Факторы патогенности нехолерогенных штаммов Vibrio cholerae

Актуальность проблемы. На сегодняшний день достоверно установлено, что в комплексе факторов патогенности холерных вибрионов центральное место принадлежит холерному токсину (CT), структура, свойства и механизм действия которого достаточно хорошо изучены: это состоящий из двух субъединиц нейтральный белок, способный сорбироваться на рецепторах мембраны GMi и активировать аденилатциклазу, что приводит к быстрому развитию типичной клинической картины холеры [Sears C.L., Kaper J.D., 1996; Walia К., Ganguly N.K., 2010]. С этим фактором не без основания связывают и эпидемическую опасность возбудителя. Штаммы, не содержащие в своем геноме генетических детерминант CT — генов ctxAB, принято считать эпидемически безопасными. Вместе с тем, как свидетельствуют многочисленные литературные данные, патогенность вида Vibrio cholerae носит ярко выраженный полидетерминантный характер. В настоящее время уже описан целый ряд дополнительных токсинов, продуцируемых штаммами различных серогрупп. Их список постоянно пополняется, однако роль каждого в развитии заболеваний, вызываемых холерными вибрионами, остается спорной либо недостаточно изученной.

Генетические детерминанты большинства токсинов известны, картированы на двух хромосомах V. cholerae [Heidelberg J.F. et al., 2000] и представлены в базах GenBank, что значительно облегчает биоинформационный анализ и дальнейшие исследования с помощью клонирования генов в штаммах кишечной палочки и направленного получения искомых продуктов для определения их свойств и биологического действия. Другие были описаны только как факторы, выделенные из культуральных жидкостей холерных вибрионов, и гены их до сих пор не идентифицированы. К первым относятся, в частности, токсины Zot (zonula occludens toxin) и Ace (accessory cholera enterotoxin), гены которых входят вместе с ctxAB в состав мобильного СТХ-элемента, представляющего собой геном умеренного филаментоз-ного фага CTXcp [Waldor М.К., Mekalanos J.J., 1996] либо производных его предшественника, pre-СТХф [Boyd E.F., Heilpem A.J., 2000]- MARTX (multifunctional autoprocessing repeats-in-toxin) [Fullner Satchell K.J., 2007]- гемагглютинин/протеаза (HA/P) [Wu Z. et~al., 2000; Ghosh A. et~al., 2006], цитотонический фактор Cef (CHO cell elongating factor) [McCardell B.A. et al., 2000, 2002], термостабильный токсин (ST, Stn/Sto) [Arita M. et al., 1986], растворимый гемолизин/цитолизин HlyA [Zitzer A. et al., 1997; Walia K., Ganguly N.K., 2010], недавно идентифицированный cholix-токсин [J0rgensen R. et al., 2008]. У отдельных штаммов V. cholerae non01/non0139 были выявлены гены термостабильного прямого гемолизина (TDH) — ключевого фактора патогенности V parahaemolyticus [Nishibuchi М. et al., 1990]. Наконец, всего в одной публикации [O'Brien A.D. et al., 1984] сообщается о вероятной способности некоторых штаммов V. cholerae к продукции шигапо-добного токсина (Sltl), фактора патогенности энтерогемолитических штаммов кишечной палочки. Однако в этой работе были использованы исключительно иммунологические методы, а в немногочисленных исследованиях с помощью ПЦР и молекулярного зондирования [Moyenuddin et al., 1992; Sharma et al., 1998; Bag P.K. et al., 2008] ген sltl у холерных вибрионов выявлен не был. Поэтому для ответа на вопрос о его встречаемости у V. cholerae необходимо исследовать большее число штаммов.

Группа токсинов с неизвестными генетическими детерминантами включает NMDCY (non-membrane-damaging cytotoxin) [Saha P.K. et al., 1996], NCT (new cholera toxin) [Sanyal S., 1984, 1990] и W07 (novel toxin) [Walia K. et al., 1999]. Поскольку на момент их описания геном холерных вибрионов еще не был расшифрован полностью, авторам не удалось идентифицировать эти факторы на генетическом и биоинформационном уровнях. Поэтому правомерность их статуса как отдельных самостоятельных токсинов требует пересмотра с учетом новых данных.

Помимо собственно токсинов, холерные вибрионы продуцируют множество других факторов, так или иначе связанных с патогенностью либо с персистенцией вне организма хозяина. Это прежде всего пили адгезии.

TCP (toxin coregulated pili), кодируемые кластером генов в составе острова патогенности VPI [Karaolis D.K.R. et al., 1998], Сер (core encoded pilin) — пилин, кодируемый одним из генов профага СТХ [Waldor М-К., Mekalanos J.J., 1996], MSHA (маннозочувствительный гемагглютинин) [Watnick P.I. et al., 1999], а также ферменты патогенности, такие, например, как нейраминидаза (NanH), ген которой находится в центральной части острова патогенности VPI-2 [Jermyn W.S., Boyd E.F., 2002]. Недавно у холерных вибрионов были выявлены две контакт-зависимые системы секреции — третьего и шестого типов, соответственно T3SS [Dzeijman М. et al., 2005] и T6SS [Pukatzki S. et al., 2006, 2008]. Их структура, функции, особенности экспрессии и роль в патогенезе охарактеризованы лишь отчасти.

Наш интерес к дополнительным токсинам и другим факторам патогенности V. cholerae обусловлен в первую очередь тем обстоятельством, что на территориях России и пограничных государств (бывших республик СССР) от больных с признаками диареи различной степени тяжести и из объектов внешней среды периодически выделяются штаммы холерных вибрионов 01 и не01/не0139 серогрупп, лишенные генов ctxAB, но способные вызывать заболевания людей и/или проявляющие признаки вирулентности на лабораторных моделях [Подосинникова JI.C., 1993; Воронежская Л. Г., 1994; Топорков А. В. с соавт., 2005; Москвитина Э. А. с соавт., 2002, 2005]. Распространение таких штаммов обычно не принимает эпидемического характера, но они бывают связаны с локальными вспышками острых кишечных инфекций (ОКИ) и заслуживают более пристального внимания в связи с наносимым ущербом здоровью людей и материальными затратами на проведение соответствующих лечебных и санитарно-гигиенических мероприятий. Примерами могут служить вспышки ОКИ в Донецке (Украина) в 1972 г., в Самаркандской области Узбекистана в 1990 г. и в Каменском районе Ростовской области РФ в 2005 г.- спорадические заболевания в Таджикистане (1971), Азербайджане (1989), Узбекистане (1988, 1989), Грузии (1981), Краснодарском крае (1975, 1977, 2001, 2004), Кисловодске, Украине и Молдове (1991), Ессентуках (1993), Ростовской области (1994), Челябинске (2000), Астрахани (1996, 2000), Кирове и Волгограде (2001), Пензе (2002), Калмыкии (2001, 2002, — 2011), возбудителями которых явились вибрионы эльтор. Известны также многочисленные случаи и вспышки, вызванные V. cholerae non01/non0139 на различных территориях России и сопредельных государств [Воронежская Л.Г., 1994; Онищенко Г. Г. с соавт., 2001). Очевидно, способность таких штаммов вызывать заболевания обусловлена высоким уровнем продукции ряда дополнительных токсинов и/или других биологически активных факторов. С этой точки зрения представляет интерес изучение степени вирулентности нехолерогенных штаммов с различными генотипами на лабораторных моделях включая электронно-микроскопические исследования, которые ранее не проводились.

Для выявления конкретной роли отдельных факторов в патологии необходимо наличие их препаратов. Как известно, наиболее перспективным подходом является клонирование генов в лабораторных штаммах кишечной палочки и создание активных продуцентов рекомбинантных белков. Поскольку штаммы Escherichia coli, предназначенные для генной инженерии, сами не продуцируют каких-либо биологически активных субстанций, для определения действия токсинов могут быть использованы грубые лизаты либо осветленные дезинтеграты клеток рекомбинантных клонов. В распоряжении отечественных ученых до начала наших исследований отсутствовали такие продуценты Zot, а зарубежным авторам не удалось получить эффективной продукции штаммами Е. coli НА/Р, Cef и Асе.

Поскольку генетические детерминанты многих дополнительных факторов и способность к их экспрессии выявлены и у холерогенных штаммов [Ерошенко Г. А. с соавт., 2004; Костромитина Е. А., 2004; Миронова Л. В. с соавт., 2004; Топорков А. В. с соавт., 2005; Нефедов К. С., 2009], также есть все основания предполагать, что они усиливают тяжесть течения эпидемической холеры, что, в свою очередь, может потребовать коррекции соответствующих подходов к ее лечению и профилактике. Наконец, данные о распространении генов различных факторов, связанных с патогенностью, среди холерных вибрионов, выделяемых на территориях России и пограничных государств, будут востребованы при паспортизации штаммов.

Цель работы. Изучение структурно-функциональных особенностей и биологического действия токсинов холерных вибрионов, распространения и экспрессии генов факторов патогенности в пределах вида Vibrio cholerae и оценка их значимости в вирулентности нехолерогенных штаммов.

Основные задачи исследования:

1. Клонирование генов гемагглютинин/протеазы hap А, СНО-удлиняющего фактора cef, дополнительного холерного энтеротоксина асе и zonula ос-cludens-токсна zot V. cholerae в составе плазмидных векторов, обеспечивающих их контролируемую экспрессию, и создание штаммов E. coliпродуцентов кодируемых ими белков.

2. Получение препаратов рекомбинантных белков — продуктов клонированных генов, изучение их свойств и биологического действия на различных моделях. Выявление ультраструктурных изменений, вызываемых препаратами гемагглютинин/протеазы и СНО-удлиняющего фактора Cef в культурах клеток и в кишечнике мышей-сосунков.

3. Биоинформационный анализ гемагглютинин/протеазы, СНО-удлиняющего фактора Cef, дополнительного холерного энтеротоксина Асе и zonula ос-cludens-токсна Zot V. cholerae. Секвенирование гена cef V. cholerae 0139.

4. Генотипическая и фенотипическая характеристика штаммов холерных вибрионов, несущих профаг рге-СТХ. Изучение возможности образования ими репликативных форм (РФ) и инфекционных фаговых частиц.

5. Сравнительный анализ свойств цитотоксина, не повреждающего мембрану (NMDCY), новых холерных токсинов NCT и W07 со свойствами других известных факторов патогенности с использованием литературных и собственных данных.

6. Определение с помощью ПЦР распространения среди холерных вибрионов различных серогрупп генов профагов СТХ, рге-СТХ и RS1, цитотоксического комплекса RTX, островов патогенности VPI и VPI-2- генов cef hapR, mshA, stn/sto и некоторых других. Молекулярное зондирование холерных вибрионов на присутствие в их геномах генов термостабильного токсина (stn/sto), шигаподобного токсина (sltl), термостабильного прямого гемолизина (tdh) и родственного ему гемолизина (trh) V.parahaemolyticus.

7. ПЦР-детекция генов систем секреции третьего и шестого типов (T3SS и T6SS) и изучение их экспрессии на модели лабораторного штамма амебы Dictyostelium discoideim.

8. Изучение фенотипического проявления вирулентности нехолерогенными штаммами V. cholerae с различными генотипами in vivo и in vitro. Сравнительное изучение ультраструктурных изменений, вызываемых холеро-генными и нехолерогенными штаммами в кишечнике кроликов-сосунков.

Научная новизна и теоретическая значимость. Получены приоритетные данные о свойствах ряда дополнительных токсинов и их возможной роли в развитии заболеваний, вызываемых холерными вибрионами.

Впервые сконструированы рекомбинантные плазмиды, экспресси-рующие клонированные гены hap, А и асе V. cholerae, и серия рекомбинант-ных плазмид, экспрессирующих гены cef V. cholerae 01 (обоих биоваров), 0139 и не01/не0139 серогрупп в штаммах кишечной палочки. Сконструирован штамм E. coli — высокоактивный продуцент рекомбинантного белка Zot и штамм-продуцент гемолизина proHlyA. Приоритетность работы подтверждена получением авторского свидетельства № 1 649 809 от 15.01.1991 «Штамм бактерий E. coli — продуцент гемолизина Vibrio cholerae eltor" — патентов на изобретения: № 2 313 577 от 27.12.07 «Рекомбинантная плазмида, экспрессирующая клонированный ген cef (СНО cell elongating factor) Vibrio cholerae (варианты) и штамм Escherichia coli — продуцент Cef (СНО cell elongating factor) Vibrio cholerae (варианты)" — № 2 313 576 от 27.12.07 «Рекомбинантная плазмида, экспрессирующая клонированный ген асе Vibrio cholerae, и штамм Escherichia coli — продуцент accessory cholera enterotoxin Vibrio cholerae» и № 2 306 337 от 20.09.07 «Рекомбинантная плазмида, экспрессирующая клонированный ген гемагглютинин/протеазы Vibrio cholerae, и штамм Escherichia coli — продуцент гемагглютинин/протеазы Vibrio cholerae». Получено свидетельство о регистрации в Реестре баз данных Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам базы данных «Распространение холерных вибрионов в объектах окружающей среды на территории Российской Федерации в 2005;2008 годах» № 2 010 620 040 от 14.01.10.

На основе анализа литературных и собственных экспериментальных данных доказана идентичность НА/Р и NMDCY, описанного в литературе как новый самостоятельный токсин.

Впервые показано, что Cef V. cholerae 0139, в отличие от Cef V. cholerae Ol и non01/non0139, не способен к гидролизу трибутирина при сохранении твиназной активности. Впервые секвенириован ген cef V. cholerae 0139, в нем выявлена точковая мутация, которая привела к несинонимичной замене остатка гидрофобной аминокислоты (валина) остатком гидрофильной (треонина) в его продукте, что явилось причиной сужения спектра субстратной специфичности последнего. Впервые показана специфичность гена cef для холерных вибрионов 01, не01/не 0139 серогрупп и ctxAB+ штаммов 0139 серогруппы, а также отсутствие этого гена у ctxAB' вибрионов Бенгал, сопровождающееся утратой твиназной активности.

Впервые выявлены ультраструктурные изменения в культурах клеток и в кишечнике мышей-сосунков под действием препаратов НА/Р и Cef холерных вибрионов, показана способность этих белков вызывать серьезные повреждения клеточных органелл.

Изучена структура и изменчивость профагов pre-СТХ в составе геномов более 20 штаммов холерных вибрионов, выделенных в СНГ, показана возможность их горизонтальной передачи за счет образования инфекционных вирионов.

Проведен комплексный анализ генотипических и фенотипических свойств большого числа нехолерогенных штаммов V. cholerae, выделенных на территориях бывшего СССР, определена частота встречаемости у них генов cef, mshA, tolQRA, vps-кластера, цитотоксического комплекса RTX, островов патогенности VPI и VPI-2. В геноме ряда штаммов 01 серогруп-пы впервые выявлены последовательности, гомологичные гену tdh V. parahaemolyticus, у многих штаммов 01 и не01/не 0139 серогрупп установлено присутствие последовательностей, гомологичных гену stn/sto, но полное отсутствие trh и sltl.

Получены экспериментальные данные, свидетельствующие в пользу того, что NCT, описанный в литературе как новый холерный токсин, на самом деле представляет собой варьирующую по качественному и количественному составу смесь секретируемых факторов патогенности.

Впервые установлено широкое распространение генов T3SS среди ctxAB' штаммов V. cholerae 01 серогруппы. С использованием модели D. discoideim впервые показана экспрессия T6SS нехолерогенными штаммами 01 серогруппы и определено, что устойчивостью к поеданию амебой обладают только штаммы, содержащие генетические детерминанты ее активных доменов — актин-связывающего (acd-vgrGl) и пептидогликан-связывающего (pbd-vgrG3), а также остров патогенности VPI.

Впервые исследованы ультраструктурные изменения в тонком кишечнике кроликов-сосунков при заражении холерогенными штаммами 0139 и не01/не0139 серогрупп, нехолерогенными штаммами 01 и не01/не0139 серогрупп.

Практическая значимость работы. Штаммы E. coli, содержащие и экспрессирующие гены холерных вибрионов в составе рекомбинантных плазмид рНР61, рАсе90, pZot69, pCef 69 В, pCef61B, pCef 49 В, pCeDl депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий (ГКПБ) «Микроб» (Саратов) под номерами КМ 192, КМ 194, КМ 193, КМ 191, КМ 190, КМ 189, КМ 188 соответственно. Штамм E. coli — продуцент гемолизина V. cholerae eltor депонирован в музее живых культур ГИСК им. JI.A. Та-расевича под номером 182.

Депонированы в ГКПБ «Микроб» штаммы V. cholerae Ol KM 253 -продуцент репликативных форм и вирионов СТХф и RSlcp и V. cholerae non01/non0139 KM 209, одновременно содержащий профаг СТХ и кластер генов T3SS.

Нуклеотидная последовательность гена cef V. cholerae 0139 и аминокислотная последовательность его продукта депонированы в базах GenBank под номерами JF499787 и АЕС4 822.1 соответственно.

Отработаны методы выделения рекомбинантных белков. Подобраны адекватные биологические модели (культуры клеток) для тестирования токсинов in vitro. Штамм E. coli, экспрессирующий клонированный ген hap, А V. cholerae, и полученный из него препарат НА/Р использован сотрудниками лаборатории биохимии микробов Ростовского противочумного института в исследованиях системы активатор плазминоген/плазмин у холерных вибрионов (акт внедрения от 4.07.11). Осветленные ультразвуковые дезинте-граты этого же штамма и штамма E. coli — продуцента гемолизина вибриона эльтор используются сотрудниками группы гибридом в качестве контрольных препаратов при изучении соответственно цитотоксической и цитодест-руктивной активности холерных вибрионов на модели культур клеток (акт внедрения от 9.11.11).

Сконструирован новый набор праймеров для детекции генов V. chol-erae. Методы ПЦР используются в лаборатории микробиологии холеры Ростовского противочумного института для проведения скрининга музейных и свежевыделенных культур на присутствие генов факторов патогенности с 2002 г. по настоящее время (акт внедрения от 12.09.11), а результаты ПЦР-генотипирования — для паспортизации штаммов холерных вибрионов, хранящихся в Музее живых культур Ростовского противочумного института (акт внедрения от 16.07.11).

Методические подходы к детекции генов факторов патогенности у штаммов V. cholerae вошли в состав «Методических рекомендаций по мониторингу наличия холерных вибрионов в поверхностных водоемах и сточных водах на территории административного района или населенного пункта», одобренных Ученым советом Ростовского противочумного института и утвержденных директором института (протокол № 7 от 22.10.07), МУК 4.2.2218−07 «Лабораторная диагностика холеры», утвержденных Главным государственным санитарным врачом РФ Г. Г. Онищенко 31.05.07, и практического руководства «Лабораторная диагностика опасных инфекционных заболеваний» (под редакцией акад. РАМН Г. Г. Онищенко и чл.-корр. РАМН В. В. Кутырева, М.: Медицина, 2009).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Клонирование гена hap A V. cholerae в Е. coli позволило впервые установить, что рекомбинантная гемагглютинин/протеаза осуществляет не только самопроцессинг, но и деградацию белков чужеродного хозяина. Гемагглютинин/протеаза обладает гемагглютинирующей и протеолити-ческой активностями, осуществляет процессинг холерного токсина, термолабильного токсина кишечной палочки и гемолизина вибрионов эль-тор, а также вызывает морфологические и ультраструктурные повреждения клеток и тканей. Впервые доказана идентичность гемагглюти-нин/протеазы и цитотоксина, не повреждающего мембрану (NMDCY).

2. Рекомбинантные белки СНО-удлиняющего фактора Cef, выделенные из штаммов E. coli, экспрессирующих клонированные гены cef V. cholerae Ol, 0139 и non01/non0139, обладают твиназной активностью, вызывают удлинение культивируемых клеток и накопление жидкости в кишечнике мышей-сосунков, а также значительные повреждения ультраструктуры клеток и тканей. Впервые установлено, что ген cef холерных вибрионов Бенгал, в отличие от cef V. cholerae Ol и non01/non0139, содержит точковую мутацию, приводящую к несинонимичной замене остатка гидрофобной аминокислоты на остаток гидрофильной, следствием чего является утрата его продуктом способности к гидролизу трибутирина.

3. Активные домены (AT1002) zonula occludens-токсинов Zot, кодируемые генами профагов СТХ и pre-СТХ, идентичны, что указывает на наличие у них одинаковой биологической активности. Белки Асе (дополнительный холерный энтеротоксин) и Zot, выделенные из сконструированных нами рекомбинантных штаммов со/ií-, биологически активны на моделях in vitro и in vivo. Холерные вибрионы, содержащие рге-СТХ, образуют инфекционные вирионы, способные к горизонтальному переносу генов факторов патогенности сер (core encoded pilin), асе и zot.

4. Новый холерный токсин (NCT), описанный в литературе как отдельный самостоятельный токсин, представляет собой варьирующую по составу смесь нескольких секретируемых биологически активных факторов, в состав которой могут входить гемагглютинин/протеаза и СНО-удлиняющий фактор Cef.

5. Кластер генов системы секреции третьего типа распространен почти исключительно среди нехолерогенных штаммов. Впервые показано присутствие этого кластера в геномах штаммов Ol серогруппы. Все штаммы холерных вибрионов содержат кластер генов другой системы секреции — шестого типа, но, как показано на модели амебы Dictyostelium discoideum, у многих она находится в неактивном состоянии из-за отсутствия актин-связывающего домена ключевого эффектора VgrGl и/или острова патогенности VPI.

6. Нехолерогенные штаммы V. cholerae могут обусловливать на модели кроликов-сосунков энтеропатогенный и сходный с холерогенным эффекты, однако интенсивность эффектов не коррелирует с генотипами. Морфологические и ультраструктурные изменения в кишечнике свидетельствуют о том, что факторы патогенности V. cholerae «взаимозаменяемы», то есть отсутствие одних компенсируется повышенной продукцией других, результатом чего является развитие заболевания.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на заседаниях проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» межведомственного научного совета по санитарно-эпидемической охране территории РФ (1993;2010 гг.), Российских научно-практических конференциях по проблеме «Холера» (Ростов-на-Дону, 1992, 1995, 2003), международных симпозиумах «VIBRIO-2007» (Париж, Франция, 2007) и «Fifty years of discovery of cholera toxin: a tribute to S.N.De» (Колката, Индия, 2009) — а также представлены на научной конференции «Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ» (Волгоград, 1992), на юбилейной научной конференции «Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний» (Екатеринбург, 1999), международном конгрессе «Ninth International Congress for Culture Collections» (Brisbane, Австралия, 2000), VI Российском съезде врачей-инфекционистов (Санкт-Петербург, 2003) — III, XIII, XV, XVII Российских Гастроэнтерологических неделях (Москва, 1997, 2007, 2009, 2011), Всероссийской конференции «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний» к 80-летию ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» (Киров, 2008) — международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Новосибирск, 2009).

Публикация результатов исследований. Материалы исследований отражены в 63 опубликованных работах, из них 28 — в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени, и 1 — в зарубежном издании.

Структура диссертации. Диссертация написана в стиле монографии, изложена на 282 страницах, состоит из введения, шести глав, заключения и выводов, иллюстрирована 20 таблицами и 54 рисунками. Библиография содержит ссылки на 369 публикаций (в т.ч. 49 работ отечественных и 320 -зарубежных авторов).

выводы.

1. Рекомбинантные белки — продукты клонированных генов гемагглюти-нин/протеазы hap А, СНО-удлиняющего фактора cef, дополнительного холерного энтеротоксина асе и zonula oceludens-токсина zot V. cholerae, экспрессируемых сконструированными штаммами E. coli, сохраняют все виды ферментативной и/или биологической активности.

2. Гемагглютинин/протеаза (HA/P) V. cholerae осуществляет самопроцес-синг и деградацию белков чужеродного хозяина, что позволяет выделять ее из рекомбинантных штаммов E. coli в зрелой форме. НА/Р обладает широким спектром протеолитической активности и способностью вызывать существенные морфологические и ультраструктурные нарушения в культивируемых клетках и в кишечнике чувствительных животных, то есть является фактором патогенности/персистенции.

3. Результаты сравнительного анализа собственных и литературных данных свидетельствуют об идентичности гемагглютинин/протеазы и цито-токсина, не повреждающего мембрану (NMDCY), описанного в зарубежных публикациях как самостоятельный токсин V. cholerae.

4. СНО-удлиняющий фактор Cef V. cholerae обладает эстеразной активностью и вызывает морфологические и ультраструктурные изменения в культурах клеток и кишечнике чувствительных животных, то есть может играть существенную роль как в патогенности, так и в персистен-ции. Его молекула содержит лейциновую «молнию», домен Куница и активный центр сериновых липаз, который обусловливает эстеразную, но не цитотоническую активность.

5. СНО-удлиняющий фактор Cef холерогенных вибрионов Бенгал отличается от Cef V. cholerae Ol и non01/non0139 неспособностью к гидролизу трибутирина при сохранении твиназной активности. Это изменение спектра субстратной специфичности обусловлено точковой мутацией в кодирующем его гене, следствием которой явилась несинонимичная замена остатка гидрофобной аминокислоты на остаток гидрофильной. Ген cef присутствует в геномах всех холерных вибрионов, кроме нехолеро-генных штаммов 0139 серогруппы, которые лишены и твиназной активности.

Активные домены zonula ocdudens-токсинов Zot, кодируемых генами профагов СТХ и pre-СТХ, идентичны, что указывает на наличие у них одинаковой биологической активности. Zot вызывает разрежение плотного монослоя культивируемых клеток in vitro и приобретение чувствительности к белкам E. coli клетками кишечника in vivo. Дополнительный холерный энтеротоксин Асе является консервативным белкомон вызывает накопление жидкости в кишечнике мышей-сосунков. В клетках холерных вибрионов, геномы которых содержат тандем из двух профагов pre-СТХ, могут образовываться инфекционные вирионы, способные к горизонтальному переносу генов токсинов {асе, zot) и пилина (сер).

7. Нехолерогенные штаммы V. cholerae содержат как консервативные (общие с холерогенными) гены факторов патогенности/персистенции, так и целый ряд генетических детерминант, которые могут присутствовать/отсутствовать в их геномах, образуя различные сочетания. С помощью молекулярного зондирования у многих штаммов V. cholerae OI и non01/non0139 выявлены последовательности, гомологичные гену термостабильного токсина, а у штаммов одного клона OI серогруппывозбудителей локальной вспышки — термостабильного прямого гемолизина V. parahaemolyticus.

8. Новый холерный токсин NCT, описанный в литературе как отдельный самостоятельный токсин, представляет собой варьирующую по качественному и количественному составу смесь нескольких секретируемых биологически активных факторов, которая может включать гемагглю-тинин/протеазу и СНО-удлиняющий фактор Cef.

9. Кластер генов системы секреции третьего типа (T3SS) распространен почти исключительно среди нехолерогенных штаммов V.cholerae. Впервые показано присутствие этого кластера в геномах штаммов OI серогруппы. Все штаммы содержат кластер генов системы секреции шестого типа (T6SS), но не у всех присутствуют последовательности, кодирующие ее активные домены — актин-связывающий (ACD-VgrGl) и пепти-догликан-связывающй (PBD-VgrG3). Модель Dictyostelium discoideum позволяет определить способность холерных вибрионов к экспрессии системы секреции шестого, но не третьего типа. Штаммы, устойчивые к поеданию амебой, всегда содержат не только генетические детерминанты активных доменов T6SS, но и остров патогенности VPI.

10. Нехолерогенные штаммы V. cholerae варьируют по уровням продукции различных биологически активных факторов in vitro и могут вызывать различающиеся по интенсивности эффекты на модели кроликов-сосунков: энтеропатогенный и сходный с холерогенныммногие обладают инвазивностью. Однако интенсивность эффектов не коррелирует с генотипами использованных для заражения штаммов.

11. Ультраструктурные изменения в кишечнике, обусловленные холероген-ными и нехолерогенными штаммами V. cholerae, имеют существенные различия. Если первые вызывают, в основном, гидропическую (баллонную) дистрофию, приводящую к гибели клеток, то вторые — необратимые повреждения и некроз эпителиоцитов, апоптоз лимфоцитов либо расширение межклеточных промежутков в щеточной кайме. Вместе с тем, те и другие инициируют и сходные повреждения клеточных орга-нелл и капилляров, что является, однако, следствием активности разных токсических субстанций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

На протяжении седьмой пандемии холеры ее возбудители — штаммы У. ско1егае еког — проявили себя как микроорганизмы, подверженные повышенной изменчивости по сравнению со своими классическими предшественниками, очевидно, обусловленной крайней пластичностью их генома. В условиях стремительного развития цивилизации загрязнение открытых водоемов промышленными отходами с одной стороны и широкое применение антимикробной терапии с другой обострили борьбу за существование и «вынудили» возбудителей приспосабливаться к выживанию как во внешней среде, так и в организме хозяина. Именно начиная с конца прошлого столетия и по настоящее время все большее внимание привлекают к себе нехоле-рогенные штаммы, которые, хотя и не являются эпидемически значимыми, способны вызывать не только спорадические случаи, но и вспышки ОКИ различной степени тяжести за счет продукции целого ряда факторов пато-генности. Генетические детерминанты части таких факторов консервативны — они присутствуют и в геномах холерогенных штаммов, но их участие в патогенезе обычно не столь очевидно, будучи «замаскированным» действием высокоактивного холерного токсина (СТ). Напротив, у штаммов, утративших СТХ-элемент (либо изначально его не содержавших), ведущая роль в вирулентности переходит к иным токсическим субстанциям. Активация их продукции в отсутствие СТ может быть вызвана как положительной регуляцией транскрипции их генов, так и «освобождением» основного пути транспорта готовых продуктов во внеклеточное пространство — системы секреции второго типа (Т288). Гены некоторых факторов свойственны почти исключительно нехолерогенным штаммам и были приобретены, вероятно, за счет генетического обмена с другими бактериями. В процессе адаптации холерные вибрионы, как и многие другие возбудители ОКИ, «научились» использовать различные, порой «изощренные» способы взаимодействия с организмом хозяина. Например, ряд ферментов, изначальным предназначением которых являлось, по-видимому, жизнеобеспечение бактериальной клетки, приобрели черты факторов агрессии по отношению к макроорганизму, не утратив при этом роли в персистенции. К числу таких факторов мы относим подробно изученные в рамках настоящей работы гемагглюти-нин/протеазу (НА/Р) и СНО-удлиняющий (цитотонический) фактор Cef.

НА/Р считается ключевой протеазой холерных вибрионов [Nagamune К. et al., 1996; Vaitkevicius К. et al., 2006], играющей важную роль в адаптации к условиям внешней среды включая взаимодействие с гидробионтами [Halpern М. et al., 2003; Broza М., Halpern М., 2001; Kashi Y., 2007] и к кишечнику человека, обеспечивая открепление адгезированных вибрионов и распространение инфекции [Finkelstein R.A. et al., 1992; Silva A.J. et al., 2003], а также осуществляя активацию CT и гемолизина HlyA [Booth В.А. et al., 1984; Nagamune К. et al., 1996]. Однако конкретная роль НА/Р в патогенезе до начала наших исследований не была доказана.

Нами был впервые получен штамм E. coli, экспрессирующий клонированный в составе рекомбинантной плазмиды ген hap A V. cholerae под контролем Т5 промотора. Благодаря способности продукта этого гена к само-процессингу и деградации большинства белков чужеродного хозяина удалось разработать ускоренный метод выделения из штаммов E. coli зрелой формы НА/Р с ММ 32 к Да, которая обладала всеми типами описанной для нее активности: гемагглютинирующей и протеолитической включая способность к процессингу CT, термолабильного токсина (LT) E. coli и pro-HlyA. Наличие продуцента и препарата позволило нам исследовать ряд свойств, ранее не описанных в литературе. В частности, установлен более широкий по сравнению с известным спектр субстратной специфичности. Показана способность НА/Р вызывать округление культивируемых клеток СНО, L-929, HeLa, НЕр2 и McCoy и разрушение плотного монослоя MDCK и СаСо2, что сопровождалось серьезными ультраструктурные нарушениями: образованием многочисленных «пузырей» на поверхности клеток и клазматозом, вакуолизацией цитоплазмы, набуханием митохондрий и повреждением крист, увеличением числа лизосом, а также не затрагивающим плотных контактов (1]) расширением межклеточных промежутков в монослое. На модели мышей-сосунков НА/Р вызывала статистически достоверное увеличение веса их кишечника. Как и в культуре клеток, в ткани тонкой кишки наблюдалось появление крупных лакун между смежными эпителио-цитами, а также формирование в их цитоплазме очагов дегенерации. Это происходило на фоне изменений в эндотелии капилляров, дополненных экстравазальными нарушениями, зависящими от дегрануляции тучных и Ес-клеток, которая способствует выделению факторов повышения сосудистой проницаемости (гистамин, серотонин, гепарин) и, как следствие, развитию интерстициального отека. Оказалось, что жидкость накапливается в основном не в просвете, а в стенках кишечника.

Биоинформационный анализ и сравнение собственных и литературных данных привели нас к заключению об идентичности НА/Р и ЫМБСУ (поп-тетЬгапе-с1ата§^ суЮШхт), описанного 8аЬа Р.К. е1 а1. (1996) как самостоятельный цитотоксин У. ско1егае. Результаты проведенных исследований показали, что НА/Р (ТЧМОСУ) обладает двойной функцией и является фактором патогенности/персистенции.

Цитотонический фактор Се£ термолабильный белок с ММ -85 к Да, обладающий эстеразной активностью, способностью вызывать удлинение клеток СНО и накопление жидкости в кишечнике мышей-сосунков — один из самых малоизученных предполагаемых факторов патогенности V. ско1-егае. До начала наших исследований все сведения о нем ограничивались тремя публикациями [МсСагёеП В.А. е? а1., 2000, 2002; 8а1Ьуатоо11−11у V. е/ а1., 2000]. Ранее гены се/ V. ско1егае 01 обоих биоваров были клонированы МсСагёеН В.А. а. (2002) с использованием Р1сЫа разЮпя, поскольку им не удалось клонировать его в векторе рВАБ. Однако в дрожжевом хозяине образовался гликозилированный продукт, утративший биологическую активность ш у1уо и поэтому непригодный для изучения характера его воздействия на макроорганизм. Нам удалось преодолеть эту проблему путем успешного клонирования генов се/ представителей не только обоих биоваров.

Ol, но также 0139 и не01/не0139 серогрупп и их эффективной экспрессии в E. coli под контролем Рвлггпромотора, что позволило выделить препараты искомых белков, сохранивших все известные свойства. Метод выделения и подходы к определению свойств полученных препаратов были подобраны на основе биоинформационного анализа. Прогностические данные о том, что Cef представляет собой термотолерантную сериновую липазу с доменом Куница и лейциновой «молнией», подтверждены экспериментально. Показано, что цитотоническая активность Cef не связана с эстеразной.

Нами установлено, что Cef холерных вибрионов 0139 серогруппы отличался от Cef представителей других серогрупп неспособностью к гидролизу трибутирина при сохранении твиназной активности. Поскольку какие-либо данные о Cef V. cholerae 0139 в литературе отсутствовали, мы секве-нировали его ген и сравнили полученную нуклеотидную последовательность и аминокислотную последовательность его продукта с таковыми штаммов Ol и не01/не0139 серогрупп, представленных в GenBank. Были выявлены одна нуклеотидная замена (Т на С в позиции 2015) по сравнению с cef V. cholerae классического биовара и две (GT на АС в позиции 20 142 015) по сравнению с cef V. cholerae эльтор и non01/non0139. Данная точковая мутация привела к появлению в Cef-0139 остатка треонина (Т) в позиции 672, тогда как у Cef классического типа в этой позиции находится остаток изолейцина (I), у Cef эльтор — валина (V). I и V относятся к одной и той же группе гидрофобных аминокислот, а Т в Cef-0139 — к гидрофильным с полярной R-группой. Эта несинонимичная замена повлияла на вторичную и, возможно, третичную структуру белка Cef-0139 и позволила объяснить сужение спектра его субстратной специфичности.

Мы впервые изучили ультраструктурные изменения в культуре клеток L-929 и в тонкой кишке мышей-сосунков при действии одного из полученных нами препаратов — Cef V. cholerae классического биовара. Как в культивируемых клетках, так и в эпителии кишечника Cef вызывал выраженную вакуолизацию цитоплазмы, свидетельствующую о нарушениях водно-электролитного баланса и обезвоживании клеток. Вероятно, это явилось причиной нарушений структуры внутриклеточных органелл, продукты распада которых переваривались активизированным лизосомальным аппаратом. На уровне макроорганизма обезвоживание усугублялось вовлечением в процесс тучных клеток и, как следствие, дополнительной потерей жидкости через стенки кровеносных сосудов. Эти данные определенно указывают на причастность Cef к проявлению холерными вибрионами патогенных свойств, что в первую очередь относится к нехолерогенным штаммам.

Ранее ничего не было известно о степени специфичности гена cef для вида V.cholerae. Мы провели его ПЦР-детекцию в геномах нескольких сотен штаммов и выявили, что он всегда присутствовал у холерных вибрионов обоих биоваров Ol, не01/не0139 и СТХ+ штаммов Ol39 серогруппы, но отсутствовал у всех изученных СТХ" водных штаммов Бенгал. Именно они, в отличие от остальных, оказались лишенными твиназной активности, сохранив способность к гидролизу трибутирина, по-видимому, за счет действия других липаз/эстераз. Эти результаты, полученные с использованием природной «модели» — се/-негативных вибрионов Бенгал, подтверждают, что твиназная активность V. cholerae связана с Cef. Однако, учитывая принципиальные отличия в структуре геномов водных штаммов 0139 серогруппы от всех прочих представителей вида V. cholerae [Ерошенко Г. А. с соавт., 2004], для ответа на вопрос о том, является ли он единственной твиназой холерных вибрионов, необходимы дальнейшие исследования. Вместе с тем, широкое распространение гена cef среди штаммов различных серогрупп и достаточно высокий уровень его экспрессии позволяют полагать, что данный фактор может вносить существенный вклад в выживаемость холерных вибрионов в водоемах и сточных водах, которые в настоящее время значительно загрязнены поверхностно-активными веществами. Таким образом, Cef, как и НА/Р, является фактором патогенности/персистенции.

Из литературных данных известно также прямое либо косвенное участие в патогенезе таких ферментов, как собственная аденилатциклаза.

V.cholerae [Савельев В.H. с соавт., 2004], рибозилтрансфераза (cholix toxin) [Jorgensen R. et al., 2008] и сериновая протеаза [Syngkon A. et al., 2010].

Своеобразным путем адаптации холерных вибрионов к существованию в организме человека представляется «эксплуатация» в качестве факторов патогенности продуктов генов сер (core encoded pilin), асе (accessory cholera enterotoxin) и zot (zonula occludens toxin), входящих в состав геномов филаментозного фага CTXcp [Waldor М.К., Mekalanos J.J., 1996] либо его ctxAB' предшественника pre-СТХф [Boyd E.F. et al., 2000] и необходимых для вирогении. Продукт гена сер является белком капсида CTXcp [Waldor М.К., Mekalanos J.J., 1996], однако холерные вибрионы используют его в качестве дополнительного фактора колонизации кишечника [Pearson G.D.N. et al., 1993]. Продукт гена zot способствует сборке вирионов и их выходу из бактериальной клетки [Waldor М.К., Mekalanos J.J., 1996; Faruque S.M., Albert M.J., 1998], но может вызывать в кишечнике увеличение межклеточной проницаемости за счет реструктуризации актинового цитоскелета эука-риотических клеток, приводящей к ослаблению tj, обеспечивая таким образом более свободный доступ токсинов и других белков к клеточной мембране [Fasano А., 1995, 1997, 2001а, Ь]. Экспрессия reHazoi приводит к образованию белка с ММ 45 кДа, из которого в результате процессинга под действием специфических протеаз V. cholerae образуются 2 формы: N-концевая (33 кДа), ответственная за вирогению, и С-концевая (12 кДа) — собственно токсин, или AG [Menon D. et al., 2005; Song K.H. et al., 2008], обладающий биологической активностью, которая, однако, в той же степени проявляется и исходной молекулой [Fasano A. et al., 1991,1995; Baudry В. et al., 1992; Trucksis M. et «/., 1993, 1997, Uzzau S. et al., 1999]. AG представляет интереснейший пример своеобразной „мимикрии“, т.к. является аналогом эндогенного модулятора tj зонулина и использует его рецептор [Wang W.L. et al., 2000bFasano A., 2001a, Ь]. Ранее было показано, что 33 кДа форма обладает сходством с белками целого ряда филаментозных фагов, но собственно токсиновая форма уникальна, т. е. токсическое действие свойственно только ZotCTX (p [Писанов Р.В., 2004]. В соответствии с задачами настоящего исследования наибольший интерес для нас представляла именно эта форма, и мы провели подробный биоинформационный анализ с моделированием ее вторичной структуры. Поскольку среди холерных вибрионов, выделенных на территориях России и бывших республик СССР, нами была выявлена группа штаммов, несущих pre-СТХ, нас интересовал вопрос о том, обладает ли AGpre CTX свойствами токсина или же они были приобретены только после образования полного СТХ с новым З'-концом гена zot, поскольку С-концы Zot и Zotpre~ существенно различаются [Boyd E.F. et al., 2000]. Для ответа на этот вопрос мы сравнили АК последовательности продуктов генов zot, входящих в состав профагов СТХ и pre-СТХ, представленных в GenBank. Оказалось, что изменчивость AG не затрагивает ни мотива, ответственного за связывание с рецептором Zot/ зонулина [Di Pierro M.D. et al., 2001], ни активного домена ATI002, которому принадлежит ключевая роль в разрушении tj [Motlekar A. et al., 2006; Goldblum S.E. et al., 2011]. Что же касается значительно различающихся С-концов AG, то они, тем не менее, обладали сходными вторичными структурами и вошли в число сходных АК блоков. Идентичными оказались и потенциальные трансмембранные домены. Эти данные свидетельствовали о наличии у Zotpre» CTX такой же биологической активности, как у Zot.

Продукт гена асе, также белок капсида [Waldor М.К., Mekalanos J.J., 1996; Faruque S.M., Albert M.J., 1998], в то же время обладает свойствами ион-проницаемой поры [Trucksis М. et al., 2000]. Сравнительный анализ первичной структуры Асе ряда штаммов, содержащих СТХ и pre-СТХ, показал полную консервативность этого белка, т. е. Асерге СТХ достоверно несет ту же функциональную нагрузку. Моделирование вторичной структуры Асе позволило установить, что большая часть его молекулы представлена двумя а-спиралями — потенциальными трансмембранными доменами. Вероятно, способность Асе интегрировать в мембрану объясняет его токсичность для клеток кишечника, выражающуюся в нарушении их ионного баланса.

Дальнейшие исследования роли Zot и Асе в патогенезе требовали наличия их препаратов. Поэтому мы клонировали гены zot и асе в плазмидном векторе pQE30, сконструировали штаммы E. coli — продуценты рекомби-нантных белков и получили из них препараты-сырцы. Несмотря на присутствие в рекомбинантных молекулах N-концевого гексагистидинового блока (и отсутствия процессинга Zot) оба белка обладали характерной для них биологической активностью. Zot вызывал заметное разрежение плотного монослоя в культурах клеток СаСо2, McCoy и L-929, а также проявление на модели мышей-сосунков энтеротоксичности содержащимися в препарате балластными белками E. coli, которые в отсутствие Zot сами по себе абсолютно безвредны даже для такой чувствительной модели. Асе не оказывал существенного влияния на культуры клеток, но вызывал статистически достоверное накопление жидкости в кишечнике мышей-сосунков.

Поскольку эти данные еще раз подтвердили «токсический статус» Zot и Асе, мы обратили особое внимание на штаммы холерных вибрионов, содержащие их гены в составе pre-СТХ, с точки зрения возможности горизонтальной передачи. Наша коллекция насчитывала 26 таких штаммов (18 Ol и 8 не01/не0139), клинических и водных. Присутствие в их геномах рге-СТХ было подтверждено данными молекулярного зондирования и ПЦР. У двух штаммов был также выявлен профаг RS 1. Изменчивость профагов касалась в основном RS-элементов, особенно гена rstR. У меньшей части штаммов удалось определить принадлежность этого гена либо к эльтор, либо к классическому типу, а у одного — присутствие rstR обоих типов. Остальные, возможно, содержали rstR другого типа [Davis В.М. et al., 1999; Mukhopadhyay А. К. et al., 2001]. Результаты ПЦР и блот-гибридизации HindlHи BglII-рестриктов их ДНК с зондами US (содержащим гены orfU, zot и асе) и RS позволили предположить наличие у многих штаммов тан-демной дупликации pre-СТХ, которая является необходимым условием образования репликативных форм (РФ) и фаговых частиц [Davis В.М., Waldor М.К., 2000]. Эта способность была подтверждена в опытах с индукцией митомицином С, причем полученные результаты совпали с данными блот-гибридизации. Один из штаммов продуцировал РФ и вирионы двух фаговpre-СТХф и RSlcp даже в отсутствие какой-либо индукции. Таким образом, большинство выделенных в СНГ штаммов V. cholerae, содержащих рге-СТХ, могут служить источником фаговых частиц, осуществляющих специфическую трансдукцию — «традиционный» путь горизонтальной передачи. Вместе с тем, не только эти, но и все остальные рге-СТХ+ штаммы являются источником генов сер, асе и zot, которые могут быть переданы авирулент-ным штаммам «нетрадиционным» способом, таким как неспецифическая TCP-независимая трансдукция фагами СР-Т1 [Boyd E.F., Waldor М.К., 2000] либо VGJcp [Campos J. et al., 2003]. Не следует также забывать о таком пути генетического обмена, как трансформация, способность к которой у естественно некомпетентных холерных вибрионов может быть обретена в присутствии хитина водных ракообразных [Meibom K.L. et al., 2005].

Кроме описанных выше HA/P, Cef, Zot, Асе и Сер, холерные вибрионы обладают еще целым рядом факторов, роль которых в патогенезе доказана либо только предполагается. Мы провели комплексное определение их генетических детерминант у большого числа музейных и свежевыделенных штаммов различного происхождения.

К вирулентности нехолерогенных штаммов, в т. ч. к реактогенности живых оральных вакцин, причастен комплекс факторов, кодируемый кластером генов RTX, включающим две сцепленные группы противоположно направленных генов: +—rtxA <�—rtxC <�—rtxH и rtxB-+ rtxD—> rtxE—> [Boardman K.B., Fullner Satchell K.J., 2004; Fullner Satchell K.J., 2007]. Собственно токсин, продукт гена rtxA, после детального изучения его структурно-функциональных особенностей группами авторов из США при участии д-ра Fullner (Satchell) K.J. получил название MARTXVc (multifunctional autoproc-essing RTX). Его биологическая активность выражается в способности вызывать округление культивируемых клеток [Lin W. et al., 1999; Fullner K.J., Mekalanos J.J., 2000], снижение трансэпителиального сопротивления tj в монослое Т84 [Fullner K.J.ei al., 2001] и обеспечивать длительную колонизацию тонкого кишечника [Olivier V. et al., 2007, 2009]. В основе этих эффектов лежат происходящие параллельно процессы деполимеризации актина на мономеры и ковалентного связывания последних, что приводит к повреждению цитоскелета эукариотической клетки. За это отвечает актин-связывающий домен ACD, сходный с другим ACD — белка VgrGl V. cholerae (ключевым эффектором системы секреции 6 типа, T6SS), который обладает такой же активностью [Sheanan K.L. et al., 2004] и, возможно, является предшественником ACD-RtxA. Мы провели ПЦР-детекцию последовательностей, кодирующих N-конец RtxA, его ACD, и гена rtxC (предполагаемого активатора RtxA). Подавляющее большинство штаммов содержало все эти последовательности, хотя у некоторых не было выявлено acd-rtxA. Одновременное присутствие детерминант доменов-«двойников» acd-rtxA и acd-vgrGl было присуще меньшинству штаммов, поэтому мы не исключаем, что хотя они и являются эффекторами разных систем секреции, их сосуществование может быть невыгодным для V.cholerae.

К числу факторов патогенности холерных вибрионов некоторые авторы относят нейраминидазу (НАНазу) [Мишанькин Б.Н. и др., 1989; Galen J.E. et al., 1992; Jermin W.S., Boyd E.F., 2002; Миронова Л. В. с соавт., 2004], ген которой (папН) входит в состав острова патогенности VPI-2 [Jermin W.S., Boyd E.F., 2002]. Как и большинство отечественных авторов [Осин A.B. с соавт., 2004; Топорков A.B. с соавт., 2005; Нефедов К. С., 2009 и др.], мы изучали целостность VPI-2 по наличию трех последовательностей — int («левый» краевой ген VC 1758), папН и vce («правый» краевой ген VC 1806). Холерогенные штаммы Ol серогруппы за редким исключением содержали полный VPI-2, как и многие нехолерогенные. Однако для последних более характерным было отсутствие концевой последовательности vce. Меньшая часть штаммов имела делеции различных частей острова. У СТХ+ штаммов Бенгал центральная часть VPI-2 с геном папН была делетирована, что совпадает с литературными данными, тогда как все изученные нетоксигенные, по-видимому, содержали интактный остров. Некоторые штаммы Ol и не01/ не0139 серогрупп имели такие же делеции центральной части острова, как у 0139. Аналогичные результаты были получены Топорковым A.B. с соавт. (2004) при исследовании геномов V. cholerae классического биовара.

Мы также обратили внимание на токсины, гены которых либо встречаются у V. cholerae довольно редко, либо до сих пор не были обнаружены. С помощью дот-гибридизации (но не ПЦР) у целого ряда СТХ" штаммов Ol и не01/не0139 серогрупп нам удалось обнаружить последовательности, гомологичные гену stn/sto термостабильного токсина (ST) — «суперагони-ста» эукариотического гормона гуанилина — активатора гуанилатциклазы (GC-C), необходимого для поддержания гомеостаза в кишечнике [Lucas К.А., et al., 2000; Fasano А., 2002]. Он представляет еще один пример «мимикрии». Используя тот же способ действия, что и гуанилин, ST превышает его по активности в 40 раз, и возросший уровень цГМФ стимулирует секрецию жидкости подобно цАМФ, вызывая тяжелую диарею [Uzzau S., Fasano А., 2000]. Однако, несмотря на то, что среди штаммов, гибридизовавшихся с зондом stn, были выделенные от клинических больных, вопрос о том, способны ли они к продукции полноценного, биологически активного ST, требует дополнительного изучения. Это же относится и к группе штаммов Ol серогруппы — возбудителей вспышки и последующих спорадических случаев заболеваний в Донецке и Мариуполе 1970х годов, у которых опять же с помощью дот-гибридизации были выявлены последовательности, гомологичные гену термостабильного прямого гемолизина (tdh) V. parahaemolyti-cus. В ПЦР этот ген определялся нечетко, непостоянно и не со всеми использованными для его детекции праймерами. Эти результаты оказались неожиданными, поскольку в литературе имеются сведения о редком обнаружении tdh только у штаммов не01/не0139 серогрупп [Yoh М. et al., 1986; Terai А. et.al., 1991]. Однако среди изученных нами штаммов V. cholerae non01/non0139 не было ни одного, гибридизовавшегося с зондом tdh. Что касается Донецких штаммов, то все они представляли один и тот же клон, и в пользу возможной экспрессии ими TDH свидетельствует лишь то, что вспышка протекала по типу пищевой токсикоинфекции, что характерно для V.parahatmolyticus. И все же вопрос о реальной продукции ими данного токсина требует отдельного исследования. Ни у одного из штаммов не было выявлено генов TDH-родственного гемолизина (trh) и шигаподобного токсина (sltl). По-видимому, они вообще не встречаются у V. cholerae, поскольку ген trh не был выявлен у них и другими авторами и не связан с типичными мобильными элементами [Kishishita М. et al., 1992; Yamamoto К. et al., 1992], а слабая продукция токсина, близкого Sltl, была выявлена исключительно серологическими методами [O'Brien A.D. et al., 1984].

В начале наших исследований, когда геном холерных вибрионов еще не был расшифрован полностью, наше внимание привлек ряд работ под руководством д-ра Sanyal S.C. (1983;1996), в которых был описан диарееген-ный фактор, названный авторами NCT (new cholera toxin). Мы полагали, что некоторые ctxAB' штаммы, выделенные в бывших республиках СССР от больных с признаками типичной холеры, могли быть способны к продукции этого токсина, и попытались определить свойства секретируемых токсических субстанций двух таких штаммов. Действительно, препараты-сырцы, полученные осаждением сульфатом аммония как описано Saha S., Sanyal S.C. (1990), вызывали повышение кожной проницаемости в пробе Крейга, отек лапок белых мышей, энтеропатогенный эффект на модели кроликов-сосунков и два типа реакции клеток СНО — округление в присутствии низких разведений препарата и удлинение в более высоких. Фракционирование с помощью колоночной хроматографии позволило разделить «округляющую» и «удлиняющую» фракции. По всей видимости, цитотоксический компонент был представлен в основном НА/Р (возможно, с примесью других протеаз), а цитотонический — Cef, поскольку соответствующие фракции расщепляли белки молока и трибутирин соответственно. Эти факторы могли быть и причиной энтеропатогенного эффекта у кроликов-сосунков, впрочем, как и другие, такие как MARTX и, возможно, ST, гены которых содержали оба штамма, использованные для получения препаратов. Анализ литературных и собственных данных привел нас к заключению, что NCT не является самостоятельным токсином, а представляет варьирующую по качественному и количественному составу смесь нескольких факторов. В первую очередь это вытекает из того факта, что описавшие его авторы работали фактически с тотальной смесью белков, осажденных из культураль-ных жидкостей сульфатом аммония. Этот же препарат был использован ими и для получения сывороток к NCT, которые, естественно, реагировали со всеми штаммами холерных вибрионов независимо от холерогенности, серо-группы и происхождения, как и сыворотки, полученные нами к препарату-сырцу на первом этапе. В дальнейшем мы показали с помощью ПЦР, что положительная реакция не зависела и от генотипов.

Еще один токсин с неизвестными генетическими детерминантами, novel toxin, или W07 (по названию клинического СТХ" штамма V. cholerae Ol, из которого он был получен), был описан Walia К. et al. (1999) как термолабильный белок, состоящий из двух субъединиц с ММ 58 и 40 кДа, каждая из которых имела уникальную N-концевую последовательность. W07 вызывал удлинение клеток СНО и накопление жидкости в петлях кишечника кролика, причем был в 10 раз активнее, чем СТ. Он был способен связываться с GMb и авторы предположили, что GMi может служить ему рецептором. Токсин вызывал значительное увеличение содержания в клетках ионов кальция и секрецию ионов хлора, повышение уровней цАМФ и проте-инкиназы А, а также гибель клеток кишечной ткани [Walia К. et al., 1999; Bhattacharyya S. et al., 2004a, bWalia K., Ganguly N.K., 2010]. По мнению авторов, W07, несмотря на явное отличие от СТ, является его функциональным гомологом и одним из ключевых факторов в развитии холеропо-добной симтоматики. Несмотря на то, что с момента описания этого токсина прошло более 10 лет, на сегодняшний день он обнаружен всего у одного штамма, и распространение его среди V. cholerae неизвестно. Как ни странно, авторы, которые получили высокоочищенные препараты W07 и сыворотки к ним, даже не попытались определить способность других штаммов V. cholerae к его продукции хотя бы иммунологическими методами. Во всех работах упоминается единственный штамм-продуцент, но при этом говорится о важности изучения W07 для разработки способов терапии и профилактики заболеваний, вызываемых новыми эпидемическими (!) штаммами [Bhattacharyya S. et al., 2004Ь]. Мы провели поиск в базах GenBank АК последовательностей, гомологичных N-концам обеих субъединиц W07, приведенных Walia К. et al. (1999) и нашли всего одно существенное совпадение для N-конца 58 кДА субъединицы с белком наружной мембраны OmpU V. cholerae (Р97 085). Однако OmpU имеет намного меньшую ММ (34,65 кДа), относится к классу поринов, связан с клеткой, известен как фактор колонизации и персистенции [Chakrabarti S.R. et al., 1996; Sperandio V. et al., 1996; Simonet V.C. et al., 2003; Duret G., Delcour A.H., 2010], и для него не описаны свойства, характерные для W07, кроме способности агглютинировать эритроциты кролика [Chakrabarti S.R. et al., 1996], но эта ге-магглютинация, в отличие от обусловленной W07, ингибируется моносаха-рами. Нами также не было выявлено сходства этих последовательностей с N-концами известных токсинов V.cholerae. Поэтому, не имея в распоряжении ни штамма W07, ни препарата, на данном этапе мы не можем ответить на вопрос о том, является ли W07 действительно уникальным «редким» токсином либо еще одной «мистификацией» наподобие NMDCY и NCT.

Кроме токсических субстанций, важнейшая роль в патогенности холерных вибрионов принадлежит факторам адгезии, обеспечивающим колонизацию тонкого кишечника. К ним относится целый ряд связанных с клеткой пилинов/гемагглютининов: Сер, TCP, маннозочувствительные пили (MSHA), белки наружной мембраны Отр и др. [Kaper J.B. et al., 1995]. Их специальное изучение не входило в цели настоящей работы, но для более полной характеристики исследуемых штаммов при генотипировании мы определяли наличие гена tcpA, входящего в состав острова VPI, и mshAгена структурной единицы MSHA в составе m. s/7-кластера, обозначаемого некоторыми авторами также как «остров персистенции» (EPI) [Marsh J.W., Taylor R.K., 1999; Смирнова Н. И., Лозовский Ю. В., 2003; Костромитина Е. А., 2004; Кутырев В. В. с соавт., 2006; Нефедов К. С., 2009]. TCP считаются главным фактором колонизации, a MSHA связывают в основном с перси-стенцией в водоемах за счет формирования биопленок [Watnick P.I. et al., 1999; Chiavelli D.A. et ah, 2001]. Результаты определения гена tcpA с помощью молекулярного зондирования и ПЦР показали, что лишь небольшая часть ctxAB' штаммов V. cholerae различных серогрупп содержала этот ген. У tcpA+ штаммов всегда выявлялся и другой ген VPI, toxT, что свидетельствовало в пользу присутствия у них данного острова. Сам ген tcpA у большинства штаммов находился в виде аллеля tcpAeh. Аллель tcpAclass был выявлен лишь у единичных штаммов. У ряда рге-СТХ+ штаммов ген tcpA не амплифицировался в ПЦР несмотря на положительные результаты гибридизации, что указывает на принадлежность его к другому (им) типу. Аналогичные данные по вибрионам не01/не0139 серогрупп были недавно получены Фадеевой A.B. с соавт. (2011). Кроме того, у четырех рге-СТХ+ штаммов не01/не0139 серогрупп (включая 2 tcpAclass+) не удалось амплифициро-вать ген toxT. Возможно, их у них произошла делеция части острова. Ген mshA содержали все без исключения исследованные CTX+VPI+ штаммы Ol и Ol39 серогрупп, большинство нехолерогенных VPI+ и VPI" штаммов Ol серогруппы, но меньшинство представителей не01/не0139 серогрупп и ни один из водных штаммов Бенгал. Если среди mshA~ V. cholerae Ol преобладали штаммы, выделенные из внешней среды, то к группе mshA~ V. cholerae nonOl/ non0139 относилось большое число клинических штаммов. Отсутствие гена mshA у многих штаммов, циркулирующих в открытых водоемах, свидетельствует о том, что пили MSHA, хотя и считаются существенными факторами персистенции, могут быть заменены другими адгезинами. Следует отметить, что у всех включенных в данное исследование штаммов были выявлены гены хромосомного локуса Vps (vpsA, vpsL), также играющего существенную роль в образовании биопленок [Yildiz F.H., Schoolnik G.K.,.

1999]. Еще одной важной функцией пилей MSHA является их способность служить рецептором для адсорбции фага VGJq>, переносящего СТХф и RSltp с более высокой частотой, чем при их собственной ТСР-зависимой трансдукции [Campos J. et al., 2003]. Поэтому СТХ~рге-СТХ~~УРГ#2.$Ы+ штаммы V. cholerae могут рассматриваться наряду с VPI+ штаммами как потенциальные реципиенты генов факторов патогенности.

В настоящее время способность TCP служить рецептором для СТХф общеизвестна [Faruque, S.M., Mekalanos J.J., 2003]. Однако их наличие является необходимым, но не достаточным условием эффективного проникновения фага в бактериальную клетку, для этого необходимы также продукты генов toZ-кластера (TolQRA) [Heilpern A.J., Waldor М.К., 2000]. Они способны обеспечивать горизонтальную передачу СТХф даже в отсутствие TCP, хотя вероятность такого события довольно низка. Среди изученных нами нескольких сотен штаммов V. cholerae различных серогрупп не было обнаружено ни одного лишенного генов tolQRA. Это вполне объяснимо с точки зрения показанного Heilpern A.J., Waldor М.К. (2000) участия их продуктов в поддержании целостности наружной бактериальной мембраны. Отсутствие экспрессии любого из этих генов приводит к резкому снижению жизнеспособности, и такие штаммы, по-видимому, не могут выдержать давления отбора. Таким образом, СТХ’ТСР" штаммы могут использовать по меньшей мере два «запасных» пути приобретения профага СТХ — за счет TolQRA [Heilpern A.J., Waldor М.К., 2000] и пилей MSHA [Campos J. et al., 2003], a представители Ol серогруппы располагают еще и третьим путем — за счет трансдукции СТХ фагом СР-Т1, рецептором которому служит 01-антиген [Boyd E.F., Waldor М.К., 1999].

Особое значение во взаимоотношениях бактерий с организмом хозяина имеют специализированные системы секреции (SS) токсических субстанций (эффекторов), участвующих в патогенезе. У грамнегативных бактерий известно 6 типов систем секреции (T1SS — T6SS) [Заднова С.П., Лозовский Ю. В., 2005; Yahr T.L., 2006], возможно, на самом деле их как минимум 8 [Desvaux М. et al., 2009]. Большинство растворимых белков V. cholerae секретируются через T2SS, некоторые — через T1SS. Эти SS обеспечивают выход токсинов во внеклеточное пространство, но никак не влияют на их взаимодействие с клеткой-мишенью. Недавно у отдельных штаммов не01/не0139 серогрупп было установлено наличие двух контакт-зависимых SS — третьего (T3SS) [Dziejman М. et al., 2005; Chen Y. et al., 2007] и шестого (T6SS) [Pukatzki S. et al., 2006] типов. Обе состоят из комплекса белков-транслоконов, напоминающего иглу, через которую эффекторы транслоцируются из клетки возбудителя в клетку хозяина минуя внеклеточное пространство, что защищает антигены от действия защитных сил макроорганизма. Вместе с тем, T3SS и T6SS кодируются разными кластерами генов и имеют разные транслоконы и эффекторы. Поскольку данные о распространении этих двух SS среди холерных вибрионов были весьма немногочисленны, мы провели ПЦР-детекцию отдельных генов, выбранных в качестве маркерных, у 320 штаммов различных серогрупп. Маркерами vsc-кластера (T3SS) служили гены vcsN2, vcsV2, vscC2 и vspD. ПЦР-скрининг подтвердил имеющиеся в литературе [Ерошенко Г. А. с соавт., 2008] данные о том, что у V. cholerae присутствуют либо все 4 искомых гена, либо ни одного из них, что свидетельствует в пользу целостности vcs-кластера как генетической единицы. Он был выявлен примерно у половины штаммов не только не01/не0139, но и 01 серогруппы (последнее установлено нами впервые). Практически все СТХ+ вибрионы были лишены генов T3SS. В группе рге-СТХ+ штаммов были как T3SS+, так и T3SS", а среди клинических СТХ" /рге-СТХ" штаммов 01 и не01/не0139 серогрупп преобладали T3SS+. К их числу относились CTX~VPI+ штаммы клона 01 серогруппы, вызвавшего эпидосложнения в Ростовской области в 2005 г., а также СТХ~ VPI" штаммы-возбудители ОКИ в Донецке и Мариуполе (1971;1973). Среди штаммов, выделенных из внешней среды в отсутствие эпидосложнений, гены vcs были обнаружены у меньшей половины представителей 01 и не01/ не0139 серогрупп и ни у одного из водных штаммов 0139 серогруппы.

Для определения наличия уда-кластера (T6SS) мы использовали в качестве маркерных 4 гена — vasA, vasF, vasK и vgrG3 (его 3 '-концевую последовательность, кодирующую пептидогликан-связывающий домен PBD). Также определяли наличие генов hep и последовательности, кодирующей ключевой эффектор T6SS ACD-VgrGl, локализованных за пределами кластера. В отличие от генов T3SS, все 3 гена vas и hep присутствовали у 100% изученных штаммов, однако acd-vgrGln интактная последовательность pbd-vgrG3 у многих штаммов не были обнаружены. Отсутствие генетических детерминант одного или обоих активных доменов (особенно ACD-vgrGl) могло ограничить либо полностью исключить экспрессию T6SS.

Для изучения экспрессии T6SS у V. cholerae Pukatski et al. (2006) был использован штамм амебы Dictyostelium discoideum — своеобразная модель макрофагов. Эта амеба, передвигаясь по поверхности агара и питаясь бактериями, образует зоны просветления (бляшки) в газоне штаммов, не экспрес-сирующих T6SS, а экспрессирующие ее убивают амебу, и бляшки не образуются. Эта же модель оказалась адекватной для изучения экспрессии T3SS Pseudomonas aeruginosa [Pukatzki S. et al., 2002], а все опубликованные до настоящего времени экспериментальные данные о механизмах устойчивости V. cholerae к D. discoideum были получены с использованием всего одного штамма 037 серогруппы, лишенного T3SS [Pukatzki S. et al., 2006; Miyata S.T. et al., 2011]. Поэтому вопрос о том, может ли устойчивость V. cholerae к поеданию амебой проявляться за счет T3SS, остался открытым. Мы использовали эту модель для определения Dictyo-фенотипов 152 штаммов с различными генотипами (СТХ, VPI, T3SS, acd-vgrGl, pbd-vgrG3). Сравнительный анализ полученных результатов позволил установить интересные корреляции. Среди изученных нами СТХ+ штаммов ни один не обладал устойчивостью (Ою1уок-фенотипом) несмотря на наличие у них всех генов T6SS. Чувствительность к поеданию амебой СТХ" штаммов никак не зависела от присутствия генов T3SS, т. е. они либо не экспрессируются в данных условиях эксперимента, либо у V. cholerae, в отличие от Pseudomonas [Pukatzki S. et al., 2002], T3SS не является фактором антагонистической активности по отношению к простейшим, как предполагали Dziejman M. et al. (2005). Вероятнее всего, эта S S служит для колонизации кишечника, особенно у штаммов, не образующих TCP. Эта ее способность обусловлена активностью эффекторов — нуклеаторов актина VopF (либо его гомолога VopN), VopE [Tarn V.C. et al., 2007, 2010], a также, возможно, еще 11−15 эффекторов, гены которых входят в состав кластера T3SS [Alam A. et al., 2011], и двух эффекторов (McfV и TcdB), гены которых локализованы в других участках генома [Shin O.S. et al., 2011]. VopF содержит 3 домена, вызывающих нуклеацию и полимеризацию актина и сходных с эукариотическими нук-леаторами формином и «Spire», участвующими в поддержании полярности и подвижности клеток, цитокинеза и эндоцитоза [Tarn V.C. et al., 2007]. Это еще один пример использования «мимикрии» холерными вибрионами. Таким образом, модель D. discoideum позволяла достоверно оценить функционирование T6SS, но не T3SS. Ою1уок-фенотипом обладали всего 27 штамс мов 01серогруппы, все остальные были чувствительны (Dictyo). При этом оказалось, что все DictyoR штаммы содержали не только acd-vgrGl, но и гены VPI tcpA и toxT. Все WYacd-vgrG 1 pbd-vgrG3 штаммы имели Dictyo фенотип. Нам не удалось оценить значимости PBD-домена, поскольку все без исключения DictyoR штаммы содержали pbd-vgrG3. Причины такой строгой корреляции неизвестны. Принимая во внимание тот факт, что ак-тин-связывающая активность VgrGl Т6 S Sзависима и проявляется только при эндоцитозе бактерий клетками-мишенями [Ma А.Т. et al., 2009], можно допустить, что определенную роль во взаимодействии с клетками амебы могут играть TCP. Однако у вибрионов эльтор они практически не образуются вне кишечника теплокровного хозяина [Waldor М.К., Mekalanos J.J., 1996]. Предстоит еще выяснить, может ли их синтез индуцироваться в присутствии амебы. С другой стороны, VPI содержит несколько генов, функции которых до сих пор не установлены.

Интересно также, что в большинстве случаев T3SS+ штаммы не содержали детерминант ключевого эффектора T6SS ACD-VgrGl, а большинство T3SS" штаммов — содержали. Это наводит на мысль о том, что для реализации стратегии контакт-зависимой вирулентности in vivo холерным вибрионам достаточно экспрессии одной из двух описанных SS, тогда как поддержание активности обеих одновременно, возможно, для них невыгодно. Не исключено, что данная стратегия вообще не используется штаммами, продуцирующими СТ, и присутствие у них генов vas, hep, pbd-vgrG3 и aed-vgrGl является своего рода «рудиментом». С другой стороны, штамм V. cholerae O37 V52, экспрессирующий T6SS [Pukatzki M. et al., 2006; Ma A.T. et al., 2009], является СТХ-позитивным [Boyd E.F. et al., 2000]. Кроме того, у двух эпидемических штаммов OI серогруппы была выявлена продукция Hep in vitro, которая зависела от целого ряда регуляторных белков, в т. ч. регуляторов «чувства кворума» HapR и LuxO [Ishkawa T. et al., 2009; Zheng J. et al., 2010]. Было показано, что у штамма С6706 экспрессия T6SS репрессирована совместно LuxO и глобальным регулятором TsrA [Zheng J. et al., 2010]. Делеции генов этих репрессоров приводили к полному восстановлению способности T6SS транслоцировать VgrGl в макрофаги, однако ее диареегенное действие in vivo было изучено с использованием делецион-ного мутанта ActxAB-fla-tsrA, поэтому на основе полученных данных нельзя судить о том, причастна ли она к вирулентности исходного ctxAB+ штамма.

Итак, мы установили возможность участия отдельных факторов в реализации холерными вибрионами стратегии вирулентности. Однако наибольший интерес представлял вопрос о том, каким (ими) из них обусловлена реальная опасность ctxAB' штаммов возбудителя. В целях приближения к ответу на этот вопрос мы выборочно провели изучение фенотипического проявления вирулентности рядом нехолерогенных штаммов V. cholerae с различными генотипическими характеристиками in vitro и in vivo. По результатам ПЦР и молекулярного зондирования все без исключения взятые в это исследование штаммы содержали гены toxR, attRS, tolQRA, rtxA, rtxC, hap A, hapR, cef, hlyA, T6SS (vas A, vasK, vasF, hep), vpsA, vpsL и не содержали sitia trh. По присутствию/отсутствию pre-CTX, VPI и VPI-2, T3SS, активных доменов T6SS (acd-vgrGl и pbd-vgrG3), а также генов mshA, stn/sto и tdh имелись межштаммовые различия.

Для определения активности секретируемых факторов использовали супернатанты бульонных культур, выращенных с шуттелированием (т.е. в условиях, исключающих синтез HlyA). Супернатанты вызывали различные изменения в культурах клеток СНО и L-929. Большинство вызывало округление клеток, возможно, за счет действия НА/Р, других протеаз и/или RtxA, некоторые — удлинение, что было связано, по-видимому, с активностью Cef, либо оказывали цитодеструктивное действие. Все супернатанты вызывали повышение кожной проницаемости в пробе Крейга, и только один (рге-СТХ+) инициировал некроз. Именно этот супернатант обусловливал гибель и деструкцию культивируемых клеток. Ранее точно такие же эффекты были отмечены Помухиной О. И. (1990) при изучении препаратов т.н. дермонек-ротического фактора (ДНФ). Полученные данные указывали на то, что ctxAB' штаммы V. cholerae независимо от их генотипов варьируют по уровням продукции различных факторов. Тем не менее, эти уровни могут существенно различаться в условиях in vitro и in vivo. Поэтому следующим этапом работы явилось изучение эффектов, вызываемых живыми культурами в организме чувствительных животных.

Для изучения вирулентности на модели кроликов-сосунков было отобрано 39 ctxAB' штаммов V. cholerae OI и не01/не0139, для сравнения использовали 11 СТХ+ штаммов различных серогрупп. Все СТХ+ штаммы 01/ 0139, содержащие также VPI, вызывали гибель почти всех зараженных крольчат с развитием выраженного холерогенного (ХГ) эффекта, тогда как представители не01/не0139 серогрупп вызывали ХГ эффект только у части зараженных животных, а у другой части наблюдался энтеропатогенный (ЭП) эффект. Холерогенные штаммы 0139 и не01/не0139, в отличие от 01, оказались способными к диссеминации в другие органы и ткани. Нехолерогенные штаммы были разделены на три группы. Один штамм, выделенный из морской воды, не вызывал гибели животных и изменений в кишечнике, т. е. был абсолютно авирулентным. Большинство штаммов вызывали гибель части зараженных животных на 2−3 сутки при развитии у них выраженного ЭП эффекта с интенсивным размножением вибрионов в кишечнике, а более половины их были способны к диссеминации. Наконец, штаммы, отнесенные к третьей группе, занимали промежуточное положение между ХГ и ЭП штаммами: у части животных они вызывали эффект, сходный с ХГ (СХГ), т. е. накопление больших количеств полупрозрачной опалесцирующей жидкости, у другой части — выраженный ЭП. Супернатанты содержимого кишечника кроликов, зараженных некоторыми штаммами, лизировали эритроциты барана, что свидетельствовало о продукции HlyA. Однако ни один из эффектов строго не коррелировал с наличием у исследуемых штаммов определенных генетических детерминант. Например, авирулентный для сосунков штамм Р-9337 имел такой же генотип, как высоковирулентный 14 863. Кроме того, оба обладали одинаковой протеолитической, твиназной и гемолитической активностью, их супернатанты оказывали одинаковое действие в пробе Крейга, хотя на модели культур клеток первый вызывал их округление, а второй — удлинение. Напротив, штаммы, различающиеся по генотипам, вызывали практически одни и те же эффекты. Очевидно, различные факторы патогенности являются «взаимозаменяемыми», т. е. отсутствие одних компенсируется повышенной продукцией других, результатом чего является развитие заболевания. Для проверки этого предположения мы провели электронно-микроскопическое изучение тонкого кишечника кроликов-сосунков, зараженных несколькими штаммами V.cholerae.

Ультраструктурные изменения, вызываемые СТХ+ штаммами V. cholerae, практически не отличались от описанных в литературе [Авакян A.A. с соавт., 1972; Бардахчьян Э. А. с соавт., 2001; Mathan М.М., 1995, 2009; Quadri F. et al., 2004]: клетки кишечника погибали в основном в результате гидропической и баллонной дистрофии.

После заражения сосунков нехолерогенным штаммом 01 серогруппы 14 863 вибрионы выявлялись не только в просвете кишки, но и в строме ворсин, и даже проникали в подслизистый слой. В результате в эпителии возникали необратимые дистрофические повреждения и некроз. Происходила деструкция микроворсинок, клазматоз и слущивание отдельных клеток, разрушение их мембран, набухание митохондрий, расширение эндо-плазматического ретикулума, активация лизосомального аппарата. В ЕС-клетках была заметна дегрануляция. Интересным свойством изучаемого штамма является способность вызывать апоптоз лимфоцитов, следствием которого могут быть серьезные нарушения иммунного статуса. На фоне диарейного синдрома происходили выраженные изменения микроциркуляции: образование тромбов в просвете капилляров, усиление микропиноци-тоза, вакуолизация цитоплазмы эндотелиоцитов, локальные очаги деструкции их мембраны. Экстравазальные нарушения характеризовались выходом жидкой части крови, фибрина и форменных элементов в интерстициальное пространство. Это указывает на способность некоторых ctxAB' штаммов к активной продукции факторов, которые и в отсутствие СТ могут обусловливать тяжелые диарейные заболевания. Однако эта способность зависит, вероятно, от уровней экспрессии тех или иных факторов. Другой штамм (Р-9337), имеющий идентичный набор генов, но абсолютно авирулентный, не вызывал и каких-либо серьезных ультраструктурных повреждений.

При заражении нехолерогенным штаммом 013 серогруппы, вызывающим ЭП эффект и неспособным к диссеминации, в первую очередь обращало на себя внимание образование лакун по ходу границы между смежными эпителиоцитами, аналогичное наблюдаемому под действием препарата НА/Р. Вакуолизация цитоплазмы была выражена значительно слабее, чем при заражении холерогенным штаммом не01/не0139 серогруппы. Однако в 2011 г. Shin et al. показали способность другого ctxAB’tcpA' штамма (039 серогруппы) обусловливать за счет экспрессии T3SS точно такую же гидропическую дистрофию, как изученный нами ctxAB+tcpA+T3SS" штамм.

Результаты изучения ультраструктурных изменений подтвердили наше предположение о «взаимозаменяемости» различных факторов патоген-ности ctxAB' вибрионов. Штамм V. cholerae 01 не содержал генов рге-СТХ, VPI, acd-vgrGl, pbd-vgrG3, но содержал гены T3SS и папН. Несмотря на отсутствие у него TCP, он обладал высокой колонизирующей способностью и даже инвазивностью. Возможно, она была обусловлена экспрессией T3SS in vivo (т.к. T6SS без активных доменов вряд ли могла сохранить функциональность), хотя мы не исключаем участия других факторов, таких как RtxA и HlyA [Olivier V. et al., 2007, 2009], тем более что гемолизин присутствовал в содержимом кишечника половины зараженных животных, а также MSHA [Dalsgaard A. et al., 1995а]. Однако в пользу экспрессии T3SS свидетельствует и незавершенный фагоцитоз вибрионов макрофагами, и гибель лимфоцитов и эпителиоцитов [Tarn V.C. et al., 2007]. Штамм не01/не0139 серогруппы неинвазивен, но вызывает выраженный ЭП эффект. Если он образует TCP и/или Сер, то экспрессия T3SS, генами которой он также обладает, может не происходить или быть пониженной. T6SS лишена ACD-VgrGl, но имеет PBD-VgrG3, поэтому остается вероятность транслокации каких-то других, еще неидентифицированных эффекторов. В развитии диареи могут принимать участие порообразователь Асе и модулятор актина Zot, отсутствующие у штамма 14 863. Уровни эспрессии генов, общих для обоих штаммов (rtxA, cef, hapA, hlyA и, возможно, stn/sto) также могут быть разными. Например, образование лакун между смежными эпи-телиоцитами в кишечнике животных, зараженных штаммом 013 серогруппы, наводит на мысль о преобладании НА/Р, а признаки быстрого обезвоживания под действием штамма OI серогруппы — о повышенной продукции Cef. Сходные повреждения клеточных органелл и капилляров, вызванные обоими штаммами, могут быть следствием активности общих либо различных токсических субстанций. Некоторые из эффектов имеют сходство с таковыми, вызываемыми СТХ+ штаммами (вакуолизация цитоплазмы, разрушение органелл, набухание и конденсация митохондрий, образование миелиноподобных фигур, реакции бокаловидных, тучных и ЕС клеток, повышение сосудистой проницаемости). Это обстоятельство указывает на то, что в отдельных случаях даже холероген вполне заменим теми или иными дополнительными факторами. Очевидно, эти случаи относятся большей частью к ослабленным людям с пониженной сопротивляемостью инфекциям в силу неблагоприятных экологических условий, возрастных особенностей либо наличия хронических соматических заболеваний.

Какими бы тяжелыми ни были симптомы, вызываемые сЯсАВ' штаммами, распространение инфекции обычно не принимает эпидемического характера. Вместе с тем, в последние 2 десятилетия в литературе регулярно появляются сообщения как о множественных спорадических случаях, привязанных к конкретной территории, так и о довольно крупных вспышках, этиологическими агентами которых являются такие штаммы (таблица 20).