Изучение лактогенных свойств гидролизатов из нетрадиционного сырья природного происхождения в питательных средах и in vivo

Актуальность исследования. Лактобактерии относятся к большой группе микроорганизмов, широко распространенных в природе, способных расти в различных условиях окружающей среды (Банникова J1.A., 1987; Коршунов В. М., 2000; Batisal S., 2001; Gopal P., 2001; Ogawa M., 2001). Они являются важнейшими компонентами микробных сообществ различных биотопов окружающей среды и живого организма. Молочнокислые бактерии встречаются в почве, сосредотачиваясь вокруг корневой системы растений (Квасников Е.И., Сумневич М. Г., 1953; Богданов В. М., 1959). Их высевают из молока, молочных продуктов, кефирных грибков, муки, цветов, растений, ягод, фруктов и овощей (Богданов В.М., Пятницына И. Н., 1959; Луковникова Л. А., 1965; Банникова Л. А., 1970; Талачкене Р. И., 1970; Чужова З. П., 1970; Сагындыкова С. З., 1990).

Исследователи солидарны в мнении о том, что именно микробы молочнокислого брожения играют ведущую роль в обеспечении устойчивого микробиоценоза и, связанных с ним, многочисленных жизненно важных функций в организме человека, животных, птиц и даже насекомых (Банникова Л.А., 1987; Коршунов В. М., 2000; Бухарина О. В., 2006; Хавкин А. И., 2006).

Нарушение качественного и количественного состава лактобактерий, вплоть до их полного исчезновения, является одним из общих признаков дисбактериоза живой системы, независимо от его причин. Доказано, что недостаток лактофлоры является причиной снижения колонизационной резистентности кишечника другими микроорганизмами, в частности энтеро-бактериями, бифидобактериями и другими (Блохина И.Н., Дорофейчук В. Г., 1979; Красноголовец В. Н., 1979; Пинегин Б. В., 1984; Барзашка-Попова С.Н., 1990; Гребенев А. Л., Мягкова Л. П., 1994; Барановский А. Ю., Кондрашина Э. А., 2000; Петенко А. И., Ярошенко В. А., Кощаев А. Г., 2003; Овод A.C., 2005).

В связи с высокой метаболической активностью лактобактерий,. их антагонистическими и антибиотическими свойствами, а также высокой адге-зивностью по отношению к тканям организма, эти микроорганизмы все чаще рассматривают, как: основной компонент лекарственных препаратов,. Б АД и пищевых продуктов, которые обладают пробиотическим, иммуномодули-рующим и пребиотическим действием (Конькова Н.К., 2002; Чистохина Л. П., 2004; Молохова Е. И: и др., 2006; Хавкин А. И., 2006).

Разработка, таких препаратов и продуктов сопряжена, прежде всего, с. выделением из различных биологических объектов И: окружающей среды, идентификацией и поддержанием высокоактивных и стабильных культура молочнокислых бактерий, а также с созданием оптимальных условий для наращивания бакмассы. в достаточном количестве. Успех этих манипуляций связан с процессом культивированияопределяющимся^ прежде всего, качеством питательных сред. Лактобактерииявляются ауксотрофными организмами и поэтому чрезвычайно требовательнык искусственнымпитательным, средам (Степаненко И: Ш, — 2005). Несмотряна то, что для лабораторного и промышленного культивирования лактобактерий в, микробиологии известны и широко используетсяцелый рядпитательных сред на основе молока, дрожжевого гидролизата и печеночного экстракта, растительных объектов и др. (Аристовская Т.В.и др, 1962; Нетрусов" А.И. и др-,. 2005; Дзержинская И. С., 2008), появились мнения о снижении их свойств-, связанных с ухудшением качества сырьевых субстанций, вследствие экологических, эпизоотических и антропогенных проблем (ПановаHIB.,. 2006; Waguespack М, 1986; Corrigan Р: J., Seneviratna PI, 1989). К недостаткам известных питательных сред можно отнести и краткий срок хранения, основы, изготовленной из молочного сырья- (Конькова Н: К., 2002), а также технологические трудности и дополнительные затраты, приизготовлениинекоторых компонентов для таких сред, как MRS, среда’с Твин-80 и другие (Банникова Л. А., 1975);

Вышеизложенное обусловливает необходимость изыскания новых доступных и экономически оправданных компонентов, использование которых позволит усовершенствовать имеющиеся и разработать новые эффективные питательные среды для молочнокислых бактерий, а также обусловит перспективы получения на их основе пребиотиков с лактогенным эффектом.

В связи с этим тематика исследований по изучению эффективности использования гидролизатов из нетрадиционного сырья природного происхождения в питательных средах для культивирования лактобактерий представляется актуальной и своевременной.

Цель исследования: разработка новых гидролизатов на основе нетрадиционного сырья природного происхождения и изучение их лактогенных свойств.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи.

1. Подобрать нетрадиционное сырье природного происхождения с учетом питательных потребностей лактобактерий.

2. Отработать технологию получения гидролизатов из используемого нетрадиционного сырья природного происхождения и изучить их физико-химические свойства.

3. Испытать новые гидролизаты в качестве стимулирующих компонентов питательных сред при культивировании лактобактерий.

4. Изучить влияние полученных гидролизатов на микрофлору кишечника, в том числе лактогенный эффект, на белых крысах линии «Вистар».

5. Дать сравнительную оценку экономической эффективности разработанных питательных сред для культивирования лактобактерий.

Научная новизна исследования. Впервые теоретически и экспериментально обоснован выбор нетрадиционного сырья для получения гидролизатов с целью их использования в качестве стимулирующих добавок к питательным средам для культивирования лактобактерий.

Отработана модификация технологии получения новых гидролизатов из тибетского молочного гриба и каллизии душистой, заключающаяся в поэтапном добавлении набора ферментов, что позволило добиться высоких показателей качества (аминный азот и сухой остаток) и обусловило преимущества ферментативных гидролизатов над кислотными.

Впервые изучен химический состав трех ферментативных гидролизатов (ФГ) из тибетского молочного гриба (ТМГ), каллизии душистой (КД) и молок лососевых рыб (MJIP) и доказано, что в них, в различных качественных и количественных отношениях, присутствуют многочисленные биологически активные вещества (белки, углеводы, органические кислоты, микрои макроэлементы), необходимые для роста и развития лактобактерий.

Впервые на примере Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ, Lactobacillus fer-mentum 90T-C4 к Lactobacillus acidophilus EP 317−402, при их культивировании на модификациях МРС-среды и агара Хоттингера, доказана возможность использования ферментативных гидролизатов из тибетского молочного гриба, каллизии душистой и молок лососевых рыб в качестве стимуляторов роста и предложена рецептура питательных сред для лактобактерий.

Разработана новая питательная среда для культивирования лактобактерий на основе ферментативного гидролизата из капусты (ФГК) с использованием ферментативного гидролизата из колоний и молочного настоя тибетского молочного гриба (ФГКТМГМН) в качестве стимулирующего компонента.

Доказана экономическая эффективность применения новых питательных сред по сравнению с МРС-средой и агаром Хоттингера.

Приоритетность выполненных исследований подтверждена положительными решениями о выдаче патентов на изобретения по заявкам № 2 009 140 531 «Питательная среда для культивирования лактобактерий» и № 2 009 149 506 «Способ получения ферментативного гидролизата из капусты и питательная среда для культивирования лактобактерий на его основе». Результаты испытаний положены в основу патентного поиска по заявке № 2 009 120 982 «Способ получения ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба и питательная среда на его основе для культивирования лактобактерий».

Впервые доказано положительное воздействие ферментативных гидро-лизатов из тибетского молочного гриба, каллизии душистой и молок лососевых рыб на кишечную микрофлору экспериментальных животных, что выражается в увеличение числа лактои бифидобактерий и ингибирование роста условно-патогенных микроорганизмов. Определены перспективы их применения в качестве пребиотиков с характерным лактогенным эффектом.

Подтверждено непосредственное влияние всех гидролизатов на биологические свойства лактобактерий, обеспечивающие их антагонистический эффект, активность кислотообразования, устойчивость к поваренной соли и фенолоустойчивость.

Доказано, что максимальный лактогенный и пребиотический эффект наблюдается при использовании ферментативного гидролизата из тибетского молочного гриба.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Полученные результаты могут быть использованы для наращивания бакмассы лактобактерий на предприятиях микробиологической промышленности и в лабораторной деятельности микробиолога. По итогам испытания ферментативных гидролизатов из ТМГ, КД и КТМГМН разработана и утверждена на экспериментально-производственном уровне техническая документация, а также получен акт внедрения ФГТМГ и ФГКД в производство пробиотиков на предприятии «Микромир» совместно с ФГУ «Ставропольская межобластная ветеринарная лаборатория» на базе ОАО «Завод Лактобиотиков» г. Ставрополя.

Научные разработки используются в работе Ставропольского научно-исследовательского противочумного института и научно-образовательного центра «Технологии живых систем, биологические материалы» Ставропольского государственного университета. Материалы диссертационной работы используются в научной деятельности и учебном процессе Ставропольского государственного университета, Ставропольского филиала Московского государственного гуманитарного университета им. М. А. Шолохова, Ставропольской государственной медицинской академии, Северо-Кавказского государственного технического университета (Ставрополь) в качестве дополнений к учебным материалам по дисциплинам «Микробиология», «Биотехнология», «Частная микробиология», «Санитарная микробиология», «Биотехнология, промышленное и хозяйственное использование микроорганизмов».

Результаты изучения влияния ферментативных гидролизатов из тибетского молочного гриба, каллизии душистой и молок лососевых рыб на микрофлору кишечника крыс могут быть использованы при разработке биологически активных добавок с пребиотическим эффектом к пище и корму для животных.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на четвертой и пятой ежегодной' конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центраРАН (Ростов-на-Дону, 2009; 2010 гг.) — на 53-й, 54-й и 55-й научных конференциях «Университетская наука — региону» (Ставрополь, 2008; 2009; 2010 гг.) — на X Международной научной конференции «Биологическое разнообразие Кавказа» (Грозный, 2008 г.). Ферментативные гидролизаты из тибетского молочного гриба, каллизии душистой, а также новая капустная среда и биологически активная кормовая добавка ФГТМГ представлен на VII и VIII Международных специализированных выставках «МИР БИОТЕХНОЛОГИИ 2009, 2010» (Москва) и на Всероссийской выставке научно-технического творчества молодежи (Москва, 2010 г.), где награждены двумя дипломами и двумя золотыми медалями.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Тибетский молочный гриб, каллизия душистая и молоки лососевых рыб являются альтернативным нетрадиционным сырьем для получения гидролизатов' с физико-химическими свойствами, отвечающими питательным потребностям лактобактерий.

2. Экспериментально обоснована и разработана технология получения ферментативных гидролизатов из ТМГ, КД, которая обеспечивает высокие качественные показатели и биологическую полноценность за счет содержания аминокислот и небелковых субстанций сухого остатка.

3. Ферментативные гидролизаты из ТМГ, КД и МЛР целесообразно и экономически эффективно использовать в качестве стимулирующих компонентов новых и адаптированных питательных сред для культивирования лак-тобактерий.

4. Все полученные гидролизаты из нетрадиционного природного сырья оказывают в разной степени выраженное пребиотическое действие, в том числе за счет лактогенного эффекта.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 12 печатных работ, в том числе три из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 160 страницах компьютерного набора, иллюстрирована 31 рисунком, 18 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, главы результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, практических рекомендаций и приложений. Список использованной литературы содержит 233 источника, в том числе 48 работ зарубежных авторов.

выводы.

1. Аналитические и собственные сведения о составе микробного симбионта Мескяотусез gysevii, растения СаЯ/ям /га§ уат и молок лососевых рыб свидетельствуют о наличии в них комплекса биологически активных веществ, соответствующих питательным потребностям молочнокислых бактерий, что позволяет рассматривать эти нетрадиционные сырьевые объекты в качестве альтернативных традиционным для получения лактостимулирую-щих компонентов питательных сред.

2. Экспериментально обоснована и отработана технология получения ферментативных гидролизатов из растения СаИша fragrans, а также симбионта Мейтотусеъ gysevu самостоятельно и в комбинации с его молочным настоем, заключающаяся в увеличении продолжительности гидролиза за счет поэтапного чередования набора ферментов, что обеспечило более высокие показатели качества (аминный азот и сухой остаток) ферментативных гидролизатов по сравнению с кислотными, изготовленными из этого же сырья.

3. Среди ферментативных гидролизатов максимальными показателями аминного азота и сухого остатка отличается гидролизат из ТМГ, а также из колоний и молочного настоя ТМГ. ФГМЛР занимает промежуточное положение, а в ФГКД, при минимальном уровне аминного азота, отмечен достаточно высокий уровень сухого остатка, что свидетельствует о наличии биологически активных веществ небелковой природы.

4. В ферментативных гидролизатах ТМГ, КД и МЛР обнаружены отдельные элементы и их комбинации, которые обусловливают широкий набор биохимических реакций, лежащих в основе питательных потребностей изученных культур лактобактерий.

5. Питательные среды, смоделированные, с использованием ферментативных гидролизатов (ФГТМГ, ФГКД, ФГМЛР) в качестве стимуляторов роста микроорганизмов, обеспечили интенсивный прирост количества и диаметра колоний лактобактерий, в сравнении с специально предназначенной для культивирования молочнокислых микроорганизмов (МРС-среда), а также с питательной средой универсального назначения (агар Хоттингера). Наилучшими ростовыми качествами, при сохранении морфологических, культу-ральных, биохимических и тинкториальных свойств, обладали модификация МРС-среды со стимулятором роста из тибетского молочного гриба, модификация МРС-среды с ферментативным гидролизатом из каллизии душистой и модификация агара Хоттингера с ФГКД, что подтверждается количеством и диаметром выросших колоний Lbc. plantarum 8Р-АЗ, Lbc. fermentum 90T-C4 и Lbc. acidophilus EP 317/402.

6. Новая капустная среда, приготовленная с использованием в качестве основы ферментативного гидролизата капусты и стимулирующего компонента — ФГ колоний ТМГ и его молочного настоя (1:1) обеспечивает прирост бактериальной массы Lbc. plantarum 8Р-АЗ, Lbc. fermentum 90T-C4 и Lbc. acidophilus EP 317/402. Это подтверждается увеличением диаметра колоний в два раза по сравнению с диаметром колоний лактобактерий на МРС-среде, при сохранении культуральных, морфологических, биохимических и тинкториальных свойств, выращенных микроорганизмов.

7. Экономическая эффективность применения пяти новых питательных сред подсчитанная по коэффициенту рентабельности, выше, чем при использовании МРС-среды и агара Хоттингера, что обусловливает широкие перспективы их производственного и лабораторного использования.

8. Экспериментально установлен выраженный пребиотический, в том числе лактогенный эффект ФГТМГ, ФГКД и ФГМЛР на микрофлору кишечника (при приросте числа лактобактерий на 50%). Все гидролизаты оказывают непосредственное воздействие на молочнокислые бактерии, повышая активность кислотообразования, фенолоустойчивость и устойчивость к поваренной соли, чем обеспечивает высокий антагонистический эффект по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам: Staphylococcus epidermidis, грибам рода Candida, Escherichia coli, Proteus vulgaris.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Модифицированная технология получения ферментативных гидроли-затов из тибетского молочного гриба и каллизии душистой, может использоваться в микробиологическом и биотехнологическом производстве, с целью изготовления гидролизатов с высокими показателями качества и экономически выгодными характеристиками.

2. Новые ферментативные гидролизаты из нетрадиционного сырья природного происхождения (ФГТМГ, ФГКД, ФГМЛР) могут быть использованы в качестве стимулирующих компонентов, как при разработке новых питательных сред, так и с целью улучшения качества уже имеющихся питательных сред для культивирования лактобактерий.

3. Рецептуры новых питательных сред могут быть использованы в лабораторной практике, в диагностических и научных целях для быстрого выявления и идентификации молочнокислых микроорганизмов, для поддержания архивных штаммов, а также на предприятиях микробиологической промышленности, нуждающихся в больших объемах питательных сред и их высоком качестве, необходимом для наращивания бактериальной массы лактобактерий.

4. Результаты влияния ферментативных гидролизатов из тибетского молочного гриба, каллизии душистой и молок лососевых рыб на микрофлору кишечника крыс являются основанием для дальнейшего испытания с целью использования в качестве эффективных препаратов для коррекции микробиоценоза кишечника животных.

5. Материалы диссертационной работы могут быть использованы в научных целях, при составлении учебных и справочных пособий, чтении лекций, ведении лабораторно — практических занятий по курсу микробиологии, биотехнологии.