Разработка молекулярно-генетических подходов для оптимизации промышленно-важных характеристик фитазы Citrobacter freundii

Актуальность темы

.

В последнее время для улучшения питательных свойств растительных кормов широко применяются ферменты — фитазы микробного происхождения, катализирующие гидролиз фитатов с отщеплением неорганического фосфата.

Фитаты (мио-инозитол гексакисфосфаты), в виде которых растения запасают фосфор, практически не усваиваются организмом животных с однокамерным желудком и домашней птицей [1]. Значительная доля неусвоенного фосфора выводится с экскрементами из организма и загрязняет окружающую среду [2]. Кроме того, фитаты являются хелатирующими агентами и способны образовывать комплексы с дивалентными катионами, а также с белками [3]. Фитазы — ценные пищевые добавки.

Введение

их в растительные корма повышает усвоение фосфора, кальция, микроэлементов, белков и аминокислот желудочно-кишечным трактом животных [4].

Дефицит и высокая стоимость рыбной муки (в качестве источника фосфора) привели к тому, что всё чаще при выращивании животных и птицы стали использовать рационы растительного типа (зерно, семена масличных культур, бобовые). Таким образом, возникает повышенная потребность кормопроизводства в пищевых добавках, содержащих фитазы.

Для практического использования фитазы должны обладать следующими характеристиками:

1. быть устойчивыми к кратковременному (5−10 мин.) действию высоких температур (70°С — 80°С) в ходе гранулирования комбикормов;

2. обладать высокой удельной активностью;

3. способностью работать в физиологических условиях желудочно-кишечного тракта (температурный оптимум около 42 °C, рабочий профиль в интервале рН 3−5);

4. способностью выдерживать действие среды желудка животных (стабильность при низких значениях рН 1,5−2,5 и устойчивость к протеолитическим ферментам).

Все известные фитазы имеют разные характеристики, причем у каждого фермента есть свои преимущества и недостатки. Недостатком бактериальных фитаз, принадлежащих к семейству кислых гистидиновых фосфатаз, является их низкая термостабильность. Однако, они весьма перспективны из-за высокой удельной активности, устойчивости к протеолитическим ферментам, способности работать в кислых условиях и выдерживать низкие значения рН.

Известны различные молекулярно-генетические подходы, позволяющие значительно повысить термостабильность белков [5, 6]. Однако они не всегда могут быть применимы к исследуемым ферментам, а так же имеют ряд недостатков. Так, увеличение термостабильности часто влечёт за собой смещение температурного оптимума фермента и значительное уменьшение его удельной активности. Таким образом, разработка молекулярно-генетических подходов для получения мутантных генов, кодирующих фитазы с оптимизированными промышленными характеристиками, является актуальной задачей. Кроме того, на Российском рынке препараты фитаз представлены только зарубежными производителями, поэтому получение отечественных конкурентно-способных ферментов также актуально.

Цели и задачи работы.

Целью данной работы явилась разработка молекулярно-генетического подхода к конструированию мутантного гена, кодирующего фитазу с повышенной термостабильностью, высокой удельной активностью и неизменённым температурным оптимумом, а так же его эффективная экспрессия в системе, пригодной для промышленности.

В связи с этим ставились следующие задачи:

1. Оценить эффективность различных молекулярно-генетических подходов с целью получения мутантных генов бактериальных фитаз с повышенной термостабильностью.

2. Разработать наиболее эффективный молекулярно-генетический подход и на его основе сконструировать, клонировать и экспрессировать мутантный ген фитазы с оптимизированными свойствами.

3. Охарактеризовать свойства полученного мутантного варианта фитазы с оптимизированными свойствами.

4. Показать возможность эффективной экспрессии сконструированного мутантного гена и оценить потенциальную возможность применения полученной на его основе фитазы в кормопроизводстве.

Научная новизна.

Методами сайт-направленного мутагенеза и «error-prone» ПЦР были получены, различные мутантные гены, кодирующие фитазы с повышенной термостабильностью. Разработана система для клонирования, экспрессии и отбора мутантных генов. Показано, что некоторые аминокислотные замены в консервативных областях фитазы АррА Е. coli, приводящие к увеличению её термостабильности, аналогичным образом влияют на термостабильность фитаз Citrobacter freundii и Obesumbacterium proteus, несмотря на низкую аминокислотную гомологию. Впервые были получены мутантные фитазы остаточные фитазные активности которых (после 10 минутного прогрева при 80°С) составили 45% и 60%, соответственно. Таким образом, термостабильность мутантных фитаз при указанных условиях возросла в 15 и 10 раз, соответственно.

Для получения мутантных генов фитаз с повышенной термостабильностью был разработан полурациональный подход, основанный на сфокусированном мутагенезе. В нём впервые в качестве сайтов-мишеней для проведения случайного мутагенеза были предложены области (аминокислотной последовательности) с высокой консервативностью. Так, в результате случайного мутагенеза областей гена, соответствующих аминокислотным участкам K29-G74 и Q104-Q131, методом «error-prone» ПЦР был получен мутантный ген, кодирующий оптимизированную по свойствам фитазу. После 10 минутного прогрева при 70 °C и 80 °C остаточная фитазная активность которой составила 50% и 35%, соответственно. Таким образом, термостабильность при указанных условиях возросла в 5 и 11 раз, соответственно. Удельная активность уменьшилась незначительно и составила 2215 ед/мг белка. Температурный оптимум полученного фермента не сместился, а эффективность работы при 40 °C увеличилась на 20%.

Для увеличения экспрессии гена оптимизированной фитазы в дрожжах P. pastoris была разработана синтетическая нуклеотидная последовательность (депонирована в ГенБанк) с учётом правила оптимальности кодонов, а таюке предложен усовершенствованный ПЦР-метод для её синтеза. Ген фитазы с оптимизированной нуклеотидной последовательностью был синтезирован, трансформирован в клетки P. pastoris и отобран клон с активностью 650 ед/мл (при культивировании в лабораторных условиях), что показывает 50%-ое < увеличение продуктивности* полученного штамма.

Практическая значимость.

Разработанный молекулярно-генетический подход, основанный на сфокусированном случайном мутагенезе высоко-консервативных областей, может быть полезен для получения новых мутантных генов фитаз с повышенной термостабильностью.

Предложенный ПЦР-метод для синтеза ДНК последовательностей из олигонуклеотидов является простым и удобным инструментарием для генетической инженерии.

В ходе работы были обнаружены высокие показатели кормовых качеств фитазы PhyA-Cf, а также схожесть её свойств с мутантной термостабильной фитазой PhyA-CfM3, что даёт возможность перспективно использовать последнюю в процессе приготовления комбикормов при повышенных температурах.

Для продукции промышленных ферментов необходимо создание высокоэффективных продуцентов. В данной работе показана возможность эффективной экспрессии полученного мутантного гена термостабильной фитазы PhyA-CfM3 в широко используемых в промышленности дрожжах P. pas tor is.

II ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

V выводы.

1. Обнаружены одинаковые аминокислотные мутации, приводящие к увеличению термостабильности фитаз из одного и того же семейства, несмотря на низкую аминокислотную гомологию.

2. Предложены области для проведения сфокусированного случайного мутагенеза с целью эффективного получения генов фитаз с повышенной термостабильностью.

3. Получен, клонирован и экспрессирован мутантный вариант гена фитазы С. /геипсШ с оптимизированными характеристиками.

4. Охарактеризован мутантный вариант фитазы С. /геипсШ с оптимизированными промышленно-важными свойствами.

5. Разработан усовершенствованный ПЦР метод, которым синтезировали новый синтетический ген термостабильной фитазы для эффективной экспрессии в дрожжах Р. раБ^пБ.