Фолдинг лиганд-связывающих белков периплазмы бактерий.
Роль лигандов в стабилизации их структуры
Несмотря на сходство структуры глутамин-связывающего белка и D-галакгозаЛЭ-глюкоза-связывающего белка, характер процессов разворачивания этих белков существенно различается: разворачивание О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка осуществляется по принципу «все или ничего», при разворачивании глутамин-связывающего белка образуется два промежуточных частично-свернутых состояния. Одно из этих… Читать ещё >
Содержание
- СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
- Актуальность исследования
- Цель и задачи исследования
- Основные положения, выносимые на защиту
- Научная новизна исследований
- Теоретическое и практическое значение работы
- ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
- 1. 1. Современные представления о фолдинге белков
- 1. 1. 1. Сворачивание белков в клетке
- 1. 1. 2. Модель энергетической воронки. Роль внутри- и межмолекулярных взаимодействий в фолдинге и нарушении фолдинга белков
- 1. 2. Периплазматические лиганд-связывающие белки
- 1. 2. 1. И-галактоза/О-глюкоза-связывающий белок из Escherichia col
- 1. 2. 1. 1. Структура GGBP и его комплекса с О-глюкозойЛЗ-галактозой
- 1. 2. 1. 2. Спектральные свойства GGBP и GGBP/Glc
- 1. 2. 1. 3. Тепловая денатурация GGBP. Роль лигандов — D-глюкозы и иона кальция — в стабилизации структуры белка
- 1. 2. 2. Глутамин связывающий белок из Escherichia col
- 1. 2. 2. 1. Структура GlnBP в свободном состоянии и в комплексе с Gin
- 1. 2. 2. 2. Спектральные свойства GlnBP и GlnBP/Gln
- 1. 2. 2. 3. Изучение структуры и стабильности GlnBP и комплекса GlnBP/Gln при тепловой денатурации
- 1. 2. 1. И-галактоза/О-глюкоза-связывающий белок из Escherichia col
- 1. 1. Современные представления о фолдинге белков
- 2. 1. Материалы
- 2. 2. Методы
- 2. 2. 1. Анализ свойств микроокружения и особенностей локализации триптофановых и тирозиновых остатков
- 2. 2. 2. Фпуорещентные измерения
- 2. 2. 3. Регистрация и анализ кривых затухания флуоресценции
- 2. 2. 4. Круговой дихроизм
- 2. 2. 5. Измерение равновесных кривых денатурации
- 2. 2. 6. Измерение кинетических кривых разворачивания-сворачивания белков
- 2. 2. 7. Анализ экспериментальных данных о процессе сворачивания-разворачивания белков с использованием параметрического представления двух независимых экстенсивных характеристик системы
- 2. 2. 8. Расчет констант скоростей процессов сворачивания-разворачивания
- 2. 2. 9. Расчет термодинамических параметров
- 3. 1. Процессы сворачивания-разворачивания GGBP и его комплекса GGBP/Glc
- 3. 1. 1. Анализ микроокружения триптофановых и тирозиновых остатков GGBP в отсутствие и в присутствии лиганда
- 3. 1. 2. Триптофановая флуоресценция GGBP и его комплекса с D-глюкозой в нашивном и полностью развернутом состоянии
- 3. 1. 3. Разворачивание GGBP и GGBP/Glc под действием GdnHCl
- 3. 1. 4. Ренатурация GGBP
- 3. 1. 5. Тепловая денатурация GGBP и GGBP/Glc
- 3. 1. 6. Отщепление иона кальция
- 3. 2. Процессы сворачивания-разворачивания GlnBP и его комплекса GlnBP/Gln
- 3. 2. 1. Триптофановая флуоресценция GlnBP и его комплекса с Gin в нашивном и полностью развернутом состояниях
- 3. 2. 2. Характеристика микроокружения триптофановых остатков GlnBP
- 3. 2. 3. Флуоресцентные свойства и характеристика микроокружения триптофановых остатков комплекса GlnBP/Gln
- 3. 2. 4. Тирозиновая флуоресценция GlnBP
- 3. 2. 5. Зависимость триптофановой флуоресценции GlnBP от длины волны возбуждения. 3.2.5. Разворачивание GlnBP и GlnBP/Gln под действием GdnHCl. Равновесные зависимости
- 3. 2. 6. Кинетика разворачивания GlnBP под действием GdnHCl
- 3. 2. 7. Параметрическое представление процессов разворачивания GlnBP
- 3. 2. 8. Ренатурация GlnBP
- 3. 2. 9. Тепловая денатурация GlnBP и комплекса GlnBP/Gln. Стабилизация структуры GlnBP при взаимодействии с лигандом
- 3. 3. Сравнение характера процессов разворачивания-сворачивания GGBP с GlnBP
Фолдинг лиганд-связывающих белков периплазмы бактерий. Роль лигандов в стабилизации их структуры (реферат, курсовая, диплом, контрольная)
Процессы разворачивания-сворачиваиия белков, их устойчивость к действию химических денатураптов и нагреванию, структура и механизмы образования частично-свернутых форм белков являются в настоящее время предметом интенсивных исследований, проводимых многими научными коллективами мира. Актуальность этих исследований обусловлена как их значимостью для решения фундаментальной проблемы фолдипга белков, так и тем обстоятельством, что ассоциация макромолекул белков в денатурированных частично-свернутых состояниях представляет существенную проблему для медицины (Harper, Lansbury, 1997; Carrell, Gooptu, 1998; Fink,. 1998; Uversky et al., 1999aUversky et al., 1999bSelkoe, 2003) и биотехнологии (Wetzel, 1994; Speed et al., 1996; Fink, 1998). Специфическая ассоциация, приводящая к образованию амилоидных фибрилл, сопутствует ряду тяжких заболеваний (так называемых «конформационных болезней»), таких как нейродегенеративные болезни Альцгеймера и Паркинсона, злокачественная миелома, прионные заболевания, а образование аморфных агрегатов при синтезе рекомбинантных белков, приводящее к возникновению белковых преципитатов, является наиболее существенным препятствием при получении нативных рекомбинантных белков.
К настоящему времени хорошо охарактеризованы процессы фолдинга-рефолдинга небольших мономерных белков. Фолдинг мультидоменных и олигомерных белков, а также белков, содержащих в своем составе лиганды, изучен в значительно меньшей степени. В связи с этим значительный интерес представляет исследование фолдинга белков, принадлежащих к большому классу периплазматических лиганд-связывающих белков, участвующих в процессах активного транспорта различных биологически-активных веществ (углеводов, аминокислот, анионов, ионов металлов, дипептидов и олигопептидов), процессах хемотаксиса и кооперативной чувствительности (quorum sensing) бактерий. В настоящей работе объектами исследования стали глутамин-связывающий белок и D-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающий белок из Escherichia coli. Связывание этих белков с их лигандами (глутамином и сахарами) приводит к большим структурным изменениям третичной структуры белка, что делает возможным использование этих белков при конструировании социально значимых биосенсоров для определения содержания глутамина и Сахаров. Последнее имеет важное практическое значение для биотехнологии (определение уровня глутамина в клеточных культурахDattelbaum, Lakowicz, 2001) и медицинской биохимии (неинвазивное определение уровня сахара в крови диабетических больныхStaiano et al., 2004). Поскольку при использовании лиганд-связывающих белков в качестве чувствительного элемента биосенсоров важно использовать такие формы белков, которые отличаются высоким уровнем устойчивости к агрессивному действию окружающей среды, немаловажным является изучение стабильности этих белков.
Цель и задачи исследования
.
Цель работы состояла в изучении процессов сворачивания-разворачивания глутамин-связывающего белка и О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка. В задачи работы входило:
1. Изучение процессов денатурации глутамин-связывающего белка и D-галактоза/Б-глюкоза-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида (GdnHCl);
2. Определение количества промежуточных состояний, возникающих в процессе денатурации глутамин-связывающего белка и О-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающего белка и изучение свойств этих промежуточных состояний;
3. Выяснение, является ли денатурация глутамин-связывающего белка и D-галактоза/Е)-глюкоза-связывающего белка под действием GdnHCl обратимой;
4. Исследование роли лигандов — глутамина, в случае глутамин-связывающего белка, и D-глюкозы и иона кальция, в случае О-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающего белка — в стабилизации структуры этих белков к денатурирующему действию GdnHCl и нагревания.
Основные положения, выносимые па защиту.
1. Связывание лиганда стабилизирует структуру лиганд-связывающих белков и делает процесс их разворачивания более кооперативным, однако не влияет на путь разворачивания белка и число возникающих при этом промежуточных состояний.
2. Несмотря на сходство структуры глутамин-связывающего белка и D-галакгозаЛЭ-глюкоза-связывающего белка, характер процессов разворачивания этих белков существенно различается: разворачивание О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка осуществляется по принципу «все или ничего», при разворачивании глутамин-связывающего белка образуется два промежуточных частично-свернутых состояния. Одно из этих состояний является состоянием типа расплавленной глобулы, его возникновение сопровождается ассоциацией молекул глутамин-связывающего белка.
3. Хотя связывание лиганда вызывает существенные преобразования структуры лиганд-связывающих белков, их флуоресцентные характеристики изменяются при этом незначительно.
Научная новизна исследований.
Результаты исследования процессов разворачивания—сворачивания глутамин-связывающего белка и О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка, получены впервые. Впервые установлено трехстадийное, но обратимое разворачивание глутамин-связывающего белка и одностадийное, обратимое разворачивание D-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка под действием GdnHCl. Показано, что лиганд не только делает структуру белка более устойчивой по отношению к денатурирующему действию GdnHCl и нагреванию, по и делает процесс денатурации более кооперативным. Впервые охарактеризована стабильность белков путем определения величин свободных энергий Гиббса.
Впервые установлено, что, несмотря на значительные структурные преобразования, происходящие в глутамин-связывающем белке и Б-галактозаЯ)-глюкоза-связывающем белке при связывании соответствующих лигандов, характеристики их триптофановой флуоресценции при этом изменяются незначительно. Сделано заключение о том, что собственная флуоресценция D-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающего белка вряд ли может использоваться в качестве регистрируемой характеристики при создании биосенсоров для пеинвазивного определения содержания сахара в крови больных диабетом. Тем не менее, существенные изменения пространственной структуры белков при связывании лигандов открывают возможности для использования при конструировании биосенсоров явления поверхностного плазмонного резонанса, а также эффекта переноса энергии при введении в белок флуоресцентных меток — донора и акцептора энергии возбуждения.
На примере глутамин-связывающего белка впервые показано, что вклад отдельных триптофановых остатков в суммарную флуоресценцию белка может зависеть от длины волны возбуждающего света. Предложен метод учета этого эффекта.
Теоретическое и практическое значение работы.
Новые данные о процессах сворачивания-разворачивания глутамин-связывающего белка и Б-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка, а также роли лигандов в этом процессе, существенны для более глубокого понимания роли лигандов в процессах фолдинга этих белков и устойчивости их структуры к действию различных химических денатурантов и нагреванию. Эти данные существенны также для понимания процессов фолдинга сложных мультидоменных белков.
Данные о характере процессов сворачивания-разворачивания глутамин-связывающего белка и О-галактоза/Э-глюкоза-связывающего белка могут иметь важное практическое значение при их использовании в качестве чувствительных элементов биосенсорных систем на глутамин и сахара.
Существенной методической разработкой является установление того факта, что вклад отдельных триптофановых остатков в суммарную флуоресценцию белка может зависеть от длины волны возбуждающего света. Этот эффект необходимо учитывать при использовании метода собственной УФ-флуоресценции для изучения структуры и конформационных изменений белков, при оценке вклада тирозиновых остатков в суммарную флуоресценцию белка, а также при разложении спектра флуоресценции белков, содержащих несколько триптофановых остатков, на составляющие.
Результаты работы используются при проведении лекционно-практических занятий для студентов 4 курса Кафедры биофизики СПбГПУ.
выводы.
1. Связывание лиганда стабилизирует структуру глутамин-связывающего белка и О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка и делает процесс их разворачивания более кооперативным, однако не влияет на путь разворачивания белка и число возникающих при этом промежуточных состояний.
2. Несмотря на сходство структуры глутамин-связывающего белка и D-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка, характер процессов разворачивания этих белков существенно различается:
• разворачивание глутамин-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида является трехстадийным, т. е. проходит с образованием двух промежуточных состояний Ii и 12.
• процесс разворачивания О-галактозаЛЭ-глюкоза-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида является одностадийным.
3. Разворачивание глутамин-связывающего белка и О-галактоза/О-глюкоза-связывающего белка под действием гуанидингидрохлорида является обратимым, а тепловая денатурация необратима.
4. Существенное увеличение интенсивности флуоресценции красителя 1-анилинонафталин-8-сульфоната при переходе в первое промежуточное состояние 1Ь возникающее при разворачивании глутамин-связывающего белка, связано с образованием состояния типа «расплавленной глобулы». Возникновение гидрофобных кластеров на поверхности макромолекулы глутамин-связывающего белка при переходе в это состояние сопровождается ассоциацией макромолекул.
5. Несмотря на значительные структурные преобразования, происходящие в глутамин-связывающем белке и О-галактоза/О-глюкоза-связывающем белке при связывании соответствующих лигандов, характеристики их триптофановой флуоресценции при этом изменяются незначительно.
Список литературы
- Бурштейн Э. А. (1976). Люминесценция белковых хромофоров. Сер. Биофиз, Т.7, ВИНИТИ, Москва.
- Бычкова В. А. и Птицын О.Б. (1995). Функциональное состояние денатурированных белков: принципы моделирования и первые результаты. Цитология. 37: 1238 — 1250.
- Гильманшии Р.И., Долгих Д. А., Птицын О. Б., Финкелынтейн А. В. и Шахнович Е.И. (1982). Белковые глобулы без уникальной пространственной структуры: экспериментальные данные для а-лактальбуминов и общая модель. Биофизика. 27: 1005 1015.
- Грузина В.Д. (2003). Коммуникативные сигналы бактерий. Антибиотики и химиотерапия. 48(10): 32−39.
- Гусев Н.Б. (2004). Нейродегенеративные болезни и проблема правильного сворачивания белка. СОЖ. 8(2): 15−23.
- Капланас Р.И., Буколова Т. Г., Бурштейн Э. А. (1975). Флуоресценция Р-лактоглобулина в различных физико-химических условиях. Мол. Биол. 9: 795 -804.
- Кузнецова И.М., Форже В., Туроверов К. К. (2005). Структурная динамика, стабильность и фолдинг белков. Цитология. 47(11): 943 952.
- Кузнецова И.М., Степаненко Ольга В., Туроверов К. К., Хуанг Ч., Ванг Ч.-Ч. (2005) Конформационные изменения дисульфидизомеразы С под действием гуанидингидрохлорида. Цитология. 47 (11): 1007 1016.
- Кузнецова И.М., Туроверов К. К. (1983). Поляризация собственной флуоресценции белков. III. Внутримолекулярная подвижность триптофановых остатков. Мол. биол. 17 (4): 741 754.
- Кузнецова И.М., Туроверов К. К. (1998). Что определяет характеристики собственной УФ-флуоресценции белков? Анализ свойств микроокружения иособенностей локализации их триптофановых остатков. Цитология. 40 (8/9): 747 762.
- Лакович Дж. (1986). Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир. стр. 136 139.
- Поварова О.И., Кузнецова И. М., Туроверов К. К. (2005). Физико-химические свойства актина в различных структурных состояниях. Новые представления о процессах его сворачивания — разворачивания. Цитология. 47: 935 — 977.
- Полинг Л., Полинг П. (1978). Химия. М.: Мир. стр. 683.
- Птицын О.Б. (1973). Стадийный механизм организации белковых молекул. Докл. Акад. Наук СССР. 210: 1213 1215.
- Степаненко Ольга В., Кузнецова И. М., Туроверов К. К., Скогиамиглио В., Стаяно М., Д’Ауриа С. (2005). Структура и стабильность глутаминсвязывающего белка из Escherichia coli и его комплекса с глутамином. Цитология. 47(11): 988 1006.
- Степаненко Ольга В., Кузнецова И. М., Туроверов К. К., Скогнамиглио В., Стаяно М., Д’Ауриа С. (2007). Влияние лиганда на стабильность и процессы фолдинга двухдоменных лигапд-связывающих белков. Вестник молодых ученых. Выпуск IV. М.: СП «Мысль». 42−52.
- Туроверов К.К., Бикташев А. Г., Дорофеюк А. В., Кузнецова И. М. (1998). Комплекс аппаратных и программных средств для измерения спектральных, поляризационных и кинетических характеристик флуоресценции в растворе. Цитология. 40 (8/9): 806−817.
- Туроверов К.К., Кузнецова И. М. (1998). Собственная УФ-флуоресценция белков как инструмент для изучения их динамики. Цитология. 40 (8/9): 735 -746.
- Финкельштейн, А.В. (1976). Стереохимический анализ вторичной структуры полипептидной цепи при помощи пространственных моделей Курто. I. Разрешение конформации дипептидов. Мол. Биология. 10 (3): 507 513.
- Финкельштейн А.В., Птицын О. Б. (2005). Физика белка. М.: КДУ. 456 с.
- Эфтинк М.Р. (1998). Использование флуоресцентных методов для изучения разворачивания белков. Биохимия. 63 (3): 327 337.
- Akiyama S., Takahashi S., Ishimori К. and Morishima I. (2000). Stepwise formation of a-helices during cytochrome с folding. Nat. Struct. Biol. 7: 514 — 520.
- Altschuler G.M., Klug D.R., Willison K.R. (2005). Unfolding energetics of G-a-actine: a discrete intermediate can be re-folded to the native state by CCT. J.Mol.Biol. 353(2): 385−396.
- Ames G. F.-L. and Lecar H. (1992). ATP-dependent bacterial transporters and cystic fibrosis: analogy between channels and transporters. FASEB J. 6: 2660−2666.
- Anfinsen C.B. (1973). Principles that govern the folding of proteins chains. Science. 181:223 -230.
- Anraku Y. (1968). Transport of sugars and amino acids in bacteria. I. Purification and specificity of the galactose and leucine-binding proteins. JBC 243 (11): 3116 -3122.
- Arai M., Inobe Т., Maki K., Ikura Т., Kihara H., Amemiya Y., and Kuwajima K. (2003). Denaturation and reassembly of chaperonin GroEL studied by solution X-ray scattering, Protein Sci. 12: 672 680.
- Bader M.V. and Bardwell J.C.A. (2002). Catalysis of disulfide bond formation and isomerization in Escherichia coli. Adv. Protein. Chem. 59: 283 301.
- Baldwin R.L. and Rose G.D. (1999a). Is protein folding hierarchic? I. Local structure and peptide folding. Trends Biochem. Sci. 24(1): 26−33.
- Baldwin R.L. and Rose G.D. (1999b). Is protein folding hierarchic? II. Folding intermediates and transition states. Trends Biochem. Sci. 24(2): 77−83.
- Beel B.D. and Hazelbauer G.L. (2001). Signaling substitutions in the periplasmic domain of chemoreceptor Trg induce or reduce helical sliding in the transmembrane domain. Molecular Microbiology. 40(4): 824 834.
- Berman H.M., Westbrook J., Feng Z., Gilliland G., Bhat T.N., Weissing H., Shindyalov I.N., Bourne P.E. (2000). The protein data bank. Nucleic Acids Research. 28 (1): 235−242.
- Bilsel O., Matthews C.R. (2000). Barriers in protein folding reactions. Adv. Protein Chem. 53: 153 -207.
- Bjorkman A.J. and Mowbray S.L. (1998). Multiple open forms of ribose-binding protein trace the path of its conformational change. JMB. 279(3): 651 64.
- Borrok M.J., Kiessling L.L. and Forest K.T. (2007). Conformational changes of d-glucose/D-galactose binding protein illuminated by apo and ultrahigh resolution ligand-bound structures. Prot.Sci. 16(6): 1032- 1041.
- Bushmarina N. A., Kuznetsova I. M., Biktashev A. G., Turoverov К. K., Uversky V. N. (2001). Partially folded conformations in the folding pathway of bovine carbonic anhydrase II: a fluorescence spectroscopic analysis. Chem.Bio.Chem. 2: 813 — 821.
- Bychkova V.E. and Ptitsyn O.B. (1993). The molten globule in vitro and in vivo. Chemtracts Biochemistry and Molecular Biology. 4: 133 — 163.
- Careaga C.L., Sutherland J., Sabeti J. and Falke J. (1995). Large amplitude twisting motions of an interdomain hinge: a disulfide trapping study of the galactose-glucose binding protein. Biochemistry. 34: 3048 3055.
- Carrell R.W., Gooptu B. (1998). Conformational changes and disease serpins, prions and Alzheimer’s. Curr. Opin. Struct. Biol. 8: 799 — 809.
- Carrio M., Gonzalez-Montalban N., Vera A., Villaverde A., Ventura S. (2005). Amyloid-like properties of bacterial inclusion bodies. J.Mol.Biol. 347: 1025 1037.
- Chen Y., Barklcy M. D. (1998). Toward understanding tryptophan fluorescence in proteins. Biochemistry 37: 9976−9982.
- Chen X., Schauder S., Potter N., Van Dorsselaer A., Pelczer I., Basslcr B.L., and Hughson F.M. (2002). Structural identification of a bacterial quorum-sensing signal containing boron. Nature. 415: 545 549.
- Chen J., Walter S., Horwich A.L. and Smith D.L. (2001). Folding of malate dehydrogenase inside the GroEL-GroES cavity. Nature Struct. Biol. 8: 721 728.47