Полиморфизм органельных ДНК у сортов картофеля, видов рода Solanum секции «ретота» и межвидовых соматических гибридов

Актуальность проблемы Наследование цитоплазматических ДНК при половой гибридизации у большинства видов растений осуществляется однородительски по материнской линии. Такой тип наследования препятствует свободному межвидовому обмену внеядерными генами и существенно ограничивает диапазон изменчивости признаков, кодируемых геномами органелл. В то же время, гены хлоропластной ДНК (хлДНК) и митохондриальной ДНК (мтДНК) участвуют в контроле таких фундаментальных биологических процессов как фотосинтез и клеточное дыхание. Под контролем внеядерных генов находится и ряд селекционно важных признаков, например, цитоплазматическая мужская стерильность и устойчивость к ряду гербицидов. При изучении аллоплазматических линий разных видов растений выявлено влияние геномов органелл на продуктивность, морфогенетические потенции, фертильность, а также на фотосинтетические и респираторные параметры (Даниленко, Давыденко, 2003).

Исследования, направленные на расширение разнообразия цитоплазматических геномов, особенно актуальны для картофеля, большинство изученных сортов которого имеет один и тот же «культурный» тип пластидной и митохондриальной ДНК (Hosaka, 1986; Powell et al., 1993; Loessl et al., 1999). Разработанные к настоящему времени методы клеточной инженерии растений, основанные на слиянии протопластов, устраняют ограничения традиционной половой гибридизации и позволяют получать цитоплазматические гетерозиготы, предоставляя возможности для комбинирования генов хли мтДНК разных видов (Глеба, Ситник, 1984; Waara, Glimelius, 1995; Гавриленко, 2005). Вовлечение в генетические и селекционные программы органельных генов диких видов позволяет создавать принципиально новые формы культурных растений, представляющие интерес как для фундаментальных, так и для прикладных исследований.

Цель работы заключалась в изучении межвидового и внутривидового полиморфизма ряда локусов пластидной и митохондриальной ДНК у видов рода Solarium L. секции Petota Dumort, у селекционных и аборигенных чилийских сортов картофеля, а также в анализе особенностей наследования и реорганизации геномов органелл у межвидовых соматических гибридов.

Задачи работы:

— Исследовать полиморфизм ряда последовательностей хли мтДНК у диких и культурных видов картофеля, а также у отдельных представителей неклубненосных видов рода Solarium.

— Изучить полиморфизм ряда локусов хли мтДНК у селекционных сортов возделываемого картофеля и аборигенных чилийских форм S. tuberosum ssp. tuberosum.

— Определить особенности передачи геномов органелл соматических гибридов картофеля в зависимости от степени филогенетической близости родительских видов и от уровня их плоидности.

— Изучить совместимость ядра и цитоплазмы сортов картофеля и различных диких видов рода Solarium, а также особенности реорганизации органельных геномов у межвидовых соматических гибридов.

Научная новизна Впервые проведено изучение полиморфизма последовательностей пластидного локуса trnD/tmT для 16 видов рода Solarium, а также 4-х локусов мтДНК для 13 видов. Это позволило выявить в изученных мт-локусах новые, ранее не описанные в литературе аллели. Кроме того, новые аллели были выявлены у изученных диких видов картофеля в пластидном локусе atpE. Впервые установлен низкий уровень полиморфизма последовательностей органельной ДНК у сортов картофеля отечественной селекции. Впервые на больших выборках в разных межвидовых комбинациях слияния протопластов статистически достоверно доказаны различия в характере передачи органелл родительских видов у соматических гибридов картофеля: случайное наследование для пластид и неслучайное для митохондрий. Показано отсутствие эффектов несовместимости органелл разных видов, а также эффектов ядерно-цитоплазматической несовместимости у межвидовых соматических гибридов картофеля.

Практическое значение работы При помощи ПЦР со специфичными праймерами выявлены значительные различия органельных геномов ряда видов картофеля, что позволяет рекомендовать данный метод для анализа филогенетических взаимоотношений видов и изучения гибридных линий, полученных методами отдаленной гибридизации, Проведенная нами характеристика цитоплазматического состава сортов отечественной селекции и ряда аборигенных чилийских форм дает дополнительную информацию для генотипирования сортов картофеля и анализа их родословных. Полученные в результате скрещивания межвидовых соматических гибридов с селекционными сортами новые фертильные формы с чужеродной цитоплазмой могут быть использованы для создания аллоплазматических линий картофеля.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на международных научных конференциях, включая: EARP/EUCARPIA Олу, Финляндия, 2003; «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология», Минск, 2004; EARP, Бильбао, Испания, 2005; на III съезде ВОГиС, Москва, 2004; на 14-й конференции FESPB, Краков, Польша, 2004; па 5 Международном совещании по кариологии, кариосистематике и молекулярной систематике растений, С. Петербург, 2005.

Публикации. По результатам работы опубликовано 14 печатных работ, в том числе 4 статьи, 1 статья отослана в печать.

Объем и структура работы Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы, приложение. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста, включает 26 рисунков и 16 таблиц.

Список литературы

включает 237 наименований.

Результаты исследования показали, что пластидная ДНК родительских форм дигаплоидов в большинстве комбинаций (6 из 7) наследовалась случайным образом. Только в одной из комбинаций наблюдалось шестикратное превышение числа гибридов с Т-типом пластид по сравнению с W-типом (Lossl, 1995; Lossl et al., 1994). Среди всех изученных гибридов не было выявлено ни одной формы с рекомбинациями хлДНК (Lossl et al., 1994, 1999, 2000).

Митохондрии родительских форм дигаплоидов у гибридов также распределялись случайным образом, однако митохондриальный состав гибридов оказался более сложным. Были выявлены случаи гетероплазмии и перестроек мтДНК (Lossl et al., 1994, 1999). Независимо от комбинации слияния протопластов эти изменения обычно затрагивали одни и те же локусы — atp6, coxl, rpl2, что позволяло говорить о «горячих» точках рекомбинации в мтДНК картофеля. Более того, последовательности зондов coxl и гр12 оказались высоко гомологичны участкам сайт-специфической рекомбинации молекул мтДНК Petunia hybrida и Nicotiana sylvestris (Lossl et al., 1994, 1999).

Используя маркеры нескольких митохондриальных локусов, авторы смогли показать рекомбинацию между ними: разные участки мтДНК гибриды наследовали от разных родителей (Lossl, 1995). В совокупности перестройки мт геномов того или иного рода были выявлены у 75% соматических гибридов. Было показано, что наличие перестроек в мтДНК отрицательно влияет на хозяйственные характеристики растений. Гибриды с гетерогенными митохондриальными геномами (содержащими от 1 до 4 перестроек) проигрывали гибридам с гомогенными геномами по урожайности и по содержанию крахмала в клубнях (Lossl et al., 1994, 1995). Влияние перестроек на проявление этих признаков усиливалось сочетанием их с определенным типом пластид (Lossl et al., 2000).

Изучение наследования пластидных ДНК у межвидовых соматических гибридов картофеля проводится практически с самого начала исследований по соматической гибридизации пасленовых (Binding et al., 1982; Shepard et al., 1983). Изучение митохондриального состава гибридов осуществлялось значительно реже (Bastia et al., 2001; Lossl et al., 1994, 1995). Вопрос о характере наследования органелл и о ядерно-цитоплазматической совместимости разных видов до сих пор остается открытым, поскольку даже для одних и тех же комбинаций слияния протопластов разные авторы получали противоречивые результаты (Barsby et al., 1984; Pehu et al., 1989). He исключено, что расхождения в результатах разных авторов объясняются небольшим количеством гибридов, проанализированных в каждой отдельной работе. Например, Нови и Хельгесон (Novy, Helgeson, 1994) изучили пластидный состав у 24 гибридов S. etuberosum (+) S. tuberosum, а Вольтер с соавторами (Wolters et al., 1993) — пластидный и митохондриальный состав у 21 межродового гибрида S. tuberosum (+) N. plumbaginifolia. Кроме того, различные исследователи используют для слияния разные формы культурного картофеля и разные образцы диких видовгенетические различия между которыми не могут не влиять на сегрегацию органелл. В нашей работе мы впервые изучили особенности передачи соматическим гибридам картофеля одновременно и пластид, и митохондрий родительских видов на больших выборках в разных межвидовых комбинациях слияния протопластов.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. МАТЕРИАЛЫ.

Материалом для работы послужили дикие и культурные виды картофеля секций Petota, Solatium и Basarthrum, сорта и аборигенные формы культурного картофеля S. tuberosum ssp. tuberosum, а также межвидовые соматические гибриды. В работе были использованы образцы из коллекций ВИРа и Генбанка картофеля GLKS (Гросс Люзевиц, Германия).

3.1. 1. Дикие и культурные виды рода Solatium L.

Объектом исследования послужили виды картофеля, относящиеся к 13-ти сериям секции Petota. Многие виды были представлены несколькими образцами. Всего было изучено 67 образцов 23-х диких и 6-ти культурных видов картофеля, а также по одному образцу видов S. nigrum и S. caripense — представителей отдаленных секций Basarthrum и Solanum. В анализ был включен ряд видов, пластидный состав которых был уже изучен Хосакой при помощи рестрикционного анализа, что обеспечило возможность сравнения результатов. Информация об изученных видах приведена в таблице 5- классификация и геномный состав видов даны согласно Хоксу (Hawkes, 1990).