, 1979,1982; В. М. Михельеон, Н.В.То-милин, 1979; Cleaver J.E., 1973,1977; stich H.F., 1975; Set-low R.B., 1983; Francis A., Regan J., 1983; Laskowski w. I983). Различные комплементационные группы клеток при этой патологии характеризуются низким уровнем эксцизионной или пострепликатив-ной репарации после УФ-, гамма-облучения или воздействия химических мутагенов, что связано, вероятно, с утратой ими гена репарации или обусловлено низкой эффективностью ряда ферментов репарации (специфических эндонуклеаз, ДНК-полимеразы или ДНК-лигазы), связанной с дефектом регуляторного гена (weerd-Kaste-lein Е., 1973,1976; Giannelli F., Pawsey S.A., 1974; Paterson M. et al., 1974; Imray p. et al., 1983; Laskowski W., 1983).

Клетки больных анемией Фанкони обладают повышенной чувствительностью к агентам, вызывающим поперечные сшивки ДНК-ДНК: митомицин С, азотистый иприт и др. Предполагается, что в этих клетках генетический дефект связан с нарушением экзонуклеазного этапа эксцизионной репарации (В.М.Михельсон, Н. А. Томилин, 1979; Poon P. et al., 1974; Fujiwara Y. et al., 1977; Setlow R.B., 1982) .

Клетки больных атаксией-телеангиэктазией характеризуются повышенной радиочувствительностью, обусловленной, по мнению ряда авторов (bavin m.f. et al., 1983), дефектами в системах репарации ДНК и репликации. Предполагается, что в этих клетках нарушена активность эндонуклеазы или ДНК-гликозилазы, необходимых для инициации эксцизии гамма-измененных азотистых оснований ДНК (Lebmann A.R., 1977; Vincent R. et al., 1980) .

Повышенная чувствительность к гамма-облучению и 4-нитрохи-нолин-I-оксиду описана также при ряде других наследственных заболеваний: болезнь Марфана, гистидинемия, несовершенный остео-генез, синдром Сильвер-Рассела, Лоуренса, Франческетти, Леш-Ни-хана (Г.Д.Засухина и др., 1982аГ.д.3асухина, 1983). При этом было показано, что увеличение чувствительности к использованным видам воздействия коррелирует с понижением репаративной активности в клетках, определявшейся по критерию выживаемости вируса осповакцины и восстановлению индуцированных однонитевых разрывов ДНК. В ряде случаев отмечался повышенный спонтанный уровень сестринских хроматидных обменов.

Гиперчувствительность к радиации отмечалась также при синдромах Дауна, Кокаина, системной красной волчанке, ревматоидном артрите и др. (В.М.Михельсон, Н. В. Томилин, 1979; Horkay j. et ai., 1975; Lambert В. et al., 1977; Paterson M.C., 1978; Cherry Ъ. et ai., 1984), и свидетельствует о том, что, вероятно, имеется обширный круг заболеваний, для которых первичными или вторичными механизмами являются нарушения в регуляции или работе структурных генов или в координации активности ферментов, обеспечивающих функционирование отдельных этапов процесса репарации.

Таким образом, наследственные болезни с нарушениями репара-тивной способности клеток являются убедительным доказательством исключительной роли механизмов репарации ДНК в поддержании генетической стабильности клетки в процессе ее нормальной жизнедеятельности.

1.2. Основные виды репаративных систем в клетках человека и млекопитающих.

Различные ДНК-тропные агенты — УФ-облучение, ионизирующая радиация, химические мутагены и др. вызывают в ДНК разноообраз-ные повреждения — разрывы сахарофосфатных цепей, образование пи-римидиновых димеров, образование апуриновых и апиримидиновых участков, сшивки ДНК-ДНК или ДНК-белок, эстерификадиго фосфата и др. (Й.А.Ходосова, 1976; В. Д. Жестяников, 1979; Н. А. Федоров, 1983; Cerutti Р., 1975; Hariharan P. et al., 1975).

Многочисленные исследования молекулярной природы репарации ДНК показали, что в клетках функционируют дорепликативные, реп-ликативные и пострепликативные механизмы элиминации или обхода повреждений, осуществляемые разветвленными конститутивными и отчасти индуцибельными ферментативными системами, различающимися как по специфике включаемых ферментов, так и по интенсивности и скорости протекания процессов.

Эти механизмы первоначально были открыты и наиболее полно изучены у бактерий (Setlow R.B. .Carrier W., 1964; Boyce R., Howard-Flanders p., 1964; Cleaver J., 1974a, 1978 и др.). Впоследствии аналогичные репаративные системы были обнаружены в клетках эукариот (Setlow R., Setlow J., 1972; Cleaver J., 19 746- Lohman P., Bootsma D., 1974; Hanawalt P.O., 1975).

О работе репаративных систем клетки в последние годы опубликован ряд монографий, обзоров (В.Д.Жестяников, 1977,1979,1982; Г. Д. Засухина, 1979,1983; С. Е. Бреслер, 1980; Н. А. Федоров, 1983; Cerutti Р., 1975; Setlow R., 1983; Ganesan A. et al., I982- Waters R. et al., 1982 и Др.).

Из известных в настоящее время механизмов ферментативной репарации нуклеиновых кислот наиболее изучены фотореактивация, эксцизионная репарация и поетрепликативная репарация.

Ниже мы представляем краткую характеристику основных путей репарации повреждений ДНК в клетках человека и млекопитающих, уделив основное внимание процессу эксцизионной репарации.

Фото реактивация — ферментативный процесс, происходящий только при действии видимого света и заключающийся в расщеплении циклобутановых димеров пиримидиновых оснований фотореактивирую-щим ферментом (фотолиазой). Фермент фотореактивации обнаружен в клетках организмов разных уровней организации: от бактерий до плацентарных млекопитающих (Rupert е., 1975; Cochin т.Р., 1982).

Фотореактивация в клетках млекопитающих, впервые обнаруженная в 1974 г. Сазерленд (Sutherland в., 1974), во многом сходна с фотореактивацией у бактерий, но отличается более широким спектром и распространенностью в область видимого света. В настоящее время получены свидетельства прямой связи между удалением пиримидиновых димеров фотолиазой, выживаемостью и мутированием в клетках ряда млекопитающих (Wade м.н. et al., 1982; сое-МП т. p., 1982; Wilkins K.J., 1983).

При исследовании процесса фотореактивации в нормальных клетках человека Sutherland в. et al. (1976) показали, что фотолиаза способна восстанавливать подавленный УФ-лучами синтез ДНК. В клетках больных пигментной ксеродермой был обнаружен дефект фотореактивации. Однако cleaver j. et al. (1976) не выявили фото-реактивирующей активности и в нормальных клетках человека.

Исследования, проведенные в последние годы, показали, что в линиях нормальных клеток человека фотореактивирующий фермент обнаруживается в больших количествах, чем в клетках больных пигментной ксеродермой. Однако, фотореактивация более выражена в дефектных клетках по сравнению с клетками с нормальной репара-тивной способностью, что может быть следствием того, что в нормальных клетках фотореактивация либо репрессирована, либо маскируется эффективной эксцизионной репарацией (Sutherland Б" 1983). Таким образом, физиологическая роль этого типа репарации у человека до сих пор недостаточно ясна.

Пострепликативная репарация имеет место в том случае, если то или иное повреждение ДНК остается неисправленным до начала репликативного синтеза. По словам Lehmann а. (1972) «Пострепликативная репарация может быть определена в ее широком смысле как способ, при помощи которого механизм репликации ДНК борется с повреждениями в тяжах родительской ДНК» .

Пострепликативная репарация после действия УФ-облучения, ионизирующей радиации и обработки химическими агентами обнаружена во всех клетках млекопитающих за исключением клеток вариантной формы пигментной ксеродермы (В.Д.Жестяников, 1979,1982; Lehmann A.R., 1977; Fornace a.J., 1983).

В настоящее время предполагается несколько способов репарации и обхода повреждений с помощью механизма пострепликативной репарации (В.Д.Жестяников, 1979,1982; Lehmann A.R., 1972; Park S., Cleaver J., 1979; Kimball R., 1980; Van Zeeland A.A., Filon a., 1982; Fornace a.j., 1983):

1) репарация пострепликативных пробелов конститутивной рекомбинацией между сестринскими дуплексами;

2) конститутивный синтез de novo (основной путь пострепликативной репарации в клетках млекопитающих);

3) индуцибельный синтез de novo или sosрепарация;

4) конститутивный пострепликативный обход повреждений, или непрерывный синтез дочерней ДНК на матрице с неудаленными повреждениями (в клетках млекопитающих).

Схематически механизмы пострепликативной репарации ДНК представлены на рис. I.I.

В настоящее время предполагается, что пострепликативная репарация в клетках млекопитающих протекает без ошибок, поскольку существование индуцибельной пострепликативной системы, работа которой осуществляется с ошибками, в клетках млекопитающих не доказано (Cochin т. р., 1982) .

Механизм эксцизионной репарации является наиболее универсальным для устранения разнообразных повреждений структуры ДНК в клетках человека и млекопитающих. С помощью этого механизма осуществляется репарация нуклеотидов после воздействия УФ-облучением или химическими канцерогенами, эксцизия оснований при повреждении ДНК алкилирующими соединениями, репарация сшивок.

УФ.

J™.

— M^/J-J.

15. r i ггА.

I I 1 Г i i j 1jl i—i—l 1 I I 1 TT I Г.

U1 a гт-г-гА.

I 1 II.

It’ll ill гтЛ i I i II 'i i i i i i i i i i i i i i ¦ i i i i i i.

I I i i i m i i I i I—Y-lj i i rVi.

I I I I I I I I I I 1.

I I I [ I I irAlTT.

I I L.J.J.J I I I I.

ГТ-Л IIMII I I M 1. L^l I I.

ГГГТ ii м itt m iU 1 a.

5'.

PH гт.

BCH т т т т.

PC, dn.

Рис. I.I. Схема механизмов пострепликативной репарации ДНК после УФ-облучения и образования вторичных пробелов во вновь синтезированных нитях (ВСН) напртив димеров и родительских нитях (РН) ДНК (1,П) и синтез дочерней ДНК без пробелов (Ш). I-рекомбинационная репарация пострепликативных пробелова-оба пробела заполняются участками из РНа-обмен одного участка РН с димером на неповрежденный гомологичный участок ВСНб, б-р епаративный синтез (PC). Препарация пострепликативных пробелов путем синтеза &-е novo (dn.

ДНК-ДНК, репарация брешей в одной из нитей ДНК, возникающих при Облучении клеток Гамма-лучами (Cerutti Р.А., 1974; Bartram w., 1980; Friedberg Е.С., 1981; Radman О., 1983).

В связи с тем, что в нашей работе изучались процессы восстановления повреждений ДНК, индуцированных УФ-облучением, более подробно будут рассмотрены механизмы репарации пиримидиновых димеров (ПД), являющихся основным фотопродуктом при УФ-облучении клеток, с которыми связывают биологические эффекты, выражающиеся в мутационных преобразованиях и гибели клеток. Количество и вид димеров, образующихся в ДНК, зависит от длины волны, содержания пиримидиновых оснований и общей дозы УФ-облунения. В клетках человека, облученных УФ-лучами с длиной волны 254 нм в малых дозах, по данным carrier w., Regan j. (1983), возникают ди-меры цитозин-цитозин, цитозин-тимин, тимин-тимин в соотношении 16:24:60.

Обычно различают 4 стадии эксцизионной репарации ПД. Первой стадией является надрезание (инцизия) — ферментативный акт, состоящий в разрыве димер-распознающим ферментом (УФ-эндонукле-азой) цепи ДНК рядом с поврежденным основанием. На 5-конце образовавшегося разрыва фосфоэфирной связи остается поврежденное основание, а на 3-конце — фосфат. Возможно также, что надрезание нити ДНК, содержащей ПД, в ходе ее репарации осуществляется в два этапа: I этап — расщепление м-гликозильной связи между 5-концом ПД и дезоксирибозой. Эта реакция осуществляется ДНК-гли-козилазой ПД и приводит к образованию апуриновых участков (АП) и тимин-тимидилатных димеров. На П-м этапе, осуществляемом АП-эндонуклеазой, происходит гидролиз фосфоэфирной связи с 3-конца в сторону АП-участка. В результате образуется надрезанная ДНК с АП-сайтом на 3-конце и смешанным димером на 5-конце Grafstrom r. et al., 198I).

Эндонуклеазная активность, специфичная к пиримидиновым ди-мерам, обнаружена в растущих в культуре лимфоцитах человека, клетках Hela, диплоидных фибробластах человека wi -38, фибро-бластах из амниона человека А-148 (Duncan I. et al., 1975; Falaschi A., Pedrini A., 1977).

Инцизионная стадия репаративного процесса, по мнению ряда исследователей (Grossman ъ., 1974; Setlow r.в., 1983), вероятно, является лимитирующей и контролирует удаление продуктов повреждения ДНК и восстановление ее исходной структуры.

Вторая стадия — эксцизионная. При этом пиримидиновые диме-ры вырезаются в составе олигонуклеотидного фрагмента после второго разрыва — со стороны З-конца от димера, осуществляемого экзонуклеазами.

Экзонуклеазные активности, действующие на УФ-облученную ДНК после нанесения инцизионных разрывов, обнаружены в лимфоцитах (Duncan I. et al., 1975) и клетках плаценты человека (Doni-ger i., Grossman l., 1976). Последняя действует на однои дву-нитевую ДНК с липкими концами, гидролизует ДНК в направлениях 3'- 5'и 5−3', высвобождая олигонуклеотиды с димерами, и не действуя на нативную ДНК. Экзонуклеазная активность обнаружена также в клетках Hela, диплоидных фибробластах человека, фибробластах из амниона человека и в культуре лимфоцитов (Duncan i. et al., 1975).

Два фермента, обладающих экзонуклеазной активностью (ДНК-азы Ш и 1У), были очищены из клеток костного мозга и легкого кролика (bindahl T. et al., 1969; Lindahl Т., 1972,1982). ДНК-аза Ш проявляет специфичность к однои двунитевой ДНК, производя разрушения с З-конца, в то время как ДНК-аза 1У, обнаруживая высокую специфичность к однонитевых участкам ДНК, удаляет соответствующие участки с 5-конца. Имеется указание на то, что ДНК-аза 1У высвобождает пиримидиновые димеры, входящие в состав олигонуклеотидов, гораздо быстрее, чем ДНК-аза Ш (bindatii т. et ai., 1969). Это положение соответствует данным, демонстрирующим наличие двух форм эксцизионной репарации: быстрой и медленной (Eikind щ., катрег о., 1970). Повреждения ДНК, вызванные УФ-лучами или канцерогенами, митомицином С и некоторыми другими химическими агентами, удаляются преимущественно посредством механизма медленной репарации, в то время как разрывы ДНК, вызванные ионизирующей радиацией, восстанавливаются, как правило, с помощью быстрой формы репаративного процесса.

Удаление участка ДНК с поврежденным основанием сопровождается деградацией ДНК, осуществляемой экзонуклеазой. Величина деградации ограничена и за вырезанием одного димера в клетках человека следует удаление от 30−40 до 100 нуклеотидов (Regan j., Setlow е., 1974; Francis a. a. et al., 1981).

Ключевым этапом эксцизионной репарации является репаратив-ный синтез, в течение которого происходит застройка образовавшейся бреши на комплементарной матрице ДНК с помощью ДНК-полимеразы.

В клетках человека и млекопитающих обнаружены четыре фермента, обладающих ДНК-полимеразной активностью (я и ?) и различающихся как по своим физико-химическим параметрам, так и по функциональным свойствам (Л.С.Баренфельд, 1983; кгокап н., 1981).

Несмотря на интенсивное исследование энзиматических свойств ДНК-полимераз млекопитающих, их функциональная роль до сих пор четко не определена. В репаративном синтезе (включая рекомбинацию) участвуют, по-видимому, -полимераза и частичноot-по-лимераза. Доказательства участия /-ДНК-полимеразы в репарации получены в работе Bertazzoni и. et al. (1977). Показано, что в лимфоцитах, стимулированных фитогемагглютинином, наибольшее увеличение активности ДНК-полимеразы f> связано с пиком репарации ДНК при минимальной репликации ДНК. Этот фермент репариру-ет УФ-облученную ДНК в ядрах нейронов крыс (Hubsciier и. et al., 1979), а также УФ-облученную и алкилированную ДНК клеток культур млекопитающих при ингибировании репликации афидиколином in vitro И in vivo.

Основная роль ДНК-полимеразы d заключается в полуконсервативном синтезе ДНК. Вместе с тем было показано, что in vitro ДНК-полимераза cL способна заполнять небольшие пробелы в ДНК (Bose к. et al., 1979). В настоящее время предполагается, что для различных типов повреждений могут требоваться разные формы ДНК-полимеразне исключено, что они могут заменять друг друга в зависимости от их количественного соотношения (Krokan н., 1981).

Заключительным этапом эксцизионной репарации является зашивание цепи ДНК с помощью ДНК-лигаз (А.И.Газиев, 1975; cleaver J., 1978; Arlett е., Lehmann А., 1978), которые осуществляют воссоединение сахарофосфатного скелета ДНК после репаратив-ного синтеза. ДНК-лигазы на 60% локализованы в ядерной фракции. Частично они присутствуют в хроматине в виде активированного аденилатного комплекса (А.И.Газиев, 1974). Клетки млекопитающих содержат две. лигазы (ДНК-лигаза I и ДНК-лигаза П), отличающиеся по хроматографическим свойствам, молекулярному весу, эн-зиматической активности от рН и устойчивости к нагреву. Оба энзима требуют в качестве кофактора АТФ и ни один из них не угнетается in vitro оксимочевиной или кофеином (Soderbaii s., 1976). Каково биологическое значение существования двух ДНК-ли-газ, неясно, однако показано, что в пролиферирующих клетках ДНК-лигазы I содержится в 20 раз больше, чем ДНК-лигазы П (So-derhall S. fbLndahl Т., 1975; Saucier J.M., Laval F., 1983) .

По описанному механизму репарируются также повреждения, вызванные различными химическими канцерогенами, действующими по УФ-типу (Altmann Н., Wottawa А., 1980).

В отличие от репарации пиримидиновых димеров, восстановление повреждений, вызванных алкилирующими соединениями, может осуществляться с помощью двухэтапного процесса (idndahi т., 1974,1976). На первом этапе происходит удаление измененного или некорректного основания из ДНК ДНК-гликозилазами. Эти ферменты расщепляют в ДНК связь между сахаром и основанием, в результате чего образуются апуриновые и апиримидиновые участки, в которые встраивается свободное неповрежденное основание. Этот второй этап двухэтапной эксцизионной репарации осуществляется специальным ферментом инсертазой, обнаруженным в фибробластах человека (Deutsch. w., Linn S., 1979; Linn S., 1982). При этом фос-фоэфирные связи ДНК остаются неразрушенными.

Апуриновые и апиримидиновые участки, образовавшиеся в ДНК после действия ДНК-гликозилаз, могут репарироваться и другим способом: специальные ферменты — АП-эндонуклеазы — разрывают фосфоэфирную связь рядом с этими участками, затем происходит обычная эксцизионная репарация с участием экзонуклеаз, ДНК-по-лимераз и ДНК-лигаз (Roberts j.j., 1980).С помощью такого механизма может осуществляться репарация сшивок ДНК-ДНК (Fujiwara Y. et al., 1977; Cleaver J.E., 1978). АП-эндонуклеазы, участвующие в этом процессе, обнаружены практически во всех группах живых организмов, в том числе и в клетках млекопитающих (Verly w., 1980), и обладают большой специфичностью к характеру повреждения ДНК (Kuhnlein U. et al., 1976,1978).

Однонитевые разрывы ДНК с сопоставленными З’ОН-и 5'РО^-концевыми группами могут репарироваться одноэтапно, с помощью ДНК-лигаз (А.И.Газиев, 1975; Campagnari f. et ai., 1977). Однако большая часть лучевых разрывов ДНК требует экзонуклеазной расчистки, репаративного синтеза, осуществляемого ДНК-полимераза-ми, и восстановления целостности структуры ДНК-лигазами, т. е. репарация протекает по обычному эксцизионному механизму за тем исключением, что первый этап — инцизия — осуществляется неэнзи-матически (В.Д.Жестяников, 1979; inoue a?., Kada т., 1980).

Механизмы репарации двунитевых разрывов ДНК в клетках млекопитающих пока точно не установлены. Предполагается существование двух моделей (В.Д.Жестяников, 1979). Согласно первой, в двунитевой ДНК образуется прямой двунитевой разрыв, расширяемый при экзонуклеотической деградации. Структура с неповрежденной молекулой образует гетеродуплекс вследствие того, что одно-нитевая область индуцирует событие рекомбинации с гомологичной хромосомой. Структура гетеродуплекса такова, что по неповрежденным матрицам идет репаративный синтез и при активном участии ДНК-полимеразы I и ДНК-лигазы процесс завершается восстановлением структуры ДНК. Следовательно, репарация происходит при участии обычных конститутивных ферментов. Согласно второй модели, предполагается образование гетеродуплекса с участием двух разорванных молекул ДНК. Реципрокно-рекомбинантная молекула образуется в результате разрыва, индуцируемого эндонуклеазами. В настоящее время возможность репарации двунитевых разрывов ДНК показана как для прокариотов, так и для клеток высших организмов (Р.И.Пинто И др., 1974; Lehmann A., Ormerod М., 1970;и др.).

Из рассмотренных выше механизмов эксцизионной репарации нуклеотидная репарация пиримидиновых димеров, эксцизия оснований и репарация однонитевых брешей обеспечивает безошибочное восстановление ДНК в клетках, так как в этих случаях в качестве матрицы используется неповрежденная нить ДНК (witkin е., 1969; Radman М., I983-Maher V., Мс Cormick J., 1983). При репарации двунитевых разрывов ДНК, индуцированных ионизирующей радиацией, или образовавшихся в результате репарации сшивок ДНК-ДНК между противоположными последовательностями оснований, восстановление макромолекулы может происходить с ошибками.

Исследования последних лет показали, что нуклеосомная организация ДНК в хроматине клеток млекопитающих и организации хроматина более высокого порядка могут влиять на восстановление повреждений генома (Ф.Л.Виханская, 1983). Рядом исследователей установлено, что эксцизионная репарация в клетках человека после УФ-облучения и обработки некоторыми канцерогенами с неодинаковой эффективностью протекает в коре и линкере хроматина. В первые часы после повреждающего воздействия удаление поврежденных структур и репаративный синтез значительно эффективнее происходит в линкерных участках, чем в коровых, где процессы репарации наиболее активны в более поздние сроки (Cleaver j.e., 1977; Smerdon М. J. .Lieberman M., 1978,1979; Dolejs J., Alt-mann н., 1980). Поскольку при действии излучений и химических агентов ДНК повреждается относительно равномерно по длине (Oleson F.B.et al., 1979; Williams J.L. .Friedberg E.G., 1979), наблюдаемая неравномерность репарации ДНК в хроматине объясняется тем, что в ходе эксцизионной репарации происходит перестройка нуклеосомных структур (Oleson F. et al., 1979; Smerdon.

M. J. et al., 1979; Dolejs J., Altmann H., 1980; Lieberman M., 1981).

Согласно гипотезе Lieberman м. et al. (1979) чувствительность к стафилококковой нуклеазе ДНК хроматина не обязательно связана с линкерными участками, а может быть следствием репара-тивного процесса. Дальнейшая перестройка нуклеосом (перемещение меченых нуклеотидов в область, резистентную к перевариванию) означает восстановление изначальной структуры хроматина.

Данные о зависимости эксцизионной репарации от организации хроматина были получены при изучении роли в репарации поли (АДФ-рибозы). Поли (АДФ-рибоза) in vitro вызывает конденсацию полинуклеосом, причем, процесс находится в зависимости от концентрации никотинамиддинуклеотида. Нуклеосомная агрегация происходит путем связывания остатков поли (АДФ-рибозы) с гисто-НЭМИ HI (Hayaishi О., Ueda К., 1977) .

В настоящее время предлагается следующая схема, описывающая участие поли (АДФ-рибозы) в репарации ДНК. УФ-облучение индуцирует повреждения в ДНК, которые узнаются эндонуклеазой. Эндонуклеааа надрезает фосфодиэфирные связи в ДНК около повреждения. Образовавшийся инцизионный разрыв стимулирует активность полимеразы поли (АДФ-рибозы). Быстро синтезирующая поли (АДФ-ри-боза), в свою очередь, полимеризует гистоны HI, компактизируя структуру хроматина. Далее происходит эксцизия повреждений, репа ративный синтез и лигазное зашивание разрывов. После того, как разрывы нивелируются, прекращается повышенный синтез поли-(АДФ-рибозы). Далее вступает в работу другой фермент — глико-гидролаза поли (АДФ-рибозы), активность которого подавляется од-ноцепочечной ДНК. После зашивания разрывов в ДНК гликогидрола-за поли (АДФ-рибозы) начинает активно разрушать поли (АДФ-рибозу) и хроматин возвращается в свое первоначальное состояние (Ait-mairn н. et al., 1979; Berger n.A., Sikorski g., 1981). Приведенные данные свидетельствуют о том, что для успешного завершения репарационных процессов необходимы сложные перестройки хроматина.

Таким образом, на основании имеющихся в литературе данных можно сделать заключение, что эффективность и точность работы клеточных систем репарации обусловливает нормальную жизнедеятельность клеток и организмов, а также способность обеспечивать резистентность живых объектов к различным экзогенным факторам, повреждающим ДНК клеток. Снижение эффективности эксцизионной репарации приводит к вовлечению большого числа неисправленных повреждений ДНК в процесс репликации и возрастанию, таким образом, частоты мутационных изменений клеточного генетического материала и, возможно, гибели клеток.

В последние годы достигнуты значительные успехи в понимании механизмов репарации повреждений ДНК в клетке и их роль в осуществлении защиты клетки от химических и физических мутагенов.

Вместе с тем известно, что вирусы, подобно радиации и химическим мутагенам, также способны индуцировать генные и хромосомные мутации (Т.И.Бужиевская, 1984). Данные об участии процесса репарации в формировании вирусиндуцированных хромосомных аберраций были получены в клетках почек сирийского хомяка (первичные и перевиваемые культуры), контрастирующих по эксцизии тиминовых димеров (Н.П.Дубинин и др., 1973а). Оказалось, что од-ноцикловая инфекция этих клеток, вызванная введением РНК вируса полиомиелита, индуцировала аберрации хромосом, число которых к концу клеточного цикла снижалось в клетках с активной системой репарации и оставалось на одном уровне в клетках, дефектных по репаративной системе (Н.П.Дубинин и др., 19 736). Подобная закономерность отмечалась в этой системе и при УФ-облуче-нии. Аналогичные данные были получены в клетках ксеродермы, инфицированных УФ-облученным аденовирусом (stich. H. et ai., 1974). В клетках ксеродермы этот вирус реактивировался медленнее, чем в нормальных клетках, что сопровождалось ростом вирусиндуциро-ванных аберраций хромосом в клеточной популяции. В клетках здоровых людей, наоборот, число хромосомных аберраций вначале было высоким за счет быстрой реактивации вируса и индукции мутаций хромосом, а затем снижалось, что связано с репарируемос-тью вирусиндуцированных хромосомных аберраций. В последние годы получены данные о способности вируса герпеса типа 2 вызывать, подобно физическим или химическим агентам, повреждения ДНК клеток, сопровождающиеся индукцией репаративных процессов В клетке (Nishiyama Y., Rapp F., 1981).

Вирусы, обладая способностью оказывать мутагенный эффект, могут модифицировать, в том числе и усиливать, генетическое действие физических и химических факторов. В следующей главе будут освещены вопросы, связанные с особенностями влияния вирусов разных групп на способность клеток человека и млекопитающих восстанавливать повреждения ДНК, вызванные агентами различной природы.

ГЛАВА П.

РЕПАРАТИВНА8. АКТИВНОСТЬ В КЛЕТКАХ, ИНФИЦИРОВАННЫХ.

ВИРУСАМИ.

Данные экспериментальных исследований, накопленные в последние годы, свидетельствуют о том, что в зависимости от видовой принадлежности вируса, типа течения инфекционного процесса, характеристики воздействующего фактора наблюдаются различия в способности клеток репарировать повреждения собственной ДНК.

Рассмотрим подробно обнаруженные типы влияния вирусовингибирование, стимуляцию и отсутствие эффекта на репаративную активность клеток высших организмов.

2.1. Ингибирование репаративной способности клеток.

Впервые ингибирование эксцизионной системы репарации после УФ-облучения диплоидных клеток человека, инфицированных вирусом лейкоза млекопитающих ЛПВ, обнаружили О. Г. Анджапаридзе и др. (1972). Было установлено, что способность вырезать тиминовые димеры в инфицированных клетках полностью утрачивалась уже через 12−24 ч после заражения клеток и регистрировалась вновь через 15−20 дней, когда диплоидные клетки претерпевали трансформацию под влиянием онкрнавируса. Аналогичный эффект наблюдался в этой же системе при использовании в качестве повреждающих агентов и-метил-я-нитро-я-нитрозогуанидина и 4-нитрохинолин-1-оксида (0.Г.Анджапаридзе, Г. Д. Засухина, 1976; О. Г. Анджапаридзе и др., 1977; Г. Д. Засухина, 1979). Репарация повреждений, вызываемых этими агентами, осуществляется по типу, близкому к процессам при УФ-облучении. Репродукция вируса ЛПВ в диплоидных клетках человека сопровождалась репрессией системы репарации, воестанавливающей индуцированные химическими мутагенами повреждения ДНК.

Сходные данные об ингибирующем влиянии вируса sv -40 на эксцизию тиминовых димеров, индуцированных УФ-облучением в клетках китайского хомяка V-79, были получены Handschack w., Malz w. (1979). Методом фотолиза бромдезоксиуридина, включенного в ДНК сразу после облучения, было показано, что этот эффект отмечался только на ранних сроках инфицирования клеток.

Ингибирование эксцизионного этапа репарации тиминовых димеров, индуцированных УФ-облучением, наблюдали также в клетках коммерческих куриных эмбрионов, которые, как известно, контами-нированы вирусом лейкоза кур, тогда как в безлейкозных куриных эмбрионах эта система была активна (Н.П.Дубинин, Г. Д. Засухина, 1975; Paterson M. et al., 1974,1975).

При изучении способности клеток крысиных фибробластов, хро-нически инфицированных вирусом лейкоза Раушера, восстанавливать повреждения ДНК, индуцированные 4-нитрохинолин-1-оксидом, waters R. et al. (1977) обнаружили ингибирование процесса пост-репликативной репарации, совпадавшее с более высокой чувствительностью клеток к трансформации под действием канцерогена по сравнению с неинфицированными клетками. При этом в зараженных культурах не наблюдалось дефекта в восстановлении повреждений эксцизионным путем.

Рядом исследователей было установлено репрессирующее действие вируса герпеса на систему репарации в клетках человека. Так, снижение уровня репаративной репликации, коррелировавшее со злокачественной трансформацией, отмечалось в клетках легкого эмбриона человека, инфицированных вирусом простого герпеса (Lorentz a. et al., 1977). Нарушения репаративных процессов в лимфоцитах периферической крови людей с хронической герпесной инфекцией были обнаружены Fanta d. et al. (1978) и Topaioglou A. et al. (1980). С помощью метода хроматографии на колонках с BHDцеллюлозой и авторадиографического определения внепланового синтеза ДНК было выявлено ингибирование восстановления УФ-и гамма-индуцированных повреждений ДНК в клетках этих больных по сравнению со здоровыми донорами. На основании полученных данных авторы высказывают гипотезу о том, что некоторые дефектные основания в клетках, инфицированных вирусом герпеса, могут не распознаваться соответствующими ферментами, способствуя образованию брешей в дочерних нитях и погрешностей в последовательностях нуклеотидов после очередной репликации ДНК, что, в конечном итоге, может приводить к возникновению хромосомных аберраций и мутационных изменений ДНК. Учитывая то, что на связь вируса герпеса с процессами канцерогенеза неоднократно указывалось в литературе (Klein G., I972-Centifanto Y.M.et al., 1975), авторы приходят к заключению, что герпесная инфекция, по-видимому, приводит не только к снижению иммунокомпетентнос-ти лимфоцитов, но также, возможно, и к прямой активации уже присутствующих в ДНК онкогенных вирусных последовательностей.

Таким образом, данные литературы свидетельствуют о том, что вирусы, обладающие онкогенными потенциями, способны репрессировать отдельные этапы репарации ДНК, увеличивая тем самым, возможность превращения индуцированных повреждений ДНК в летальные и мутационные, которые могут служить источником злокачественной трансформации.

Косвенным доказательством способности вирусов репрессировать репаративные механизмы в клетках человека может служить тот факт, что при ряде аутоиммунных заболеваний, этиология которых связывается с длительной персистенцией вируса в организме, отмечается сниженный уровень репарации ДНК.

Так, в лимфоцитах крови больных системной красной волчанкой с помощью авторадиографии был обнаружен пониженный уровень репарации ДНК после гамма-облучения (Tuschi н., Aitmann н., 1976; Aitmann н., 1977). При этом заболевании методом ДНК-РЖ гибридизации было установлено наличие геном-эквивалентов вируса кори, интегрированных в ДНК лейкоцитов крови, лимфатических узлов и костного мозга (В.М.Жданов, 1975). Снижение скорости воссоединения разрывов ДНК после гамма-облучения наблюдалось также при ревматоидном артрите. Подавление внепланового синтеза ДНК, индуцированного гамма-облучением, по мнению авторов, происходит вследствие ингибирования ДНК-полимеразной активности клетки вирусными эндонуклеазами.

В то же время было показано, что при УФ-облучении лимфоцитов людей, страдающих аутоиммунными заболеваниями, интенсивность внепланового синтеза ДНК в них в первые 90 мин после облучения была выше, чем в лимфоцитах здоровых доноров. В дальнейшем внеплановый синтез ДНК в клетках больных уменьшался и находился на более низком уровне, чем в контроле. Увеличение активности внепланового синтеза ДНК в лимфоцитах больных в ранние сроки после воздействия УФ-облучения авторы объясняют наличием дополнительной эндонуклеазной активности, привнесенной инфекционным агентом.

Способность репрессировать репаративные процессы в клетках была обнаружена у целого ряда других инфекционных вирусов, вызывающих хронический тип течения инфекции, в опытах in vitro .

Так, в культуре клеток НЕр-2, хронически инфицированных вирусом клещевого энцефалита, было установлено ингибирование двух этапов эксцизионной репарации: отмечалось отсутствие вырезания тиминовых димеров после УФ-облучения клеток Ш. Н. Богомолова и др., 1974) и сниженный репаративный синтез ДНК (В.ВЛекова и др., 1978). В то же время при продуктивной инфекции, через 20 ч после заражения клеток НЕр-2 этим вирусом, система эксцизионной репарации функционировала также, как в контроле.

Ингибирование ресинтеза разрывов ДНК, индуцированных 4-нитрохинолин-1-оксидом в клетках НЕр-2, хронически инфицированных вирусами бешенства и краснухи, наблюдали Г. Д. Засухина и др. (1981), Й. В. Колонина (1983). Методом ультрацентрифугирования клеточных лизатов в градиентах щелочной сахарозы было установлено, что через 4 ч инкубации клеток после действия мутагенов репарация разрывов ДНК на 20% ниже по сравнению с незараженной культуройв процессе 20-часовой инкубации клеток наблюдалось еще большее торможение репарации ДНК: в клетках, инфицированных вирусом бешенства, коэффициент восстановления составлял 22−66%, вирусом краснухи — 0−66%, в то время как в контрольных клетках — 100%.

Сходные данные были получены и в культурах клеток человека Л-41, хронически инфицированных вирусом паротита (Й.В.Колонина, 1983). Коэффициент восстановления поврежденной 4-нитрохино-лин-1-оксидом ДНК в инфицированных клетках колебался от 0 до 71% после 4 ч постинкубации и от 0 до 64% через 20 ч после воздействия мутагена, в то время как в контрольных клетках, репарация ДНК за этот же период инкубации достигала 87−100%. При этом автор отмечает, что в случае первичного инфицирования клеток НЕр-2 и Л-41 вирусами бешенства и паротита, приводившего к развитию продуктивной инфекции, репарация ДНК после воздействия канцерогена происходила также интенсивно, как и в неинфициро-ванных культурах.

В системе клеток НЕр-2, хронически инфицированных вирусом краснухи, было выявлено также ингибирование репарации сшивок ДНК-ДНК, индуцированных митомицином С, связанное, по-видимому, со сниженной ДНК-полимеразной или ДНК-лигазной активностью (И.В.Колонина, 1983).

Такое снижение репаративной активности в хронически инфицированных клетках не было связано с индукцией вирусных мутантов, репрессирующих репаративную систему, поскольку разница между репаративной активностью контрольных клеток НЕр-2 и клеток, инокулированных вирусом бешенства, выделенным из хронически инфицированной культуры НЕр-2, отсутствовала.

По-видимому, ингибирование ресинтеза ДНК после обработки хронически инфицированных клеток мутагеном может объясняться отбором в клеточной популяции преимущественно клеток с частично или полностью дефектной системой репарации или с возникновением нарушений клеточной системы, вызванной присутствием в клетках вируса.

Таким образом, из приведенных данных литературы видно, что один и тот же эффект — ингибирование репарации клеточных ДНК регистрируется в клетках человека, хронически инфицированных вирусами, относящимися к различным группам: флавивирусам (вирус клещевого энцефалита), рабдовирусам (вирус бешенства), тогави-русам (вирус краснухи) и парамиксовирусам (вирус паротита), что может свидетельствовать об общности механизма ингибирования ре-паративных процессов в клетках человека, хронически инфицированных неонкогенными РНК-содержащими вирусами.

2.2. Отсутствие эффекта на репаративную способность клеток.

Исследования, проведенные с различными вирусами, вызывающими неодинаковый тип течения инфекционного процесса, выявили общую закономерность — отсутствие влияния на восстановление гамма-индуцированных повреждений ДНК клетки.

Так, при инфицировании клеток эмбрионов крыс вирусом Кил-хэма было показано, что 48-часовая инфекция не влияла на скорость восстановления гамма-индуцированных повреждений ДНК и профили седиментации в зараженных клетках и неинфицированных клетках через 15 мин постинкубации совпадали (Т.А.Синелыцикова, 1978). Такие же результаты были получены при хронической инфекции, вызываемой вирусом Килхэма в клетках почки эмбриона свиньи (Г.Д. Засухина и др., 1979а, 19 796).

О.Г.Анджапаридзе и др. (1977) отмечали отсутствие влияния вируса лейкоза млекопитающих ЛПВ на способность диплоидных клеток человека восстанавливать гамма-индуцированные повреждения ДНК, в то время как процесс репарации повреждений, индуцированных в этих же клетках УФ-облучением или химическими мутагенами, был подавлен.

Аналогичные данные были получены Г. Д. Засухиной и др. (1979), И. В. Колониной (1983) при гамма-облучении клеток НЕр-2, хронически инфицированных вирусами бешенства и краснухи, и клеток Л-41, хронически инфицированных вирусом паротита. Скорость ресинтеза разрывов ДНК, индуцированных гамма-облучением, не отличалась от регистрируемой в контрольных культурах. В то же время, репарация повреждений, вызванных химическим мутагеном 4-ни-трохинолин-1-оксидом, в этих клеточных культурах была ингибиро-вана.

Иная закономерность была выявлена при исследовании влияния вирусной инфекции на способность клеток восстанавливать повреждения ДНК, репарируемые по УФ-типу. Отсутствие эффекта на экс-цизионную систему репарации обнаруживалось только при латентной форме инфекции. Такие данные были получены в опытах с УФ-облу-чением при предварительном инфицировании вирусом клещевого энцефалита диплоидных клеток человека (О.Г.Анджапаридзе, Н. Н. Богомолова, 1974) и клеток НЕр-2 (В.В.Чекова и др., 1978), а также вирусами Менго и Ньюкастльской болезни клеток Hela (Hand н., Та mm I., 1972) .

При первичном инфицировании культур клеток НЕр-2 и Л-41 вирусами бешенства и паротита в латентной фазе инфекции также не было обнаружено влияния вирусов на репарацию повреждений ДНК, индуцированных 4-нитрохинолин-1-оксидом (И.В.Колонина, 1983).

Таким образом, данные литературы свидетельствуют о том, что влияние вирусов на длинный УФ-тип репарации во многом зависит от типа течения инфекции. В то же время вирусная инфекция не оказывает существенного влияния на быстрый тип репарации, индуцируемый гамма-облучением, что может быть связано с высокой устойчивостью этой эволюционно древнейшей системы репарации к различным факторам, либо это влияние не улавливается используемыми методами исследования.

2.3. Стимуляция репаративной способности клеток.

Эффект стимуляции репаративной активности клеток до настоящего времени обнаружен для весьма ограниченного числа вирусов. Наиболее четко было показано стимулирующее влияние вируса Dcno-вакцины (при первичном инфицировании мышиных’и куриных фибро-бластов) на способность клеток восстанавливать разрывы ДНК, индуцированные 4-нитрохинолин-1-оксидом (Г.Д.Засухина и др., 1978,1979; Т. А. Синельщикова, 1978,1983). Стимулирующий эффект регистрировался уже через 4 ч после инфицирования клеток и сохранялся на протяжении 24 ч после инокуляции. По мнению авторов, в основе этого феномена лежит индукция вирусом осповакцины специфической полимеразы. Действительно, в клетках Hela, инфицированных вирусом осповакцины, была обнаружена полимеразная активность, отличная от^СиJ3-энзимов (Citarella е. et ai., 1972).

Повышенная способность к репарации повреждений ДНК, индуцированных УФ-облучением и алкилирующими агентами, отмечалась также у крыс, инфицированных микоплазмами (Altmann н., 1977; Altmann н. et al., 1982). Этот эффект авторы рассматривают как следствие инфекции, продуцирующей повышенный уровень эндо-нуклеазной активности. Действительно, в настоящее время из культуры микоплазмы arferitidis выделена и охарактеризована эндону-клеаза, специфически воздействующая на двунитевую ДНК. Активность фермента обнаружена в различных органах и крови заражен ных крыс. Седиментационный анализ нуклеоидов из лимфоцитов и клеток селезенки выявил уменьшение степени суперспирализации ДНК в инфицированных клетках. Было обнаружено также повышение синтеза поли (АДФ-рибозы). У зараженных животных отмечалось увеличение активности репаративного синтеза ДНК после УФ-облучения и возрастание синтеза поли (АДФ-рибозы) в тех областях нуклео-сом хроматина клеток селезенки, которые наиболее чувствительны к воздействию нуклеазы микрококков.

Наличием дополнительной эндонуклеазной активности, привнесенной инфекционным агентом, объясняют Fanta D. et al. (1978) более высокую интенсивность репаративного синтеза ДНК в ранние сроки после УФ-облучения лимфоцитов крови больных с часто повторяющимися герпетическими высыпаниями по сравнению со здоровыми донорами.

Caradona S.J., Chung Y. (1982) уСТаНОВИЛИ, ЧТО при ИНДуКции вирусом простого герпеса продуктивной инфекции в клетках.

Hela, активность урацил-ДНК-гликозилазы, инициирующей начальный этап эксцизионной репарации в клетках, не только сохраняется, но и увеличивается по сравнению с контрольными клетками. Активация урацил-ДНК-гликозилазной активности зависит от белкового синтеза и подавляется циклогексимидом. При этом было обнаружено, что активность этого фермента в клетках, инфицированных вирусом простого герпеса типа 2, подавляется циклогексимидом в значительно меньшей степени, чем в инфицированных вирусом типа I и в неинфицированных клетках.

Следовательно, можно предположить, что-либо вирус модифицирует хозяйский фермент, либо в инфицированные клетки включается вирусная специфическая урацил-ДНК-гликозилаза.

Заражение клеток коммерческих куриных эмбрионов с репрессированной системой вырезания тиминовых димеров вирусом клещевого энцефалита приводило к дерепрессии репаративной активности (Н.П.Дубинин, Г. Д. Засухина, 1975). По мнению авторов, эффект стимуляции эксцизионной системы мог зависеть от нескольких причин. Во-первых, образующийся во время инфекции вирусом клещевого энцефалита интерферон мог подавлять репродукцию вируса лейкоза, которым контаминированы клетки, тем самым снимая эффект вирусиндуцированной репрессии. Во-вторых, интерферон, возможно, обладает способностью дерепрессировать ингибированные гены, ответственные за репарацию.

Усиление репаративной репликации, вызванной УФ-облучением или обработкой метилметансульфонатом, было обнаружено в клетках vero, предварительно инфицированных цитомегаловирусом (Nishiyama y., Варр р., 1981). Повышенная скорость репаратив-ного синтеза была зарегистрирована и с помощью седиментацион-ного анализа ДНК в градиентах щелочной сахарозы.

Во всех рассмотренных выше работах приводились данные, касающиеся влияния вирусов на те или иные этапы репаративных процессов, индуцированных физическими или химическими факторами. В настоящее время появились исследования, свидетельствующие о способности самих вирусов индуцировать репаративные процессы в клетках млекопитающих.

До недавнего времени репаративная репликация в клетках млекопитающих и человека, трансформированных под влиянием онкоген-ных вирусов, или при использовании в качестве мутагенов реплицирующихся инфекционных и онкогенных вирусов, не была показана ни одним молекулярно-биохимическим методом регистрации процессов репарации (В.В.Чекова и др., 1978; Т. А. Синельщикова, 1978; Hand R., Tamm I., 1971; Stick Н. et al., 1972; stich. H., 1975; Nishiyama т., rapp f., 1981). Способность вирусов разных групп вызывать хромосомные аберрации находилась в определенном противоречии с фактами, демонстрирующими отсутствие индукции вирусами репаративной репликации или разрывов ДНК в клетках (А.Н.Ава-кова, Р. И. Рапопорт, 1971; Н. Н. Ильинских, 1975,1976,1979; Т.Й.Бу-киевская, Л. А. Лукаш, 1980; Т. Й. Бужиевская, 1984;stich н. et ai., 1972,1974).

Однако, в последние годы, используя в качестве мутагена-индуктора вирус герпеса, Kucera J.S. .Edwards I. (1979) И Mar-con m.i., Kucera j.s. (1979) показали наличие репаративного синтеза ДНК, индуцированного этим биологическим агентом, в клетках человека. Феномен репаративной репликации, обнаруженный при инфицировании клеток вирусом герпеса, вызвал большой интерес к этим исследованиям. Возник вопрос: какие типы повреждений — одиночные разрывы или гэпы, являющиеся местом приложения ферментов пострепликативной репарации, вызывает инфицирование клеток вирусом герпеса. Nishiyama Y., Rapp F. (1981а) прс-вели изучение репаративного синтеза ДНК в эмбриональных фибро-бластах человека, а также в клетках пигментной ксеродермы, дефектных по эксцизионной репарации, в различные сроки после инфицирования клеток вирусом герпеса типа 2. С помощью метода ультрацентрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия они показали, что инфекция данным вирусом индуцировала репаративную репликацию ДНК уже на ранних сроках инфицирования — через 3−5 ч. Спустя 12 ч после инфицирования более 95 $ синтеза клеточной ДНК относилось к репаративному синтезу. Методом седи-ментационного анализа в градиентах щелочной сахарозы было показано, что через 12−14 ч после инфицирования клеточная ДНК подвергается интенсивной деградации, следовательно, разрывы ДНК, вызванные вирусом герпеса, могут быть субстратом для репаративного синтеза. Эти результаты указывают, что хромосомные аберрации, регистрируемые на ранних сроках инфицирования клеток вирусом, могут вовлекаться в репаративный процесс.

При исследовании фибробластов человека в более поздние сроки инфицирования (через 22−24 ч) весь синтез, не только клеточной, но и вирусной ДНК, был отнесен к репаративному, обладающему резистентностью к оксимочевине. Репаративная репликация клеточной и вирусной ДНК была обнаружена также в клетках пигментной ксеродермы, в которых вирус герпеса не репродуцировался.

Таким образом, была четко показана способность вируса герпеса типа 2 индуцировать репаративный процесс в клетках человека.

Этими же исследователями (Nishiyama Y., Rapp р., I98I6) было продемонстрировано повышение реактивации УФ-облученного вируса герпеса в клетках Vero, зараженных цитомегаловирусом.

Реактивация была максимальной при множественности цитомегаловируса I БОЕ/кл, когда его инфекционность не превышала 5%. И все же для проявления эффекта усиления репарации УФ-облученного вируса герпеса необходимо было присутствие функционирующего генома цитомегаловируса, поскольку эффект повышенной реактивации не наблюдался при заражении первичных культур клеток почек кролика, т. е. в непермиссивных условиях (Nishiyama т., Rapp Р., 1980). Предварительное инфицирование клеток Vero цитомегалови-русом усиливало реактивацию УФ-облученного вируса герпеса более значительно, чем предварительная обработка клеток УФ-лучами или метилметансульфонатом. Максимальное значение реактивирующего фактора (отношение титра УФ-облученного вируса к титру необ-лученного в обработанных мутагенами клетках по отношению к таковому в неинфицированных и необработанных клетках) было 12 для УФ-облученных клеток, 5 — для клеток, обработанных метилметансульфонатом и достигало 25 в предварительно инфицированных цитомегаловирусом клетках Vero. Подобный эффект наблюдали и в нормальных фибробластах человека, но не в клетках ксеродер-мы XPI2BE, обладающей сниженной herреактивацией, обусловленной дефектами механизма эксцизионной репарации. Восстановление ингибировалось кофеином и являлось, по-видимому, безошибочным, т.к. частота обратных мутаций к тимидинкиназе УФ-облученного вируса герпеса снижалась после его репродукции в клетках, инфицированных цитомегаловирусом.

Инфицирование клеток цитомегаловирусом само по себе не индуцировало репарабельные участки в клеточной ДНК и в противоположность УФ-облучению или метилметансульфонату, которые значительно подавляли синтез ДНК в хозяйских клетках, стимулировало этот синтез. Усиление репаративной активности клеток при предварительной репродукции в них цитомегаловируса без индукции в них повреждений, регистрируемых молекулярно-биохимическими методами, и без ингибирования нормального полуконсервативного синтеза ДНК в этих клетках, приближает, по мнению Nishiyama т. и Еарр f., этот тип репарации для УФ-поврежденного вируса герпеса к error-free (безошибочному) типу репарации. Авторы предполагают, что-либо цитомегаловирус может повышать конститутивную репаративную активность, либо индуцировать новый тип репарации ДНК, репрессированной в обычных условиях.

Суммируя имеющиеся в литературе данные о влиянии вирусной инфекции на отдельные этапы репарации, можно заключить, что вирусы разных групп, с одной стороны, и тип течения инфекционного процесса, обусловленный особенностями клеточной системы и вируса — с другой, могут оказывать неодинаковое влияние на способность клеток к репарации повреждений ДНК, индуцированных различными факторами. Таким образом, вирусы можно рассматривать как биологические регуляторы репаративной активности клеток.

Вирусы позволяют экспериментально «выключать» отдельные этапы репарации, имитируя тем самым фенотипически дефект соответствующих генов, как это описано в системе диплоидных клеток человека, инфицированных вирусом лейкоза, что соответствует по своей характеристике клеткам ксеродермы. Вместе с тем, если в диплоидных клетках человека, инфицированных вирусом лейкоза, репрессия носит временный характер, то в хронически инфицированных клетках феномен репрессии был стабильным. Независимо от видовой принадлежности вируса: тогавирусы (вирус краснухи), раб-довирусы (вирус бешенства), парамиксовирусы (вирус паротита), флавивирусы (вирус клещевого энцефалита) наблюдалось ингибиро-вание процессов ресинтеза разрывов ДНК, поврежденной 4-нитро-хинолин-1-оксидом, или вырезания пиримидиновых димеров в опытах с УФ-облучением.

Природа ингибирующего влияния хронической инфекции, по мнению Г. Д. Засухиной (1979), может быть обусловлена как дефектом на генетическом уровне, благодаря селекции в процессе длительного пассирования дефектных по эксцизионной системе клеток, так и связана с индукцией вирусных мутантов, репрессирующих процесс репарации.

Для исследованных вирусов (клещевого энцефалита, паротита, краснухи, бешенства, Килхэма, осповакцины, цитомегаловируса) при латентной инфекции была выявлена закономерность, заключающаяся в том, что вирусы либо не влияли, либо оказывали стимулирующий эффект на репаративную активность клеток при действии УФ-облучения или химических мутагенов. В этом заключалось существенное отличие от эффекта онкогенных вирусов, которые инги-бировали вырезание пиримидиновых димеров, образующихся после УФ-облучения, а также процесс ресинтеза разрывов ДНК, возникающих после действия химических агентов УФ-типа.

Эффект стимуляции репаративной активности может быть связан с несколькими причинами: участием в процессах репарации вирусных или индуцированных вирусами ферментов (Aitmann н. et al., 1982; Caradona s.J., Chung т., 1982) или воздействием интерферона (Г.Д.Засухина и др., 1982; Т. А. Синельщикова, 1983), который также индуцируется вирусами и обладает эндонуклеазной активностью (Taylor-Papadimitroii J., Stoker М., 1971; Nilsen Т., Bagiioni о., 1979), или дерепрессией некоторых клеточных генов, детерминирующих синтез отдельных ферментов репарации (Н.П.Дубинин, Г. Д. Засухина, 1975; Г. Д. Засухина, 1979).

Таким образом, не вызывает сомнений, что изучение влияния вирусов на репарацию имеет особое значение, так как вирусы поctdhhho циркулируют в окружающей среде и, в зависимости от генетических особенностей организма, могут вызывать различные типы инфекционного процесса, изменяя тем самым чувствительность индивидуума к различным экзогенным воздействиям, что особенно важно учитывать при возрастающем загрязнении окружающей среды, при лечении больных химиотерапевтическими препаратами.

Влияние вируса кори на репаративную активность клеток человека до сих пор не изучалось. Вместе с тем, сведения о влиянии коревой инфекции на одну из основных функций клетки — способность восстанавливать повреждения ДНК, могут иметь не только теоретический, но и практический интерес, в связи с тем, что в настоящее время проводится массовая иммунопрофилактика кори с использованием живой вирусной вакцины, а также с тем, что корь является довольно распространенным и тяжелым заболеванием у детей раннего возраста.

В следующей главе будет представлена краткая характеристика основных биологических свойств вируса кори, особенностей влияния «дикого» и аттенуированного штаммов на жизнедеятельность клетки. $<'д-лиотел*.

ГЛАВА Ш.

ЦИТОПАТОЛОГИЯ, ВЫЗЫВАЕМАЯ ВИРУСОМ КОРИ В КЛЕТОЧНЫХ.

КУЛЬТУРАХ.

Согласно современной классификации, вирус кори относится к семейству парамиксовирусов. Вирионы плеоморфны, содержат од-нонитевую линейную РНК относительной молекулярной массы 5−8хЮб дальтон (Staiicup r.c. et al., 1979). Имеют трубчатый нуклеокапсид около 18 нм со спиральной симметрией. Вирионы покрыты липидной двухслойной оболочкой. Средние размеры 150 180 нм. Репродукция происходит в цитоплазме.

Вирус кори размножается в культурах клеток человека и обезьян, а также в клетках других животных и птиц, вызывая различные виды инфекционного процесса. Обычно показателями вирусной инфекции, используемыми для индикации, титрования, определения вирулентности штаммов, служат морфологические изменения в зараженных клеточных культурах, называемые цитопатическими.

Цитопатическое действие вируса кори описано многочисленными исследователями (Eaders i.f., Prebies т., 1954; Я. Е. Хесин и до., 1961,1962;А. А. Колчурина, 1968;С. Н. Атанадзе и др., 1968;С. Н. Атанадзе, В. Я. Кармышева, 1969;Л. М. Чудная, 1971;В. Д. Соловьев и др., 1979;К.Чернееку и др., 1981 и др.). Характерной чертой цитопати-ческого эффекта вируса кори является образование симпластов, ве-ретеновидных клеток, формирование внутриядерных и цитоплазмати-ческих включений, содержащих вирусные антигены и РНК. Скорость и интенсивность этих проявлений зависит от множественности инфицирования. чувствительности клеточных культур, вирулентности штаммов (В.М.Дорофеев и др., 1963;Л. М. Чудная, 1971;Т.И.Бужиевс-кая, Л. М. Чудная, 1971;К.Чернеску и др., 1981 и др.).

При изучении клеточных культур, зараженных штаммами вируса кори разной степени аттенуации, комплексом разнообразных методов, В. Я. Кармышева (1981) выявила прямую зависимость между временем появления цитопатических изменений и временем генерации клеточной культуры, интенсивностью процесса генерализации морфологических изменений и множественностью инфицирования, выраженностью внутриядерных скоплений вирусного антигена и включений, скоростью деструкции клеточного пласта и вирулентностью штамма.

При исследовании динамики образования и накопления вирусных антигеновькультуpax, зараженных двумя эталонными штаммами вируса кори (Эдмонстпни JI-I6), c помощью непрямого метода флюоресценции было показано, что независимо от исследуемого штамма специфические поверхностные вирусиндуцированные антигены выявляются, главным образом, в плазмолеммах симпластов и веретено-видных клеток (Л.М.Фарутина и др., 1976). В конце 1-х или на 2-е сутки обнаруживается специфическая флюоресценция в виде ярко светящихся глыбок, расположенных перинуклеарно или по цитоплазме всей клетки. Мелкие, ярко светящиеся гранулы выявляются также в ядрах. В симпластах антиген локализуется в виде гранул в ядрах и включений различной формы в цитоплазме.

Т.Й.Бужиевская и др.(1975) наблюдали яркое специфическое свечение в ядрышках отдельных клеток уже через 2 ч после инфицирования перевиваемой культуры почки эмбриона человека вакцинным вирусом Л-16 в дозе 0,01 ТЦД50/кл. В дальнейшем вирусный антиген обнаруживался в виде мелких (через 6 ч) и более крупных (через 24 ч) включений в ядрах клеток, а также у оболочек ядер. Через 48 часов специфическая флюоресценция определялась и в цитоплазме клеток. Вирусологические исследования, проведенные этими же авторами, показали, что вновь образованный инфекционный вирус обнаруживается в клетках через 48 ч после инфицирования, в культуральной жидкости — через 72 ч.

В культуре клеток почек зеленой мартышки, инфицированной вакцинным вирусом ЭШЧ, динамика накопления вирусного антигена и образования инфекционного вируса была иной (С.Н.Атанадзе и др., 1968). Вирусный антиген обнаруживался через 12 ч после заражения (в дозе 30 БОЕ/кл) в единичных клетках в виде отдельных мелких внутриядерных и перинуклеарных глыбок. Инфекционный вирус, связанный с клеткой, начинал выявляться через 18 ч после инокуляции. При заражении клеточной линии A-I (амнион человека) этим же вирусом в дозе 0,01 ТЦД50 на клетку внутриядерные включения обнаружены не были (Л.М.Чудная, 1971).

Таким образом, приведенные данные могут служить иллюстрацией зависимости скорости и интенсивности цитопатических изменений от множественности инфицирования, субстрата культивирования и вирулентности штаммов вируса кори.

Вирус кори вызывает глубокие изменения клеточного метаболизма. Так, в ранние сроки после инфицирования в клетках обнаруживался интенсивный синтез РНК, белков, гликогена и липидов, в последующем снижавшийся (В.Я.Кармышева, 1981).

В течение первого часа после инфицирования клеток амниона человека вакцинным и «диким» штаммами вируса кори были обнаружены нарушения ритма биохимической активности клеток, в частности, нуклеинового обмена (И.С.Брит, 1973; Ю. А. Барштейн и др., 1974). Причем, было установлено, что «дикий» штамм, по сравнению с вакцинным, оказывает более резкое воздействие на метаболизм клетки, в большей степени репрессирует синтез клеточных нуклеиновых кислот.

Tomoko A.A. et al. (1976) выделили из культуральной жидкоети клеток Hela, зараженных мелкобляшечным вариантом вируса кори, фактор, подавляющий синтез ДНК хозяина.

Было обнаружено повышение активности альдолазы в культура-льной жидкости перевиваемых клеток почки морской свинки, инфицированных вирусом кори (штамм Л-4), коррелировавшее с ростом инфекционного титра вируса в течение первых 96 ч после заражения (Д.Б.Голубев, 1979).

Уменьшение активности сукцинатдегидрогеназы, НАДФ-Н2- и НАД-Н2-диафоразы, принимающих участие в энергетическом обмене клетки, при коревой инфекции отмечалось Л. А. Егиазарян и др., (1968).

Таким образом, в процессе коревой инфекции в клетке происходят изменения общих путей обмена, в частности, стимулируются пути катаболизма глюкозы, изменения претерпевают также ферменты, связанные с обменом предшественников нуклеиновых кислот. Изменения в синтезе конститутивных ферментов хозяина ведут к нарушению общей регуляции метаболизма клетки,.

В зависимости от функционального состояния культуры, периода клеточного цикла в момент инфицирования, множественности заражения и других факторов, в зараженных клетках митотическая активность может либо сразу угнетаться, либо кратковременно активироваться. Если нарушения клеточного метаболизма наступают после завершения периода s клеточного цикла, то деление клеток оказывается возможным (Roizman в., Scliiudenberg А., 1961: Hud-destone J.R. et al., 1980).

По данным Т.й.Бужиевской и Г. Г. Карасевой (1974) вакцинный штамм вируса кори Л-16, угнетая митотическую активность перевиваемых клеток почки эмбриона человека (ППЭЧ) уже через 2 ч после введения в культуру (19−21 $ по сравнению с 30 $ в контроле), увеличивал продолжительность клеточного цикла (до 54 ч у 2-суточной культуры), не изменяя существенно времени митоза. Степень этих изменений зависела от времени воздействия и дозы вируса. При низкой множественности заражения (0,01 ТЦД50 на клетку) явное уменьшение митотического индекса и увеличение продолжительности клеточного цикла наблюдалось через 6 ч после инокуляции. Однако через 72 ч после инфицирования клетки ППЭЧ восстанавливали митоти-ческую активность и приближались по параметрам к нормальным, не-зараженным культурам. При высокой множественности заражения (5 ТЦДэд на клетку) уже через 2 ч после инфицирования длительность митотического цикла увеличивалась до 41 ч и митотический индекс значительно снижался. Хотя и через 72 ч после заражения в условиях выраженного цитопатического эффекта отдельные клетки продолжали делиться, однако клеточный цикл удлинялся до 124 ч.

Снижение количества митозов в культурах, зараженных вирусом кори, наблюдали также С. Н. Атанадзе и др.(1968), Н. С. Радышич и др.(1969), Л. М. Чудная (1971), Cascardo М., Karzon D. (1964), Mauler R., Hennessen W. (1965) И Др.

Как показали исследования, проведенные Л. М. Чудной (1971), при заражении клеток различными штаммами коревого вируса, в течение 1-х суток после инокуляции нативные и аттенуированные штаммы подавляли митотическую активность клеток примерно в равной степени (на 18−20 $), но уже через 2 суток угнетение клеточного деления в культурах, инфицированных вакцинными штаммами, было выражено гораздо слабее.

Norrby е. et ai. (1966), изучая действие вируса кори штамма Эдмонстон на клетки линии Lu -106, обнаружили, что митотичес-кая активность культур после 4 ч контакта с вирусом составляла 20 $ исходного контрольного уровня.

Изучая митотическу активность в организме животных при воздействии вирулентных и вакцинных штаммов вируса кори, И. Г. Шройт (1963), И. Г. Шройт, А. С. Козлюк (1965), Л. В. Якубсон и др. (1966), Л. А. Анисимова (1977) установили, что вирулентные штаммы вызывают более выраженное увеличение митотической активности клеток лимфатического аппарата на фоне значительного усиления альтеративных процессов.

В настоящее время имеются данные, неоспоримо свидетельствующие о способности вируса кори вызывать хромосомные аберрации в клетках как in vivo, так и in vitro. Изменения хромосомного аппарата лейкоцитов крови больных корью было продемонстрировано Н.И.ИЛЬИНСКИХ (1976), Nichols W. (1966), Nichols W. et al. (1964,1965), Aula p. (1965), Gripenberg u. (1965) и др. Увеличение числа хромосомных аберраций наблюдалось также в лимфоцитах периферической крови детей, вакцинированных против кори (Н.И.Ильинских, 1975; Nichols W., Levan А., 1965; bavenda N., 1971), однако их количество никогда не достигало нижнего предела повреждений, отмечавшегося при заболевании корью.

Возрастание частоты патологических митозов в клетках лимфатического аппарата обезьян, зараженных вирулентными и вакцинными штаммами вируса кори, обнаружила Л. А. Анисимова (1977). При этом были отмечены определенные различия в качественном составе патологических форм митоза. В отличие от обезьян, зараженных вирусом, обусловившим, в основном, образование летальных форм аномалий митоза (К-митозы, многополюсные и многогрупповые митозы, рассеивание хромосом), у вакцинированных животных преобладали умеренные повреждения (отставание хромосом, мосты), которые могут дать начало популяции клеток с измененным кариотипом.

При изучении влияния живой коревой вакцины на хромосомный аппарат клеток костного мозга мышей С. Е. Черкезия и др. (1979) установили, что только с 30-х суток после иммунизации начиналось увеличение количества структурных аберраций хромосом, в основном, за счет хроматидных пробелов (в 2 раза больше, чем в контроле), и на 60-е сутки число хромосомных аберраций (преимущественно ацентрических хроматидных фрагментов) возрастало с высокой степенью достоверности.

В то же время частота цитогенетических нарушений в сплено-цитах мышей под влиянием вакцинного вируса кори Л-16 возрастала уже через 5 суток после иммунизации и достигала 30%, превышая контрольный уровень примерно в 5 раз (Н.Н Ильинских, 1984).

Эксперименты, проведенные in vitro, обнаружили возникновение хромосомных аберраций в клетках уже в ранние сроки после инфицирования (через 2−3 ч), что указывало на независимость их формирования от цикла вирусной репродукции (М.А.Левенштамм и др., 1969; Т. Й. Бужиевская и др., 1975; К. Чернеску и др., 1981).

При анализе повреждений хромосом в культуре клеток амниона человека АК-99, вызываемых вакцинными (Л-16, ЭШЧ, Л-4−30 и СССР-58) и вирулентными (М-6, Л-4) штаммами вируса кори в дозе 0,04 и 0,05 ТЦДэд на клетку, через 8 и 24 ч после инфицирования были выявлены 2 типа структурных изменений хромосом:

I) хромосомные аберрации в виде единичных и множественных разрывов хроматид с сопутствующими одиночными и парными фрагментами- 2) диффузные поражения хромосом, при которых все или большая часть хромосом метафазной пластинки претерпевали грубые изменения (Н.С.Радышич и др., 1969; М. А. Левенштамм и др., 1969; Н. С. Радышич, Е. М. Захарченко, 1972). Наблюдалась также пульверизация хромосом.

Увеличение частоты клеток с аномалиями хромосом было обнаружено в диплоидных клетках легкого эмбриона человека, инфицированных вакцинным (Л-16) и неаттенуированным (М-6) штаммами вируса кори (А.Н.Авакова, Р.й.Рапопорт, 1971). Аномалии включали разрывы (ацентрические фрагменты, делеции, дицентрики), пробелы" растяжение центромерной области и пульверизацию. Наиболее распространенным типом аберраций были истинные разрывы. Число ахроматиновых участков увеличивалось по сравнению с контролем в 5 раз. Феномен пульверизации не превышал 3,6%, и, в отличие от других аномалий, в контрольной группе не наблюдался. Результаты исследования не выявили различий в частоте появления клеток с нарушениями хромосом при различной множественности заражения (0,03 и 0,006 ТЦД<�зо на клетку), однако была установлена прямая зависимость от длительности инфекционного процесса. Максимальный эффект наблюдался через 22 ч после заражения клеток.

Т.И.Бужиевская, Л. М. Чудная (1971), Т. И. Бужиевская и др. (1975) наблюдали тяжелое поражение хромосом (набухание, пульверизация), множественную фрагментацию уже через 6 ч после инфицирования клеток ППЭЧ вакцинным вирусом кори Л-16 в дозе 0,01 ТЦДэд на клетку, Частота этих изменений возрастала со сроком инфицирования. В период от начала до 48 ч инфекции пульверизация хромосом встречалась редко, пораженные клетки составляли не более 1%, что соответствовало дозе введенного вируса. Через 72 ч после заражения число клеток с пульверизациями заметно увеличивалось. При этом пульверизация хромосом наблюдалась преимущественно в полиплоидных метафазных пластинках. Процент клеток с хроматидными разрывами через 24 ч после заражения в 3 раза превышал контрольный уровень, через 72 ч несколько снижался, но все же в 2 раза был выше, чем в неинфицированных клетках. Основная масса повреждений (хроматидные и изохроматидные разрывы хромосом, одиночные и парные ацентрические фрагменты, делеции) обнаруживались в хромосомах групп А, В и С и разница в распределении повреждений между контролем и опытом была несущественна.

При инфицировании клеток ППЭЧ вакцинным вирусом кори Л-16 в высокой дозе — 5 ТЦД50 на клетку уже через 2 ч после заражения в культурах появлялись типичные симпласты и пульверизация хромосом. Заражение клеток вирулентным штаммом коревого вируса вызывало пульверизацию хромосом чаще (до 20,6 $), чем вакцинным (7,3%) (Т.И.Бужиевская, Л. М. Чудная, 1971).

Таким образом, накопленные в литературе данные свидетельствуют о том, что различные штаммы вируса кори при серологической идентичности отличаются между собой по характеру цитопати-ческих изменений (сроки появления и величина симпластов, цитоплазма тическ их и внутриядерных включений, подавление митотичес-кой активности, повреждения хромосом). Характер этих различий во многом определяется степенью аттенуации вируса, однако в значительной степени зависит и от вида клеток, их функционального состояния, множественности инфицирования, условий культивирования и др. Установлено, что не только «дикие», но и вакцинные штаммы вируса кори способны оказывать повреждающее действие на генетический аппарат. клетки, вызывая как хромосомные аберрации, так и генные мутации.

Все это свидетельствует об актуальности проведения исследований, направленных на выяснение характера влияния коревой инфекции на репаративные функции клетки, участвующие в поддержании стабильности генетического материала.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

выводы.

1. Дана сравнительная оценка влияния вакцинного (штамм Л-16) и «дикого» (штамм Эдмонстон) вирусов кори на активность основных этапов процесса эксцизионной репарации поврежденной уф-лучами ДНК клеток человека.

2. При изучении начального этапа эксцизионной репарациивырезания тиминовых димеров, образующихся в клеточной ДНК при УФ-облучении, выявлены различия в скорости элиминации димеров в клетках, инфицированных вакцинным и «диким» штаммами: вакцинный вирус стимулировал процесс вырезания, в отличие от «дикого» штамма, ингибировавшего этот процесс.

3. Выявлено, что вакцинный штамм вируса кори, в отличие от «дикого», вызывает увеличение интенсивности репаративного синтеза ДНК, индуцированного УФ-облучением, по тестам внепланового синтеза ДНК (авторадиографическое исследование) и определения общей радиоактивности в ядрах интерфазных клеток.

4. Методом центрифугирования клеточных лизатов в щелочном градиенте сахарозы обнаружено отсутствие влияния вакцинного вируса и ингибирующий эффект «дикого» штамма на объем и скорость восстановления разрывов ДНК клеток в опытах с УФ-облучением.

5. При исследовании влияния вирусов кори на физиологическое состояние клеток установлено, что вакцинный штамм не изменяет продолжительность клеточного цикла, но задерживает вступление клеток в s-период, «дикий» штамм — вызывает удлинение клеточного цикла, что коррелирует с особенностями влияния исследованных штаммов на репаративную активность клеток.

6. Впервые доказано, что инфицирование клеток человека вакцинным вирусом кори, используемым в настоящее время для массовой вакцинации детей, не оказывает неблагоприятного действия на процесс репарации повреждений ДНК, индуцированных УФ-облучением.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Анализ данных литературы показал, что сведения об особенностях репарации индуцированных повреждений ДНК в клетках человека, инфицированных вирусами, немногочисленны и посвящены, как правило, изучению отдельных этапов репарационного процесса. Исследование всех этапов эксцизионной репарации в одной системе клетка-вирус не проводилось. В то же время представляется возможным, что вирусы могут неодинаково влиять на те или иные этапы процесса репарации, обеспечиваемые различными ферментами.

В литературе также полностью отсутствуют сведения об особенностях влияния различных штаммов одного и того же вируса, обладающих неодинаковыми генетическими свойствами, на репаративную активность клетки. Вместе с тем известно, что именно генетические свойства вируса могут определять степень его вирулентности, характер влияния на основные функции клетки.

Влияние коревой инфекции на эксцизионную систему репарации клеток человека до сих пор не изучалось.

В связи с тем, что в настоящее время проводится массовая иммунопрофилактика кори с использованием живой вирусной вакцины, а также тем, что корь остается довольно распространенным и тяжелым заболеванием у детей раннего возраста, сведения о влиянии вакцинного и «дикого» штаммов вируса кори на одну из основных функций клетки способность восстанавливать повреждения ДНК, могут иметь не только теоретический, но и практический интерес. В частности, они могут способствовать познанию механизмов влияния РНК-содержащих инфекционных вирусов на репаративную активность клеток человека и дать представление о том, как вакцинация детей отражается на репаративной функции клетки, участвующей в поддержании стабильности генетического материала.

Учитывая вышеизложенное, используя различные экспериментальные подходы, мы проводили комплексное изучение основных этапов эксцизионной репарации повреждений, индуцированных УФ-облучением, являющимся естественным мутагенным фактором окружающей среды, в клетках человека, инфицированных вакцинным и «диким» штаммами вируса кори. Было исследовано влияние вирусной инфекции на индукцию повреждений, вызываемых УФ-лучами, вырезание тиминовых димеров, репаративный синтез образовавшихся брешей и восстановление структуры ДНК.

В работе использовались чувствительные к вирусу кори перевиваемые клетки человека Л-41, в отдельной серии экспериментов, клетки линии Hela. Исследовалось влияние вакцинного штамма вируса кори Ленинград-16 и «дикого» — штамм Эдмонстон. Инокуляция клеток вирусами в дозе 0,01 ТЦД50 на клетку производилась за 24 ч до облучения. При такой множественности инфицирования вирусы, не вызывая цитодеструктивного эффекта в ранние сроки после заражения, оказывали значительное влияние на жизнедеятельность клеток (Л.М.Чудная, 1971; Т. И. Бужиевская, Г. Г. Карасева, 1974; Т. И. Бужиевская и др., 1975 и др.).

Поскольку чувствительность клеток к повреждающим агентам, а также репаративная активность их в значительной степени зависят от продолжительности клеточного цикла и длительности его отдельных фаз, которые могут изменяться от возраста культуры, условий культивирования, а также при заражении клеток вирусами (Г.Д.Засухина, 1979), мы исследовали влияние вакцинного и «дикого» штаммов на показатели митотического режима клеток через 24 и 48 ч после инокуляции (соответственно, к моменту УФ-облучения клеток и через 24 ч пострадиационной инкубации).

Сравнительное изучение цитопатического действия вакцинного и «дикого» штаммов вируса кори в культуре клеток Л-41 при одинаковой множественности инфицирования (0,01 ТЦД^ на клетку) показало, что цитоморфологические изменения в зараженных клеточных культурах, нарушение их метаболизма, определяются свойством вируса. Так, в опытах с «диким» штаммом вируса отмечалось значительное подавление митотической активности клеток (на 65% по сравнению с контролем), увеличение числа патологических форм митоза (15,5+1,12%, в контроле — 8,8+1,51%, рс0,05). «Дикий» вирус вызывал задержку прохождения клетками митотического цикла, блокируя переход из периода g1 в период s. В то же время вакцинный штамм при равной множественности инфицирования оказывал значительно менее выраженное влияние на изучаемые показатели физиологического состояния клеток. Задерживая вступление части клеток в sпериод клеточного цикла, вирус не изменял времени генерации клеток, уже начавших синтез ДНК.

Способность вируса кори в зависимости от степени аттенуа-ции оказывать различное влияние на хромосомный аппарат клетки, митотическую активность, продолжительность клеточного цикла в ранние сроки после инфицирования в низких дозах (0,01 ТЦД^ на клетку) показана и другими исследователями (Л.М.'Чудная, 1971; Н. С. Радышич, М. А. Левенштамм и др., 1969; Т. И. Бужиевская, Г. Г.Ка-расева, 1974 и др.).

Выявленные различия в характере влияния вакцинного и «дикого» штаммов на жизнедеятельность клеток позволили сделать заключение, что клеточные культуры к моменту УФ-облучения (через 24 ч после инфицирования) находились в неодинаковом физиологическом состоянии, что могло обусловливать различия в чувствительности к повреждающему воздействию и их способности восстанавливать индуцированные повреждения ДНК.

В наших исследованиях по определению числа тиминовых димеров, возникающих при УФ-облучении в дозах от 5 до 100 Дж/м2, было показано, что инфицирование клеток не отражалось на кинетике образования повреждений: количество димеров тимина во всех клеточных культурах возрастало линейно с увеличением дозы УФ-облу-чения до 40 Дж/м. Однако в клетках, инфицированных «диким» штаммом, при всех использованных дозах УФ-облучения обнаруживалось меньшее количество тиминовых димеров, чем в контрольных и инфицированных вакцинным вирусом. Это могло быть связано с тем, что в клетках, инфицированных «диким» вирусом, в результате образования блока Oj-s" происходило накопление клеток в ©-^-периоде и поэтому в момент УФ-облучения в этих культурах, по сравнению с контрольными и инфицированными вакцинным штаммом, больший процент клеточной популяции находился в предсинтетической фазе клеточного цикла, в которой, по данным Downes c.s. et al. (1979), может возникать на 20−50% меньше тиминовых димеров, чем в s-фазе.

Нельзя исключить и возможности, что низкий уровень тиминовых димеров, обнаруживаемый в клетках, инфицированных «диким» вирусом кори, обусловлен изменениями в количественном соотношении классов повреждений, индуцируемых УФ-облучением, в результате влияния этого биологического агента на структурную организацию клетки.

В следующей серии экспериментов мы исследовали влияние коревой инфекции на этап вырезания индуцированных УФ-облучением тиминовых димеров по убыванию их числа в кислотонерастворимой фракции ДНК через 12 и 24 ч пострадиационной инкубации клеток с помощью радиохроматографического метода.

В этих опытах была использована доза УФ-облучения 20 мл/", при которой, по данным проведенных предварительных экспериментов, за 24 ч пострадиационной инкубации удалялось, в среднем, 50% тиминовых димеров, что давало возможность выявлять как стимулирующий, так и ингибирующий эффекты вирусной инфекции.

Было установлено, что в клетках, инфицированных вакцинным вирусом кори, за 12 ч пострадиационной инкубации число димеров уменьшалось на 54%, а через 24 ч — на 70%, в результате чего к концу срока наблюдения количество оставшихся неудаленными повреждений в инфицированных клетках было на 20% меньше, чем в неин-фицированных.

В отличие от вакцинного вируса, «дикий» штамм вызывал угнетение эксцизионного этапа репарации. В течение 12 ч после УФ-облучения число димеров в клетках, инфицированных этим вирусом, уменьшалось всего лишь на 20%, а через 24 ч вырезанными оказывались только 32% индуцированных повреждений.

Проведенная нами статистическая обработка в двухфакторном комплексе Фишера данных, полученных в этих экспериментах, выявила сходство динамики вырезания повреждений в инфицированных и незараженных клетках и показала высокую достоверность стимулирующего влияния вакцинного вируса и ингибирующего влияния «дикого» штамма на интенсивность эксцизии УФ-индуцированных повреждений ДНК в клетках Л-41.

Аналогичные результаты, свидетельствующие о стимулирующем влиянии вакцинного штамма вируса кори на вырезание тиминовых димеров, были получены также на клетках Hela.

Данные о способности вакцинного вируса кори оказывать стимулирующий эффект на эксцизионный этап репарации УФ-индуцирован-ных повреждений ДНК в клетках человека получены нами впервые.

До настоящего времени эффект стимуляции вырезания тиминовых димеров был описан в клетках куриных эмбрионов при инфицировании их вирусом клещевого энцефалита (Н.П.Дубинин, Г. Д.Засухи-на, 1975), в диплоидных клетках человека, претерпевших трансформацию в результате заражения вирусом лейкоза млекопитающих (в.Г.Анджапаридзе и др., 1972), а также в лимфоцитах, полученных от больных лейкемией, в которых предполагается присутствие вируса Эпштейна-Барра (HuaDg A. et al., 1972).

Механизм повышения способности к удалению УФ-повреждений ДНК в клетках, инфицированных вирусами, точно не установлен. Предполагается, что такой эффект может быть обусловлен либо индукцией вирусом энзимов, принимающих участие в процессе восстановления (Fanta D. et al., 1978; Altmann H. et al., 1982), либо участием в репарации ферментов, содержащихся в кирусной частице (Caradona s., chirng Y 1982), либо связан с индукцией интерферона, обладающего некоторыми энзиматическими свойствами (Г.Д.Засухина, 1979; Г. Д. Засухина и др., 1980).

Для выяснения роли интерферона в изучаемом процессе мы использовали экспериментальные условия, исключающие активный ин-терфероногенез. Исследования проводили на перевиваемой линии клеток человека Л-41, обладающей слабо выраженной способностью продуцировать интерферон под действием вирусных индукторов (Я.Е. Хесин и др., 1979, 1981). Заражение клеток Hela вирусом производилось во взвесь в момент посадки клеточных культур, что, по данным Л. М. Трубиной и З. Ф. Яковенко (1976), также исключает активное образование интерферона.

Таким образом, стимулирующий эффект вакцинного вируса кори на репаративную активность клеток в наших экспериментах не связан с участием интерферона. по.

Ингибирующий эффект на вырезание тиминовых димеров, сходный с обнаруженным1 нами при инфицировании клеток Л-41 «диким» вирусом кори, описан в литературе при первичном заражении клеток НЕр-2, СПЭВ, диплоидных клеток человека вирусами клещевого энцефалита и западного энцефаломиелита лошадей, вызывающих острый тип течения инфекции (Н.П.Дубинин, Г. Д. Засухина, 1975), а также при инокуляции диплоидных клеток человека вирусом лейкоза млекопитающих (О.Г.Анджапаридзе и др., 1972).

Такой эффект может быть связан либо с депрессией вирусами генов клетки, ответственных за синтез репаративных ферментов, либо с тем, что вирусы сами оказывают ингибирующее влияние на ферментные системы клетки (Г.Д.Засух:ина, 1979).

Следующий раздел исследования был посвящен изучению влияния коревой инфекции на активность репаративного синтеза ДНК. Скорость и интенсивность этого процесса взаимосвязана с кинетикой инцизии и элиминации повреждений ДНК.

Для количественной оценки репаративной репликации были использованы следующие методические приемы: регистрация уровня и интенсивности синтеза ДНК по включению слабой метки в ядра интерфазных клеток с помощью авторадиографииподсчет общей радиоактивности клеток, включивших Нтимидин, на фоне подавления ре-пликативного синтеза оксимочевиной. Репаративный синтез ДНК, стимулированный УФ-облучением в дозах от 5 до 20 Дщ/м2, определяли в интактных и инфицированных клетках через 2 ч после облучения.

Проведенные эксперименты показали, что уровень репаративного синтеза ДНК как в неинфицированных, так и в инфицированных культурах, возрастает с увеличением дозы УФ-облучения, достигая максимума при 15 Дж/м2. Однако в культурах, зараженных вакцин.

Ill ным штаммом вируса кори, интенсивность репаративного синтеза ДНК при всех дозах облучения была на 20% выше, чем в неинфицированных.

В отличие от вакцинного штамма, заражение клеток «диким» вирусом оказывало ингибирующее влияние на активность индуцированного УФ-облучением репаративного синтеза ДНК, особенно четко проявляющееся при дозах 15 и 20 Дщ/м2.

Таким образом, полученные в этих экспериментах данные полностью коррелировали с результатами изучения эффективности вырезания тиминовых димеров из ДНК и свидетельствовали о повышении активности этих этапов репарации в клетках, инфицированных вакцинным вирусом, и подавлении их при заражении клеток «диким» штаммом.

Способность стимулировать ресинтез поврежденной ДНК клетки была обнаружена также для вируса осповакцины (Г.Д.Засухина и др., 1979; Т.А.СйНелЬЩИКОВа, 1983) И ЦИТОМЭГалОВИруса (Kishiyama Y., Rapp P., 1981).

В то же время, для таких вирусов, как вирус болезни Нью-кастла, Менго, клещевого энцефалита, Килхэма, вызывающих подавление клеточных синтезов, при первичном инфицировании клеток было описано отсутствие влияния на репаративную репликацию ДНК (Т.А.Синельщикова, 1978; В. В. Чекова и др., 1978; Г. Д. Засухина и др., 1979;Hand R., Ташп I., 1972).

По-видимому, такие различия во влиянии вирусов на репара-тивный синтез ДНК могут быть связаны с их видовыми особенностями, в частности, со способностью индуцировать полимеразы, участвующие в репаративном процессе, а также с генетической характеристикой вируса (аттенуация).

Действительно, в клетках Hela, инфицированных вирусом осповакцины, была обнаружена полимеразная активность, отличная от с/— и fэнзимов (citarella R. et al., 1972). Новая ДНК-полиме-разная активность регистрировалась также после инфицирования различных клеток вирусом герпеса (Мао j. et al., 1975). Доказательством того, что энзим кодируется вирусным геномом, служило то, что температурочувствительные мутанты вируса герпеса, не способные синтезировать вирусную ДНК в непермиссивных условиях, индуцировали температурочувствительную ДНК-полимеразу. В то же время показано, что вирусы sv-40 и полиомы не продуцировали новых полимераз, но повышали уровень oiполимеразыпри этом fl-полимеразная активность не изменялась (Mhrkhammar S., Magnus-son G., 1976).

В наших экспериментах различия в характере влияния изучаемых штаммов вируса кори на репаративную активность клеток могли быть связаны с более высокой цитопатической активностью «дикого» штамма. Вызывая значительное подавление синтеза клеточной ДНК, вирус мог блокировать репаративный синтез, действуя по типу таких ингибиторов репликативного синтеза, как цитозинарабинозид, афидиколин и др. (jonson R.T.et al., 1982), также подавляющих репаративную репликацию в клетках.

Однако, проведенные эксперименты, в которых сравнивали репаративную активность клеток (по тесту репаративного синтеза ДНК) при сходной выраженности цитопатического эффекта, достигавшегося заражением клеток вакцинным и «диким» вирусами в дозах 0,1 и 0,01 ТЦД50 на клетку, соответственно, показали, что при более высокой множественности инфицирования вакцинный штамм, в отличие от «дикого», не оказывал ингибирующего влияния на активность репаративного синтеза. В то же время, отсутствовал и стимулирующий эффект, обнаруженный для вакцинного вируса в меньшей из. дозе.

Таким образом, была выявлена зависимость влияния вируса на репаративную активность клетки от множественности инфицирования. Кроме того, установленный нами факт, что при сходном цитопати-ческом действии вакцинного и «дикого» штаммов сохраняются различия в их влиянии на восстановительные процессы в клетке, свидетельствует о роли генетических различий вирусов в оказываемых эффектах.

Подтверждением того, что характер влияния вируса кори на репаративную активность клеток в значительной мере определяется степенью его цитопатического действия, явились результаты следующей серии экспериментов, посвященных изучению эффективности воссоединения разрывов ДНК — заключительного этапа эксцизионной репарации.

Проведенные исследования показали, что в то время, как предшествующие этапы репарационного процесса в клетках, инфицированных вакцинным вирусом кори в дозе 0,01 ТЦДзд на клетку, протекали более интенсивно, чем в неинфицированных, эффективность восстановления повреждений ДНК не отличалась от контрольного уровня, и через 24 ч после облучения количество восстановленных разрывов ДНК было примерно таким же, как и в контроле (75% и 88%, соответственно, р>0,05).

В то же время при инфицировании клеток вакцинным вирусом в дозе 0,1 ТЦД50 на клетку интенсивность восстановления ДНК в течение 24 ч после УФ-облучения была снижена (коэффициент восстановления в инфицированных клетках — 57%, в контроле — 88%). Следовательно, можно сделать заключение, что при более остром течении инфекции вакцинный вирус кори оказывает ингибирующее влияние на стадию ресинтеза ДНК, возможно, за счет уменьшения ДНК-лигазной активности.

Известно, что процесс воссоединения ресинтезированных фрагментов с основной нитью ДНК-лигазой является АТФ-зависимым (Soderhall s., Lindahl т., 1976 и Др.). В связи с этим можно предположить, что в основе ингибирующего влияния вируса кори на этот этап репарации лежит способность подавлять активность ферментов, участвующих в энергетическом обмене клетки (Л.А.Егиаза-рян и др., 1968).

В отличие от вакцинного вируса, при исследовании клеток, зараженных «диким» штаммом, было обнаружено, что скорость деградации ДНК после облучения в этих клетках резко снижена и восстановление разрывов через 24 ч пострадиационной инкубации не происходило. Таким образом, установлено, что «дикий» вирус кори ин-гибировал все изучавшиеся этапы эксцизионной репарации повреждений, индуцированных УФ-облучением, в клетках человека.

Обнаруженное нами снижение не только объема, но и скорости репарации УФ-повреждений в клетках, инфицированных «диким» вирусом кори, может быть связано с ингибированием первых этапов репарации, связанных с активностью эндонуклеаз. Подобный эффект описан в клетках больных пигментной ксеродермой, дефектных по эксцизионной репарации (Robbins J., Praemer К., 1972; Maker V. et al., 1975) .

Таким образом, наши исследования дают представление об особенностях протекания процесса эксцизионной репарации индуцированных УФ-облучением повреждений ДНК в клетках человека, инфицированных различными штаммами вируса кори, и вносят определенный вклад в познание механизмов влияния вирусов на способность клеток восстанавливать повреждения собственной ДНК.

Полученные данные о потере способности клетки, инфицированной «диким» вирусом кори, восстанавливать индуцированные повреждения ДНК, дают новую информацию для понимания механизмов мутагенного действия вируса.

Установленные различия в эффектах, оказываемых вакцинным и «диким» штаммами вируса кори на репаративный синтез ДНК, индуцированный УФ-облучением, в силу доступности метода, используемого для его оценки, могут служить одним из критериев безопасности вакцинных препаратов, а также явиться дополнительным маркером аттенуации вируса кори.