Синегнойная палочка и её фаги (морфология, некоторые биологические свойства)

Актуальность проблемы. Искусственное осеменение коров и телок в крупных специализированных хозяйствах в настоящее время является основным методом воспроизводства стада. Концентрация высокоценных быков-производителей на племпредприятиях требует строгого выполнения ветеринарно-санитарннх правил при взятии, обработке, хранении и использовании их спермы. При нарушении ветеринарно-санитарных требований сперма может быть источником распространения возбудителей инфекционных заболеваний, вызывающих патологию репродуктивных органов. Вопросы профилактики бесплодия маточного состава и производителей крупного рогатого скота занимают важное место в решении задач по дальнейшему увеличению поголовья животных.

Одним из множества факторов, обусловливающих бесплодиеявляется бактериальная контаминация гениталиев самок и производителей и возникающие, вследствие этого, различные нарушения воспроизводительной функции животных.

Однако, до сих пор мнения различных исследователей относительно роли потенциально (условно) патогенных бактерий в нарушении воспроизводительной способности животных противоречивы. Некоторые исследователи отрицают этиологическое значение их в патологии гениталиев животных (… И/гн/'еЬл, {т. С. З/ттоля, 1969, и др.), но большинство — связывают с ними нарушения воспроизводительных процессов (П. А. Волос ков, А. П. Студенцов, Г. В. Зверева, Е. В. Ильинский, И. Ф. Заянчковский, Д. Д. Логвинов, Н. И. Полянский, Н. Н. Михайлов, В. А. Зудилин и др.).

Весьма разнообразны данные о видовом составе контаминант-ной микрофлоры, выделенной из половых органов крупного рогатого скота, в частности, полости прецудил, придаточных половых желез и спермы быков-производителей. Особое этиологическое значение в патологии репродукции животных придается стафилококкам, стрептококкам, эшерихиям, псевдомонас и другим потенциально патогенным бактериям.

В результате широкого применения в лечебной практике антибиотиков увеличилось количество устойчивых к ним бактерий различных видов, в том числе синегнойной палочки (Pseudomonas ae? vg/tioso?), которая стала частым контаминантом спермы быков-производителей (Н.Н.Михайлов, Н. Г. Балажов, В. А. Зудилин, Б. Мур-тазин, В. П. Парусов, Б. Коццрашов и др.).

Прошло более 65 лет с того времени, как работы Д’Эрелля (1917) привлекли внимание исследователей к новому миру широко распространенных живых существ — бактериофагам или бактериальным вирусам, которые поражают бактерии.

За последние годы в Советском Союзе особенно интенсивно разрабатываются вопросы фагопрофилактики и фаготерапии бактериальных инфекций (В.Г.Дроботько, Б. И. Клейн, С. С. Казарновская, Г. О. Ручко, Ф. Е. Сергиенко, Н. Н. Фишер, З. А. Ермольева, М. И. Луре, Г. А. Крестовникова, И. А. Сутин, Л. Н. Якобсон и др.). В изучении сущности явления бактериофагии, исследовании новых групп фагов и их использовании — большой вклад внесли В. Д. Тимаков, М.Н.Жу-ков-Вережников, А. Б. Крисс, А. П. Пехов, A.C.Тихоненко, В. А. Зуев, И. М. Габрилович и другие исследователи.

Впервые бактериофаги синегнойной палочки упоминались в работах С arte? k (1923), Combi esc О г Marche и (1923), fo/is (1923), Dcudak 1923), позднее — ?ra№j/{x<&&) t/7sc6esc/?ov (1926), Se и-¿-í-z eé-¿-/(1948),¿-aсо67 1953), O’caifap/icw e? ai.

1969} t C/iOW, Jwamou (1969), С. И. Жилина (1973), Т.А.Бурбута-швили (1980), Х. И. Исхаковой (1980) и др.

Бактериофаги применяют как для титрования культур бактерий сине-зеленого гноя, идентификации их, особенно в случае бес.

I • пигментных вариантов, или с другими отклонениями от типичных свойств, так при дифференциации синегнойной палочки от сходных бактерий (зеленящий стрептококк и др.).

Изучение биологических свойств бактериофагов синегнойной палочки, выделенной от быков-производителей из разных зон СССР, -является актуальным в ветеринарной науке и практике, так как заболевание псевдомонозом, особенно производителей сельскохозяйственных животных, продолжает иметь место. К тому же возрастает интерес к бактериофагам в теоретическом и практическом аспектах.

Цель и задачи исследований. Освоение методов выделения фагов синегнойной палочки и изучения их основных биологических свойств в целях дальнейшего использования в качестве диагностических препаратов.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить морфологию, культурально-биохимические и другие свойства культур штаммов синегнойной палочки (выделенных из спермы быков-производителей в разных регионах СССР), как бактерии-хозяина фага.

2. Определить степень чувствительности синегнойной палочки к антибиотикам.

3. Выделить бактериофаги синегнойной палочки и изучить их основные морфологические особенности и биологические свойства. ти.

Научная новизна работы. Определена ферментивная и гемолитическая активность культур синегнойной палочки (штаммов), выделенной от быков-производителей в разных регионах СССРпри этом не отмечена корреляция между серотипом возбудителя, региона нахождения объекта выделения и степенью ферментативной активности. Установлена степень чувствительности и особенности роста изучаемых штаммов бактерий к 15 антибиотикам (методы дисков и серийных разведений).

Апробирована с положительным результатом селективная среда и среда ДОХ, предложенные НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалея (А.Ф.Мороз, Б. М. Бекбергенов, Г. Е. Афиногенов, 1976) для выделения синегнойной палочки, а также методика и среда Дга /'(1970) для идентификации синегнойной палочки по ее циоцианина-пигментообразованию, причем в этой среде глюконат калия заменен на глюконат натрия.

Выделены три бактериофага синегнойной палочки со специфическим воздействием на возбудителя псевдомоноза. Определены некоторые морфологические особенности и основные биологические свойства этих бактериофагов: морфология частиц бактериофага, негативные колонии, логический аспект и активность, воздействие температурного фактора. Полученные впервые данные по бактериофагам могут быть использованы в дальнейших научно-исследовательских работах для фаготипирования синегнойной палочки.

Практическая ценность. Результаты апробации селективной питательной среды (А.Ф.Мороз и соавторы, 1976) подтверждают рекомендации по использованию ее в ветеринарной лабораторной практике при диагностике псевдомоноза сельскохозяйственных животных, а также среды Дга/ (1970) для дифференциации синегнойной палочки от других бактерий родов (?//??г/о, /?его/поп^s tPrueeus% f{?eis/eifat ?'/?roeac/er nLf/reerue&eeei) с помощью теста окисления глюконата натрия или калия.

При изучении чувствительности синегнойной палочки к антибиотикам методом серийных разведений целесообразно определять бактериоцидный показатель при инкубировании культур на средах в термостате (37,0° С) не менее 8 суток.

Метод получения бактериофагов синегнойной палочки, вццеленной из спермы производителей может быть использован в ветеринарных целях (фаготипирование, фаготерапия).

Ашзобашя работы. Материалы доложены на конференции молодых ученых Всесоюзного ордена Ленина научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко (г.Москва, II мая 1984), заседании Ученого совета ВИЭВ (апрель 1984), межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ (май 1985).

Публикации:

1. Морфология бактериофагов синегнойной палочки, выделенной от быков. Бюл. ВИЭВ, 1984 г., вып.56, с.48−51.

2. Индикация бактериофагов синегнойной палочки, выделенной от быков-производителей. Бюл. ВИЭВ, 1984 г., вып.56, с.76−77.

Объем работы. Диссертация изложена на 180 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы. Работа иллюстрирована I графиком, 12 таблицами и 48 фотографиями. Спиоок использованной литературы включает 271 источник, в том числе 174 советских и 97 зарубежных.

4. ВЫВОДЫ.

1. Сине гнойная палочка (Ре. ае7га (^//70зс (), выделенная как контаминант спермы быков-производителей и бактериальная клетка-хозяин фага, характеризуются следующим:

— морфологические особенности, тинкториальные и культураль-ные свойства 95 штаммов синегнойной палочки идентичны: аэробы, грамотрицательны, имеют форму палочек длиной 0,5−1,5 мкм и шириной 0,2−0,4 мкм, подвижные, спор не образуют, истинной капсулы не имеют, но продуцируют слизь, которая тонким слоем окружает бактерию, имеют один-два жгутика (культивируются на обычных средах) — апигментные штаммы обнаружены в 3,2 $ случаях, от исследуемых;

— обладают ферментативными свойствами, характерными для данного вида бактерийне установлено корреляционной зависимости между серотипами возбудителя (Хабс, 1957), объектом выделения (сперма), зональностью и степенью ферментативной активности;

— степень вирулентности изучаемых полевых штаммов (68) сине-гнойной палочки при заражении белых мышей (гибель в первые 1824 час.) коррелировали с гемолитической активностью бактерий.

2. Установлено, что испытуемые штаммы синегнойной палочки оказались чувствительными к гентамицину (98,8 $), рифампицину (94,4 $), полимиксину (81,1 $), неомицину (14,4 $) и карбеницилли-ну (7,7 $).

3. Впервые получены 3 бактериофага (фаголизата) синегнойной палочки (методом длительной адаптации и пассирования), выделенной из спермы быков-производителей, обладающие следующими морфологическими особенностями (пять морфогрупп):

— при электронно-микроскопическом исследовании фагов синегнойной палочки установлено, что фаги первой морфогруппы имеют нитевидную (спиралевидную) формувторой группы — представляют собой головку формой, близкой к разностороннему многограннику в о виде икосаэдра размером от 375 до 550 А, без выраженного отроо сткатретья группа — имеет аналогичную форму головки (550−600 А) о с коротким отростком (геликальный хвост) длиной 150−250 А и ши-о риной 60−60 Афаги четвертой группы — имеют головку в виде изоо метрического многогранника (550−550 А), удлиненный и тонкий с несокращающимся чехлом отросток в изогнутой форме (длина и ширина о.

2650×80 А) — а пятой группе фагов присущи равносторонние головки в виде изометрического многогранника или удлиненной формы о растянутого многогранника (650−1250 А), отросток у них разной о о длинны с сокращающимся чехлом (длина 450−700 А, ширина 170−220 А) о о и несокращающимся (длиной 1400−1900 А и шириной 150−200 А). Фаги этой группы имеют связующие нити, исходящие из их отростков.

4. Так называемые негативные колонии (НК) фагов подразделены на 4 группы — мелкие, средние, крупные и очень крупные (мм диаметра) — в каждой группе имеются несколько типов НК, характеризующиеся разной степенью лизиса, прозрачность или мутность «стерильного пятна» на бактериальной колонии является признаком для данной пары: фаг — бактериальная клетка-хозяин.

5. Выращивание бактериофагов производится на культурах синегнойной палочки на бульоне Мартена (при 37^ в течение 3−4 час. с последующим выдерживанием при комнатной температуре 16−18 часов методом Аппельмана (1922) или 18−20 ч. методом Грациа (1936).

6. Термоинактивации бактериофагов (фаголизатов) синегнойной о палочки (концентрация фага ТО в I мл) происходит при температуре нагревания в пределах 68−74°С.

7. Полученные экспериментальные данные по изучению основных свойств фагов (бактериальных вирусов) и клеток-хозяев синегнойних бактерий дополнили, подтвердили и систематизировали имеющиеся в специальной литературе сведения по этим вопросам.

Практические предложения.

1. Полученные в экспериментальных условиях бактериофаги (фа-голизаты) синегнойной палочки могут быть использованы в диагностических целях для фаготипирования этих бактерий и терапии больных псевдомонозом животных.

2. Использование бактериофагов синегнойной палочки может также служить дополнительным тестобъектом при изучении взаимоотношений между вирусом и бактериальной клеткой.

3. Представленные обобщенные данные по бактериофагам синегнойной палочки рекомендуется использовать в научно-исследовательских и учебных учреждениях общебиологического и ветеринарного профиля.