Нуклеотид-зависимая деградация нуклеиновых кислот ДНК-и РНК-полимеразами

Многие ДНК-полимеразы (ДНКП) помимо функции синтеза ДНК обладают рядом дополнительньк активностей. Все ДНКП способны осуществлять пирофосфоролизреакцию обратную полимеризации. Кроме того, у многих полимераз имеется отдельный экзонуклеазный активный центр, осуществляющий 3'-5'-экзонуклеазную реакцию. Подобная активность описана для прокариотических ДНКП I типа (Joyce and Steitz, 1994) и эукариотических ДНКП 5, е, и С, (полимераза, а обладает такой активностью лишь у некоторых видов) (Михайлов, 1999). ДНКП I прокариот обладают также дополнительной 5'-3'-экзонуклеазной активностью, осуществляемой отдельным активным центром.

Клеточные РНК-полимеразы (РНКП) также способны катализировать реакцию пирофосфоролиза. Кроме этого, они обладают эндонуклеазной активностью, которая существенно стимулируется в присутствии белковых факторов GreA и GreB у прокариот (Borukhov et al., 1993) и TFIIS у эукариот (Reines, 1992; Izban and Luse, 1992). Предполагается, что эндонуклеазное расщепление РНК осуществляется в том же активном центре, что и реакции полимеризации и пирофосфоролиза. Для эукариотической РНКП П описана также экзонуклеазная активность, которая, как и эндонуклеазная стимулируется белковым фактором TFIIS (Wang and Hawley, 1993). Было показано, что фактор-стимулируемая экзонуклеазная активность РНКП II играет важную роль в процессе коррекции синтеза РНК in vitro (Thomas et al., 1998).

Недавно была обнаружена новая реакция, катализируемая различными ДНК-полимеразами. Реакция заключается в выщеплении 3'-концевого нуклеотида растущей цепи ДНК в присутствии относительно высоких концентраций некомплементарных r/dNTP либо r/dNDP (например, величина Кт в этой реакции для гАТР ~ 1.6 мМ), с образованием, соответственно, динуклеозид-5', 5″ -тетраитрифосфатов (Meyer et al., 1998; Sosunov et al., 2000).

Механизм этой реакции, названной нами реакцией псевдопирофосфоролиза, по-видимому, аналогичен механизму реакции пирофосфоролизапри этом в роли пирофосфата выступают а, Р-фосфаты стимулирующего NDP, либо |3,у-фосфаты стимулирующего NTP:

5'-.pNpNpNpN'oH + ppp (r/d)N" 5'-.pNpNpN0H + (r/d)N" -5,-pppp-5'-N* 5'-.pNpNpNpN'oH + pp (r/d)N" 5'-.pNpNpNoH + (r^N'^S'-ppp-S'-N'.

Предполагается, что эта реакция лежит в основе механизма резистентности вируса иммунодефицита человека (HIV) к азидотимидину (AZT) — нуклеозидному ингибитору обратной транскриптазы HIV (HIV RT). Показано (Meyer et al., 1999), что HIV RT, содержащие замены, обусловливающие устойчивость вируса к AZT in vivo, существенно эффективней, чем фермент дикого типа, вьпцепляют 3'-концевой терминирующий остаток AZTMP ДНК-праймера в присутствии высокой концентрации АТР и смеси четырех природных нуклеозидтрифосфатовпри этом происходит разблокирование праймера и продолжение синтеза ДНК.

Кроме этого, роль реакции псевдопирофосфоролиза может заключаться в коррекции синтеза ДНК, что особенно важно для ферментов, не обладающих корректирующей 3'-5'-экзонуклеазной активностью (например, обратные транскриптазы ретровирусов, в том числе и HIV RT, эукариотические ДНКП а, р и другие).

Для РНКП реакция псевдопирофосфоролиза не известна. Поиск подобной реакции для РНКП интересен, особенно с точки зрения возможного ее участия в процессе коррекции синтеза РНК. Поиск и выяснение механизма нуклеотид-зависимой деградации РНК у мультисубъединичной клеточной РНКП Е. coli являлись основной целью настоящей работы. Другой целью данной работы было выяснение, являются ли субстратами для ДНКи РНК-полимераз продукты реакции псевдопирофосфоролизадинуклеозид-55″ -трии тетрафосфаты. tf.

Реакции нуклеотид-зависимой деградации нуклеиновых кислот, катализируемые ДНКи РНК-полимеразами — потенциальные механизмы коррекции синтеза нуклеиновых кислот (обзор литературы).

Точность синтеза ДНК.

Жизненно важным для всех биологических организмов является наличие и поддержание оптимального баланса скорости и точности репликации и транскрипции.

В процессе репликации ДНК в клетках Е. coli одна ошибка обнаруживается на 109-Ю10 нуклеотидов. Хромосома Е. coli имеет размер 4.6×106 п.н., таким образом одна ошибка случается раз в 1000−10 000 актов репликации (для клеток эукариот уровень ошибок при репликации также находится на уровне одна на 109).

Уровень точности полимеризации самой по себе недостаточен для объяснения уровня точности, наблюдаемого в клетках. Так показано, что в экспериментах in vitro ДНКП включают в цепь ДНК один неправильный остаток на каждые 104−105 правильных. Такая точность при синтезе достигается за счет отбора комплементарных субстратов ДНКП, причем отбор происходит как за счет образования прочных водородных связей в случае комплементарных нуклеотидов, так и за счет геометрии канонических комплементарных пар (А=Т, GsC), которая распознается активным центром фермента (последнее продемонстрировано для ДНКП IЕ. coli). Одной из наиболее вероятных причин ошибок является то, что азотистые основания могут находиться в нескольких таутомерных конформациях, что позволяет образовывать прочные водородные связи между неправильными нуклеотидами (рис. I) (Nelson and Сох, 2000). a b с о он он.

O^Sr НО-^Г н н.

Рис. I. Таутомерные формы азотистых оснований нуклеотидов на примере урацила. а. Основная форма при рН 7 — лактам, формы Ь. лактим и с. двойной лактим как правило образуются при более низких значениях рН.

Таким образом, точность синтеза in vivo поддерживается за счет дополнительных энзиматических механизмов. Первым из таких механизмов, присущим теоретически всем ДНКП (см. ниже), может считаться 3'-5'-экзонуклеазная активность, с помощью которой возможно немедленное вьпцепление уже встроившегося в цепь ДНК неправильного нуклеотида. В настоящее время подобная активность описана для прокариотических ДНКПI типа (Joyce and Steitz, 1994), эукариотических ДНКП 8, е, и С, (полимераза, а обладает такой активностью лишь у некоторых видов) (Михайлов, 1999). У этих полимераз имеется отдельный экзонуклеазный активный центр. Показано, что при встраивании в цепь некомплементарного нуклеотида резко замедляется скорость его транслокации из i+1 в /-сайт в активном центре фермента и, тем самым, снижается скорость включения следующего нуклеотида. За это время 3'-конец ДНК перебрасывается из полимеразного активного центра в экзонуклеазный, где и происходит выщепление неправильно встроившегося нуклеотида. Экзонуклеаз ная активность высокоспецифична по отношению к неправильным нуклеотидам. Следует заметить, что эта реакция не является, строго говоря, обратной реакции синтеза, т.к. в ней не принимает участие пирофосфат. Благодаря наличию экзонуклеазной корректирующей активности точность синтеза ДНК повышается в.

ЮМ О* раз. Таким образом, выбор нуклеотида самой полимеразой вместе с корректирующей экзонуклеазной активностью способны обеспечить точность синтеза ДНК лишь на уровне один неправильный на 106−108 включенных нуклеотидов, что существенно меньше, чем частота ошибок, наблюдаемая в клетках.

Дополнительная точность синтеза ДНК в процессе репликации достигается за счет работы отдельных ферментативных систем, осуществляющих репарацию (коррекцию) ДНК уже после ее синтеза (подробнее про систему репарации см. Сойфер, 1997; Friedberg, 2003; Nelson and Сох, 2000).

Возможны ли еще какие-либо механизмы коррекции синтеза ДНК? Потенциально таким механизмом может считаться недавно обнаруженная реакция, катализируемая различными ДНКП. Реакция заключается в вьпцеплении З'-концевого нуклеотида растущей цепи ДНК в присутствии относительно высоких концентраций некомплементарных r/dNTPs либо r/dNDPs (например, в случае HTV RT величина Кт (гАТР) в этой реакции оказалась равной 1.6 мМ) с образованием соответственно динуклеозид-5', 5″ -тетраитрифосфатов (Meyer et al., 1998; Sosunov et al., 2000).

Механизм данной реакции, названной нами реакцией псевдопирофосфоролиза, по-видимому, аналогичен механизму реакции пирофосфоролиза, при этом в роли пирофосфата выступают а, р-фосфаты стимулирующего NDP, либо р, у-фосфаты стимулирующего NTP:

5.pNpNpNpN'oH + ppp (r/d)N" -> 5'-.pNpNpN0H + (r/dJN'^pppp-S'-N* 5. pNpNpNpN'oH + pp (r/d)N" -> 5'-.pNpNpN0H + (r/d)N" -5,-ppp-5,-N'.

4 Было показано, что комплементарный нуклеозидтрифосфат подавляет эту реакцию.

К-, ~ 5 мкМ). Ингибирование реакции происходит даже в случае, когда комплементарный нуклеотид не встраивается в цепь ДНК (в работе использовался терминированный остатком ddAMP праймер) (Meyer et al., 1998). Эти данные свидетельствуют о том, что реакция псевдопирофосфоролиза, как и реакция пирофосфоролиза, осуществляется из положения, когда З'-конец ДНК-праймера занимает /+/- сайт в активном центре фермента (комплементарный dNTP также связывается в этом сайте, вытесняя 3'-концевой нуклеотид в z'-сайт, за счет чего, вероятно, и происходит ингибирование).

О том, что реакция псевдопирофосфоролиза осуществляется именно полимеразным активным центром говорит и то, что в случае HIV RT эта реакция и реакция полимеризации приблизительно в равной степени ингибируются (1С5о= 9мкМ для псевдопирофосфоролиза, IC50 = 18.5±4.5 для РНК-зависимого синтеза ДНК) соединением С1 -ПВО [(+)-S-4,5,6,7-тетрагидро-9-хлор-5-метил-6-(3-метил-2-бутенил)-4 имидо[4,5,1-ол][1,4]-бензодиазепин-2(1Н)-тион], которое, как было показано в работе.

Debyser et al., 1991), является высокоспецифичным ненуклеозидным ингибитором ДНК-полимеризующей активности HIV RT. Кроме того, обе эти реакции оказались чувствительными к заменам каталитических аспартатов в полимеразном активном центре * HIV RT (D185N/D186N). Так, у такого мутанта скорость полимеризации падает в 4×104 раз, скорость псевдопирофосфоролиза — в 3.3×103 раз. В качестве контроля было определено влияние этих мутаций на активность РНКазы Н, которая катализируется отдельным активным центром в составе RT. Как и ожидалось, влияние этих замен на активный центр, ответственный за активность РНКазы Н, оказалось минимальным (скорость этой реакции для мутанта лишь в 2 раза ниже скорости для фермента дикого типа) (Meyer et al., 1998).

Для HIV RT показано, что субстратами, способными осуществлять псевдопирофосфоролиз, могут служить природные r/dNTP, r/dNDP, а также ddGTP (Meyer > et al., 1998). Кинетические параметры для этой реакции, катализиуемой HIV RT в присутствии различных нуклеозидди-, и трифосфатов, приведены в таблице 1 (Meyer et al., 1998).

Как видно из табл. I, величины Кт для стимулирующих нуклеозидтрифосфатов приблизительно одинаковы. Для АТР эта величина сопоставима с его концентрацией ^ внутри клетки — более 4 мМ (Gamberucci et al, 1994), что позволяет сделать важнейший вывод о возможности существования реакции псевдопирофосфоролиза in vivo.

Таблица I. Кинетические параметры различных субстратов в реакции псевдопирофосфоролиза, катализируемой HIR RT.

Нуклеотид kcat, S Km, MM kca,/Km, S^M-1.

АТР 0.42×10* 1.6 0.26.

ADP 0.28×10″ J 2.0 0.14 dATP 0.27×10* 1.6 0.17.

СТР 1.2×10* 3.1 0.39 dCTP 1.1×10* 3.9 0.29.

GTP 1.5×10* 4.3 0.35 dGTP 0.08×10* 0.74 0.11 ddGTP 0.3×10* 1.1 0.27.

UTP 0.46×10* 2.0 0.23.

Что касается других ДНКП в отношении реакции псевдопирофосфоролиза, то для ДНКПIЕ. coli (KF) и AMV RT на гетерогенном ДНК-ДНК праймер-матричном комплексе только неприродные p-Z-нуклеозидтрифосфаты оказались способными катализировать эту реакцию (Sosunov et al., 2000). В работе (Meyer et al., 1998), однако, AMV RT и M-MuLV RT оказались способными катализировать реакцию псевдопирофосфоролиза в присутствии природных нуклеотидов, хотя гораздо менее эффективно, чем HIV RT (табл. II). Обратная транскриптаза вируса гепатита В уток (DHBV RT) оказалась не способной катализировать реакцию псевдопирофосфоролиза как в присутствии больших (5 мМ) концентраций природных нуклеозидтрифосфатов, так и в присутствии аналогов пирофосфата — фосфоноацетата (РАА) и фосфоноформиата (PFA) (Urban et al., 2001).

Таблица II. Кинетические параметры синтеза Gp4ddA в присутствии GTP и ДНК-ДНК праймер-матричного комплекса, терминированного по 3'-концу праймера остатком ddAMP, различными обратными транскриптазами при 37 °C (для AMY RT при 42°С).

Фермент kcat, S Km, мМ kcat/Km, s'^M'1.

HIV RT 1.5×10* 4.3 0.35.

AMV RT 0.052×10* 5.7 0.009.

M-MuLV RT 0.023×10* 9 0.003.

Таким образом, из всех изученных ДНК-полимераз HIV RT существенно эффективнее катализирует эту реакцию.

Изучение этой реакции особенно актуально для ферментов, не обладающих 3−5'-экзонуклеазной активностью. Кроме того, существуют вопросы прикладного характера, в частности, проблема механизма резистентности HIV к нуклеозидным ингибиторам HIV.

RT. Именно этому посвящены практически все имеющиеся на данный момент работы по этой теме.

Реакция псевдопирофосфоролиза как основа механизма устойчивости HIV RT к нуклеозидным ингибиторам.

Самым известным и широко применяемым препаратом, используемым в борьбе с ВИЧ-инфекцией, является З'-азидо-З'-дезокситимидин (AZT), который, попадая в клетку, фосфорилируется до трифосфата (AZTTP). AZTTP, действуя как терминирующий субстрат, является эффективным ингибитором синтеза вирусной ДНК, катализируемого HIV RT. Кроме этого, AZTTP является конкурентным ингибитором HIV RT по отношению к dTTP. При длительном использовании AZT у пациентов обнаруживаются устойчивые к этому препарату вирусные изоляты. Высокая устойчивость вирусов к AZT коррелирует с несколькими мутациями в HIV RT: D67N, K70R, T215F/Y и K219Q (Larder and Kemp, 1989) и, иногда, M41L (Kellam et al., 1992). Кроме того, одновременно с этими мутациями часто встречается замена L210W, которая резко усиливает устойчивость вируса к AZT. Сама по себе мутация L210W не вызывает устойчивости (Hooker et al., 1996).

Вирусы, содержащие обратную транскриптазу с мутациями по четырем аминокислотным остаткам (D67N, K70R, T215F/Y и K219Q) (здесь и далее такая полимераза будет обозначаться HIV RT (67/70/2i5/2i9)), в экспериментах с культурами клеток оказываются более чем в 120 раз менее чувствительными к AZT, чем вирусы, содержащие RT дикого типа (Kellam et al., 1992). Кинетический анализ HIV RT (67/70/2is/2i9) и полимеразы дикого типа HIV RT (wt), проведенный для реакции удлинения ДНК-праймера in vitro, демонстрирует, что кинетические параметры для этих ферментов либо не отличаются, либо отличаются незначительно. Что касается избирательности этих ферментов по отношению к AZTTP, то и в этом случае разница между мутантной полимеразой и ферментом дикого типа оказалась небольшой. Так в работе (Carroll et al, 1994) демонстрируется, что в различных праймер-матричных системах (три разных комплекса РНК-ДНК и два комплекса ДНК-ДНК) отношение эффективностей включения AZTTP для RT (67/70/215/219) и RT (wt) составляет лишь 0.77±0.03. В этой работе последовательность РНКи ДНК-матриц соответствовала участку геномной РНК HIV. В другой работе (Pokholok et al., 1993) для тестирования были использованы три различных праймер-матричных комплекса: поли (гА)-олиго (dT), ДНК-ДНК, и РНК-ДНК (последовательность матричных полинуклеотидов не соответствовала геномной последовательности вируса). Наиболее существенное различие между мутантным ферментом и ферментом дикого типа по отношению к AZTTP наблюдалось в случае, когда матрицей для синтеза служила РНК. Константы ингибирования для AZTTP в этом случае различались более чем в 10 раз (для двух других праймер-матричных комплексов константы различались в 3 раза). В работе (Kerr and Anderson, 1997) также было продемонстрировано, что избирательность к AZZTP для RT (67/70/2i5/2i9) и RT (wt) более выражена на РНК-ДНК гетеродуплексе. Так в случае гетеродуплекса наблюдалось 4-х кратное уменьшение чувствительности мутантной полимеразы к AZTTP (скорость включения остатка AZTMP была снижена в 1.5 раза, IQ в 2.5 разапод чувствительностью понимается отношение скорости к K.

Таким образом, даже самое большое из описанных в литературе значений разницы в чувствительности к AZTTP для мутантной RT и фермента дикого типа — в 10 раз, только для РНК-ДНК гетеродуплекса (Pokholok et al., 1993) не может объяснить более чем 120-кратного различия, наблюдаемого для этих ферментов in vivo. Другими словами, в основе молекулярного механизма устойчивости мутантных RT к AZT лежит нечто иное, нежели изменение чувствительности мутантов к ATZTP в процессе элонгации.

Появилась идея о том, что резистентность вирусов, содержащих мутантные обратные транскриптазы, к некоторым нуклеозидным аналогам, в частности к AZT, может объясняться повышенной способностью этих ферментов по сравнению с ферментом дикого типа удалять уже встроившийся в цепь ДНК терминирующий нуклеозидный остаток при помощи обратных синтезу реакцийпирофосфоролиза и псевдопирофосфоролиза.

Идея о том, что именно обратные реакции могут лежать в основе механизма резистентности мутантных RT к AZT подкрепляется еще и данными о стабильности двойного элонгационного комплекса фермент/праймер-матрица для мутанта RT (67/70/215/219) и фермента дикого типа (Canard et al., 1998). Показано, что связывание праймерматричных комплексов, содержащих на 3'-конце праймера как природный нуклеозидмонофосфат, так и терминирующий остаток AZTMP, происходит с приблизительно одинаковыми константами для RT (67/70/2is/2i9) и RT (wt). При этом природа матрицы (ДНК или РНК) оказалась не важна. Разница между мутантным ферментом и полимеразой дикого типа выявляется на стадии распада двойного элонгационного комплекса. Показано, что распад нетерминированных праймер-матричных комплексов с ферментом (WT и мутант) представляет собой двухстадийный процесс. Первая стадия на 1.5−2.5 порядка быстрее второйна более быстрой первой стадии разрушается в случае фермента дикого типа около 75% исходного комплекса, в случае мутантной полимеразыоколо 40%. Наличие на 3'-конце праймера остатка AZTMP в случае, когда матрицей служит ДНК, делает для мутанта этот процесс одностадийным, с константой, приблизительно равной константе второй (медленной) стадии в случае распада такого же комплекса для фермента дикого типа. Демонстрируется, что комплекс RT/матрица (ДНК)-праймер (терминированный по 3'-концу AZTMP) в 25 раз более стабилен для мутантной полимеразы RT (67/70/2is/2i9), чем для RT (wi> Благодаря этому в случае мутантной полимеразы такой комплекс теоретически должен быть более чувствительным к обратным реакциям. Это согласуется с данными о том, что мутантный фермент обладает более высокой процессивностью, чем фермент дикого типа. В работе (Caliendo et al, 1996) на гетерополимерном РНК-ДНК комплексе — в 5−10 раз, в работе (Arion et al., 1998) на гомомополимерных РНК-ДНК и ДНК-ДНК комплексах — в 2 раза.

До открытия реакции псевдопирофосфоролиза в качестве возможного механизма резистентности мутантов к AZT рассматривалась реакция пирофосфоролиза.

Сразу следует отметить, что сам по себе пирофосфоролиз имеет крайне низкую эффективность для HIV RT дикого типа (Reardon, 1993), см. табл. III.

Таблица III. Кинетические параметры реакции пирофосфоролиза, катализируемой HIV RT дикого типа для трех различных праймер-матричных комплексов.

Константа ДНК-ДНК РНК-ДНК РНК-ДНК (3'-AZTMP).

Kd (ppi), мМ 1.5±0.1 3.5±0.4 2.3±0.2 круто" S 0.051 0.30 0.033.

Для сравнения, в случае элонгации на ДНК-ДНК праймер-матричном комплексе Kpoi составляет 0.68 s'1, K.

В работе (Carroll et al, 1994) впервые экспериментально была проверена гипотеза о том, способен ли резистентный к AZT мутант более эффективно выщеплять остаток AZTMP из терминированного праймера в присутствии пирофосфата. Работа проводилась на РНК-ДНК праймер-матричном комплексе. Показано, что в присутствии физиологических концентраций пирофосфата (110−150 мкМ) для HIV RT дикого типа скорость вьпцепления остатка AZTMP из 3'-конца праймера крайне низка (отношение kcat/Km=3.4 M’V1), что согласуется с данными (Reardon, 1993). В случае же устойчивого к AZT мутанта RT (67/70/2i 5/219) уровень вьпцепления остатка AZTTP в такой же системе оказался не выше, как ожидалось, а ниже, чем для фермента дикого типа (отношение kcat/Km=1.5 M’V1), что согласуется с данными, полученными позднее (Meyer et al., 1999; Boyer et al., 2001)..

В другой работе (Arion et al., 1998) приводятся несколько отличные данные о пирофосфоролизе для ферментов дикого типа и AZT-резистентных мутантов. В работе использовался гетерополимерный РНК-ДНК праймер-матричный комплекс, последовательность РНК-матрицы которого соответствовала последовательности участка вирусной РНК, а последовательность ДНК-праймера была комплементарна участку связывания инициирующего синтез вирусной ДНК in vivo tRNALys3-npafiMepa..

В табл. IV приведены времена полупревращения терминированного AZTMP праймера в присутствии физиологической концентрации пирофосфата (125 мкМ). Следует отметить, что сходные результаты были получены и для нетерминированного праймера. Таким образом, демонстрируется, что скорость пирофосфоролиза при физиологической концентрации пирофосфата для мутантных полимераз (кроме RT (t2 15F/K219Q)) в 2−4 раза выше, чем для фермента дикого типа..

Количество терминированных ДНК-продуктов при синтезе в присутствии AZTTP уменьшается при добавлении пирофосфата. Как видно из табл. 4, терминация синтеза ДНК в присутствии физиологических концентраций PPi для мутантных ферментов происходит менее эффективно, чем для фермента дикого типа..

Таблица IV. Времена полупревращения (tj/г) AZTMP-терминированного праймера в РНК-ДНК праймер-матричном комплексе в присутствии 125 мкМ PPjвлияние 150 мкМ PPj на терминацию праймера в присутствии AZTTP* и влияние различных концентраций PPj на ингибирование синтеза ДНК в присутствии AZTTP для RT дикого типа и резистентных к AZT мутантов.

Параметр [PPi], мкМ WT 67/70/215/219 D67N/K70R T215F/K219Q ti/2, МИН 125 105 40 25 105 терминации в присутствии AZTTP* 150 78 48 38 60.

1С50 для AZTTP при ингиб. синтеза ДНК**, (нМ) 0 33±3 29±7 43±15 36±2.

150 46±5 83 ±9 93 ±8 68±12.

500 100+10 280±55 270±38 167±30 при синтезе ДНК в присутствии четырех dNTP (8.7 мкМ каждый) и 1 мкМ AZTTP образуются терминированные ДНК-продукты различной длины. В таблице приведено отношение количества одного из таких продуктов, образующегося в присутствии 150 мкМ PPj, к количеству этого же продукта, образующегося в отсутствие PPi. в присутствии различных концентраций PPi не изменяется величина Кт для dTTP, а также уровень ингибирования синтеза ДНК в присутствии ddCTP и ddGTP..

Константы ингибирования (IC50) AZTTP синтеза ДНК в отсутствие PPj приблизительно одинаковы для всех мутантных ферментов и фермента дикого типа и равны 30−40 нМ, что согласуется с данными (Lacey et al., 1992). В присутствии же 150 мкМ пирофосфата, IC50 для AZTTP различаются для фермента дикого типа и мутантов RT (67/70/2is/219) и RT (d67N/k70R) в два раза (~45 и ~90 нМ, соответственно). Причем этот эффект специфичен по отношению именно к AZTMP, т.к. константы ингибирования в этой же системе для ddCTP и ddGTP одинаковы как в присутсвии, так и в отсутствие пирофосфата..

Данные этой работы демонстрируют также то, что двойная мутация T215F/K219Q не приводит к каким-либо ощутимым изменениям в реакции пирофосфоролиза по сравнению с ферментом дикого типа, хотя именно этот мутант, как впрочем и RT (67/70/215/219), обладает большей процессивностью при синтезе ДНК, чем остальные мутанты и RT (wt), что говорит о более стабильном двойном элонгационном комплексе фермент/праймер-матрица. С другой стороны, мутант D67N/K70R обладает такой же процессивностью, как и фермент дикого типа (в 1.5−3 раза ниже, чем у мутантов RT (T215F/K219Q) и RT (67/70/2is/219)), но имеет такие же параметры в реакции пирофосфоролиза, как и RT (67/70/2i5/2i9>- Из этого можно сделать вывод, что высокую процессивность «суммарного» мутанта объясняет наличие замен T215F/K219Q, а избирательность к остатку AZTMP на 3'-конце праймера при пирофосфоролизе и более высокий ее уровень — замены D67N/K70R..

Подытоживая данные по пирофосфоролизу как потенциальному механизму, объясняющему устойчивость мутантов к AZT, можно заключить, что эта реакция, по-видимому, не может лежать в основе этого механизма. В литературе присутствуют противоположные данные, касающиеся этого вопроса. Но даже по самым «оптимистическим» данным (Arion et al., 1998) при физиологических концентрациях пирофосфата вклад пирофосфоролиза в резистентность мутантных полимераз к AZT невелик — лишь двукратное увеличение резистентности по сравнению с ферментом дикого типа..

Таким образом, вклад пирофосфоролиза (двукратный) в резистентность мутантных полимераз к AZT в сумме с разницей в чувствительности к AZTTP (не более чем 10-кратная) не могут объяснить более чем 120-кратной устойчивости мутантной RT к AZT по сравнению с ферментом дикого типа, наблюдаемой in vivo. Другими словами, в основе механизма устойчивости мутантных полимераз к AZT, по-видимому, лежит нечто иное..

Открытие реакции псевдопирофосфоролиза послужило сильным толчком к дальнейшему изучению этого механизма. Действительно, в целом ряде работ было продемонстрировано, что эта реакция может лежать в основе механизма резистентности HIV к нуклеозидным ингибиторам HIV RT..

В первой работе, посвященной изучению этой темы (Meyer et al., 1999), показано, что мутант RT (67/7o/2i5/219) существенно эффективней, чем фермент дикого типа вьпцепляет 3'-концевой остаток AZTMP ДНК-праймера в присутствии высокой концентрации АТР и смеси четырех природных нуклеозидтрифосфатов, что позволяет ферменту продолжить синтез ДНК (происходит разблокирование и продолжение синтеза ДНК) (рис. ПА)..

Количественная оценка результатов, приведенных на рис. ПА, показывает, что в присутствии 3.2 мМ АТР разблокирование и удлинение терминированных AZTMP праймеров мутантной полимеразой RT (67/70/2i5/2i9) происходит в 25−75 раз более эффективно, чем RT (wt) (элонгируются 12−15% и 0.2−0.5% терминированных праймеров, соответственно)..

В случае праймера, терминированного остатком ddAMP, RT (67/70/2i5/2i9) и RT (wt) оказались не способными разблокировать праймер в присутствии смеси четырех природных dNTP и ddATP (рис. ПВ)..

M dNTPs + AZTTP -/+ ATP.

1 23 456 789 1 011 121 314 59−70 { -«MB.

31 -25 В dNTPs + ddATP -/+ ATP iiM dNTPs RT.

0 1 10 -looj 1 10 100 — ATP I + ATP WT.

I 1 1010o| 1.

-ATP I +,.

10 100 ATP 67/70/215/219.

Рис, II. Реакция удлинения праймера мутантной полимеразой RT (67/70/215/2)9> и полимеразой дикого типа в присутствии термииирующих нуклеозидтрифосфатов. А. Реакция удлинения праймера в присутствии четырех dNTP, AZTTP (dTTP/AZTTP = 1 -2) и либо в присутствии, либо в отсутствие 3.2 мМ АТР. В. так же как в А. за исключением того, что AZTTP заменен на ddATP (dATP/ddATP = 1:8).

Однако синтез Ap4ddA в сходной системе, но в отсутствие природных dNTP (в реакционной смеси содержались только 3'-терминированный ДНК-праймер/ДНК-матрипа, фермент и АТР), осуществляется полимеразой RT (wt> и различными мутантами, причем более эффективно, чем синтез Ap4AZT в аналогичной ''простой" системе (см. табл. V). Более того, влияние мутаций с этой системе больше сказывается на синтезе Ap4ddA, чем Ap4AZT (скорость синтеза Ap4ddA для RT (67/70/2i5/219) выше примерно в 10 раз, чем для RT (wr>, в случае синтеза Ap4AZT — примерно в 5 раз)..

Таблица V. Кинетические параметры синтеза и ингибирования синтеза Ap^AZT и Ap4ddA в присутствии терминированного праймер-матричного комплекса и АТР (данные Meyer et al 1999).

Фермент 3'-AZTMP-те праймер/ ДН рмииированный < матрица З'^АМР-терминированпый праймер/ ДНК матрица синтез Ap4AZT, s-V Ингибирование синтеза Ap4AZT следующим комплементарным нуклеотидом IC50, мкМ синтез Ap4ddA, kcat/Knij s-'M" 1 Ингибирование синтеза Ap4ddA следующим комплементарным нуклеотидом IC50, мкМ.

WT 0.11 ±0.01 I10±40 0.26±0.02 4.311.3.

67/70/215 °F /219 0.58±0.06 230±40 2.410.3 1211.5.

67/70 0.44±0.01 120 120 1.210.1 8.211.8.

215/219 0.17±0.02 370±70 0.5610.01 2114.3.

25 tiM dNTPs.

RT.

0 1 10100J1 10 100 -ATP I + ATP WT.

1 1 010 011 1 010 010 — ATP I + ATP I 67/70/215/219.

Примечание к табл. V. В работе (Meyer et al, 2002) приводятся аналогичные кинетические параметры, полученные в той же экспериментальной системе. Однако абсолютные значения величин, приведенных в этой работе, примерно в 2 раза ниже приведенных в табл. 5 (Meyer et al., 1999). Относительные значения величин в этих двух работах совпадают. По данным (Meyer et al, 2002) величина kcat/Km для мутанта М41L для синтеза Ap4AZT и Ap4ddA оказалась в 1.7 и в 1.3 раза выше, для Т215 Y — в 2.3 и 3.9, для 41L/215Y-b 3.3 и 9.0, для 67/70/215/219Y-b 10 и 16 раз выше, чем для WT..

Наблюдается несоответствие, которое заключается в том, что в отсутствие (табл. V) и в присутствии природных dNTP (рис. II) наблюдаются противоположные эффекты, а именно, в отсутствие природных трифосфатов остаток ddAMP из 3'-конца праймера вьпцепляется более эффективно, чем остаток AZTMP, тогда как в присутствии трифосфатов эффекта разблокирования терминированных остатком ddAMP праймеров не наблюдается совсем, в то время как для AZTMP-терминированных праймеров этот эффект хорошо выражен..

Объяснением этого несоответствия, вероятно, является то, что ингибирование синтеза Ap4AZT происходит при существенно более высоких концентрациях следующего. комплементарного NTP, чем в случае синтеза Ap4ddA (табл. V). Так, если IC50 для синтеза AP4AZT составляет 110±40 мкМ, то для синтеза Ap4ddA лишь 4.3±1.3 мкМ (данные для полимеразы дикого типа). Учитывая, что физиологическая концентрация dNTP в клетках составляет 0.14−5.6 мкМ в покоящихся лимфоцитах (Roy et al., 1999; Terai and Carson, 1991; Gao et al., 1993; 1994), 2.4−26 мкМ в митоген-стимулируемых лимфоцитах (Gao et al., 1993;1994), 15−170 мкМ в СЕМ-лимфобластах (Т-лимфобластах человека) (Roy et al., 1999; Terai and Carson, 1991), становится очевидным, что in vivo эффективность вьпцепления остатка AZTMP должна быть существенно выше, чем ddAMP..

Механизм ингибирования следующим комплементарным нуклеотидом заключается в том, что этот нуклеотид, связываясь с /+/-сайтом в активном центре полимеразы, вытесняет 3'-концевой нуклеотид праймера в /-сайт, в то время как реакция псевдопирофосфоролиза, как и пирофосфоролиза, осуществляется только тогда, когда 3'-концевой нуклеотид праймера занимает /+/-сайт. При этом образуется стабильный (стабилен в условиях не денатурирующего электрофореза) «закрытый» элонгационный комплекс («dead-end» комплекс, DEC), не способный ни к элонгации, ни к обратным реакциям (Tong et al., 1997; Meyer et al., 1999)..

Отметим, что З'-концевые остатки ddTMP, djTMP, так же как ddAMP и AZTMP, более эффективно вьпцепляются в присутствии АТР мутантной RT (67/70/215/219)" чем полимеразой дикого типа — в 5−7 и 3−4 раза, соответственно (в присутствии PPj мутант менее эффективен, чем RT (wd) (Meyer et al., 2000). При этом ингибирование следующим комплементарным dNTP, так же как для ddAMP, в случае вьпцепления ddTMP и сЦТМР происходит при низких концентрация трифосфата (1С5о=2.6±0.2 и 0.51±0.07 мкМ, соответственно)..

Объяснить высокие значения IC50 для синтеза AP4AZT, по сравнению с Ap4ddA, Ap4ddT и Ap4d4T можно тем, что в случае AZTMP-терминированного праймера нарушается либо транслокация З'-остатка AZTMP из /+/ в /-сайт или/и тем, что 3'-концевой остаток AZTMP, находясь в i-сайте, каким-то образом мешает связыванию комплементарного dNTP в /+/-сайте и, соответсвенно, образованию DEC. По модели, предложенной в (Воуег et al., 2001; Sarafianos et al., 2002), оказалось, что и то и другое может иметь место (см. ниже)..

В табл. V приведены также данные для мутантных полимераз, содержащих двойные замены D67N/K70R и T215F/K219Q. Из этих данных следует, что RT (67/70) и RT (67/70/215/219) приблизительно С одинэковой эффвКТИВНОСТЬЮ синтезируют Ap4ddA и AP4AZT (в 4−10 раз эффективнее, чем RT (wt)), тогда как RT (2i5/2i9) лишь в 1.5−2 раза отличается по этому параметру от RT (wi> Данные по RT (67/70) согласуются с данными о том, что эти замены способствуют более эффективному вьпцеплению З'-концевого остатка AZTMP при пирофосфоролизе по сравнению с RT (wt) (Arion et al., 1998)..

С другой стороны, замены T215F/K219Q гораздо существеннее, чем D67N/K70R, сказываются на ингибировании синтеза r/dNp4dN' следующим комплементарным нуклеотидом (требуются большие концентрации dNTP, чем для RT (6?/70) и RT (wt)), хотя, как известно (Arion et al., 1998; Caliendo et al., 1996), полимеразы, содержащие такие замены, более прочно связывают праймер-матричный комплекс, что должно, наоборот, способствовать образованию «dead-end''-комплексов. Таким образом, эти остатки, вероятно, вовлечены в связывание входящего комплементарного dNTP в /+/-сайте..

Для объяснения влияния мутаций на вьнцепление остатка AZTMP из З'-конца праймера на основе известной трехмерной структуры тройного элонгационного комплекса ЯТ/матрица-праймерМКТР (Huang et al., 1998) была построена структурная модель (Воуег et al., 2001) активного центра мутантной HIV RT (4i/7o/2io/2i5) в присутствии пирофосфата и некомплементарного АТР (рис. III). При построении модели З'-концевой остаток праймера (AZMTP) был помещен в /+/-сайт в активном центре полимеразы. ри у-фосфаты стимулирующего АТР в случае псевдопирофосфоролиза (и пирофосфат в случае пирофосфоролиза) расположены так же, как а-, р-фосфаты входящего dNTP в исходной структуре (Huang et al., 1998)..

Рис. MI. Структурная модель активного центра мутантной HIV RT (41 70 710,215) в присутствии некомплементарного АТР, стимулирующего псевдопирофосфоролнз Желтым цветом выделены аминокислотные остатки, вовлеченные в связывание АТР и имеющие отношение к устойчивости к AZT. Замененные аминокислотные остатки, моделирующие мутационные замены M41L, K70R, L210W и T215Y, подписаны черным цветом (Воуег et al., 2001).

Основное, что следует из модели — это то, что аминокислотные остатки, замены в которых приводят к резистентности вируса к AZT, располагаются не в районе связывания З'-концевого остатка ираймера (в данном случае AZTMP), а в районе связывания стимулирующей выщепление молекулы NTP. Таким образом, очевидно, что мутации приводят к более прочному связыванию стимулирующего трифосфата, что способствует ускорению реакции псевдопирофосфоролиза. Эти данные согласуются с экспериментальными данными о том, что в простой системе, в которой содержатся только терминированный элонгационный комплекс и стимулирующий NTP, скорость выщепления З'-концевого остатка для мутантной полимеразы RT^/Toaisois) всегда выше, чем для RT (wt) и, кроме того, эта скорость практически не зависит от природы З'-концевого остатка (табл. V) (Воуег et aL 2001)..

Из модели следует, что аминокислотный остаток F/Y215 в мутантной полимеразе может напрямую образовывать гидрофобный контакт с азотистым основанием стимулирующего АТР и тем самым способствовать более прочному его связыванию. В полимеразе дикого типа в этом положении находится треонин, который не способен образовывать подобные контакты. В пользу существования этого контакта в мутантной полимеразе говорят и экспериментальные данные (Meyer et al., 2002). Показано, во-первых, что в случае, когда стимулирующим является нуклеозиддифосфат, разница в скорости выщепления терминирующего остатка праймера нивелируется для мутантов и RT (wdпри этом по модели (см. рис. П1) азотистое основание дифосфата не достает до остатка 215 Y/F. Во-вторых, когда азотистым основанием у стимулирующего нуклеозидтрифосфата является дигидро-производное обычного основания, разница между мутантами и WT так же нивелируется и, кроме этого, резко снижаются абсолютные величины скоростей. Дигидро-производное — это неароматическое соединение, не имеющее тг-орбитального кольца, и, соответственно, не способное образовывать гидрофобные стэкинг-взаимодействия (л-л-контакты) (табл. VI). В третьих, как и следует из модели, пурины стимулируют выщепления 3'-концевого остатка лучше пиримидинов, благодаря способности образовывать более прочные стэкинг-взаимодействия (Saenger, 1984). И, в четвертых, введение метальной группы в основание стимулирующего трифосфата увеличивает эффективность выщепления 3'-концевого остатка праймера мутантными полимеразами, но не полимеразой дикого типа. Известно, что метилированные основания образуют более прочные я-я-межорбитальные контакты (Saenger, 1984; Broom et al, 1967)..

Таблица VI. Кинетические параметры реакции выщепления 3'-концевого остатка ddAMP в присутствии различных субстратов для мутантаых HIV RT и полимеразы дикого типа.

Фермент kcat/Кщ.

АТР Ме-АТР UTP UDP 5,6-дигидро UTP Me-UTP.

WT 0.21 ±0.04 0.22+0.02 0.1910.01 0.3210.04 0.5 610.008 0.1710.08.

T215Y 0.82±0.06 1.3±0.3 0.4210.10 0.23+0.01 0.056+0.003 0.5910.08.

67/70/215Y/219 3.3±0.6 4.6+2.3 1.4+0.1 0.5110.01 0.1910.01 1.610.6.

Замена L210W, как показано в (Hooker et al., 1996), усиливает резистентность вируса к AZT только при наличии других мутаций, одна из которых всегда T215Y/F. В работе (Hooker et al., 1996) уже было высказано предположение о том, что боковая группа триптофана 210, содержащая два ароматических кольца, может контактировать с фенильным кольцом тирозина или фенилаланина 215. В предлагаемой модели (рис. 1П) также высказывается подобное предположение. Предполагается, что W210 может стабилизировать тирозин/фенилаланин (215Y/F) в положении, при котором усиливается его взаимодействие с азотистым основанием стимулирующего NTP..

Замена положительно заряженного остатка лизина К70 (контактирующего с у-фосфатом входящего нуклеотида и, соответственно, а-фосфатом стимулирующего NTP) на положительно же заряженный остаток аргинина K70R приводит к ускорению реакции псевдопирофосфоролиза, вероятно, за счет усиления связывания а-фосфата NTP более объемным остатком аргинина..

Аминокислотные остатки D67 и К219 в ферменте дикого типа, как показано на рис. 3, могут образовывать солевой контакт (мостик) друг с другом, который, возможно, мешает связыванию с ферментом трифосфатной группы стимулирующего NTP (а также пирофосфата при пирофосфоролизе). Замены D67N (при замене исчезает отрицательный заряд) и К219Q (исчезает положительной заряд) приводят к разрушению этого солевого контакта и, вероятно, к усилению связывания стимулирующего NTP или PPj..

Как уже сказано выше, важнейшим параметром реакции псевдопирофосфоролиза является ее ингибирование следующим комплементарным dNTP, при котором образуется стабильный закрытый элонгационный комплекс (DEC). В случае, когда на 3'-конце праймера находится остаток AZTMP, ингибирование происходит при существенно более высокой концентрации комплементарного dNTP, чем когда праймер терминирован остатком ddAMP. Таким образом, в случае 3' -AZTMP-терминированного праймера нарушается либо транслокация этого остатка из /+/-сайта в /-сайт, либо связывание комплементарного dNTP, когда 3'-конец находится в /-сайте..

В той же работе (Boyer et al., 2001) на основе трехмерной структуры тройного элонгационного комплекса (Huang et al., 1998) была построена модель активного центра HIV RT, в котором 3'-конец AZTMP-терминированного праймера расположен в /-сайте. Из этой модели следует, что азидогруппа 3'-концевого остатка AZTMP, находящегося в /сайте, стерически перекрывается с боковой цепью аминокислотного остатка D185 — одного из аспартатов каталитической триады, а также с а-фосфатом входящего комплементарного dNTP. Первое свидетельствует о том, что 3'-концевой остаток AZTMP преимущественно должен находиться в /+1-сайте, в котором он не испытывает стерических затруднений. Второе говорит о том, что нарушается связывание комплементарного dNTP в /+1-сайте, что не способствует образованию закрытого элонгационного комплекса (DEC)..

Позднее (Sarafianos et al., 2002) была получена трехмерная структура тройного элонгационного комплекса, в котором 3'-концевой остаток AZTMP располагается в /22 сайте. В эту структуру был встроен входящий dNTP (рис, IV) Все предположения, сделанные в описанной выше модели (Boyer el al. 2001), в этой работе полностью подтвердилась..

Рис IV Структура участка активного центра тройного элонгациоиного комплекса, в котором З'-концевой остаток праймера (AZTMP) располагается в /-сайте (Sarafianos et al., 2002). Входящий dTTP расположен так же. как в тройном элонгационном комплексе (Huang et al, 1998). Салатовым цветом показано расположение аминокислотных остатков в структуре (Huang et al., 1998). Малиновым показаны участки стерического перекрывания З'-концевого остатка AZTMP с а-фосфатом входящего комплементарного dTTP и с карбоксилом DI85.

В заключение следует отметить, что уровень пирофосфоролиза для полимеразы дикого типа при физиологических концентрациях пирофосфата тем не менее в 5-!0 раз выше уровня псевдопирофосфоролиза при физиологических концентрациях ATP (Meyer et al, 1999, Boyer et al., 200!). По данным (Meyer et at, 1999) для мутанта RT (67/7a/2i5/2i9) в присутствии природных dNTPs (в этой системе происходит выщепление терминирующего остатка AZTMP и немедленная элонгация «разблокированного» праймера) и 50 мкМ РР, выщепление AZTMP происходит чуть менее эффективно, чем в присутствии 3 .2 мМ АТР, однако, по другим данным (Arion et al., 2000; Boyer et al, 2001), в сходной системе RT^rromsais") в присутствии 150 мкМ PPi в 1.5−3 .5 раза более эффективно выщепляет 3'- концевой AZTMP, чем в присутствии 3 мМ АТР.

Уровень реакции пеевдопирофосфоролиза в зависимости от стадии синтеза вирусной ДНК (для HIV).

Показано, что кинетические параметры синтеза ДНК вирусной RT различны на стадиях инициации синтеза и элонгации. На стадии инициации происходит образование комплекса геномной вирусной РНК, праймера — tRNA3Lys и обратной транскриптазы. Инициацией принято считать синтез первых шести нуклеотидов (-) цепи ДНК. Инициация отличается от элонгации, во-первых, тем, что это высокоспецифичный процесс по отношению к комплексу РНКtRNA3Lys — RT (обратные транскриптазы других ретровирусов не способны эффективно инициировать синтез в присутствии комплекса РНК HIV — tRNA3Lys) (Arts et al., 1996). Во-вторых, процессивность синтеза при инициации близка к единице, другими словами, синтез при инициации является практически дистрибутивным процессом (Lanchy et al., 1996; Isel et al., 1996). Это согласуется с данными о том, что, несмотря на сходные величины констант диссоциации комплексов «RT — нуклеиновая кислота», при инициации RT диссоциирует от комплекса приблизительно в 200 раз быстрее, чем в случае элонгации. Третье отличие заключается в 50−160 кратном снижении скорости включения нуклеотидов в растущую цепь ДНК (Lanchy et al., 1996; Rigourd et al., 2000). Переход от инициации к элонгации является двухстадийным процессом (Lanchy et al., 1998). Так скорость полимеризации резко возрастает (в 3400 раз) между включением шестого и седьмого нуклеотидов, а между включением 17-го и 19-го нуклеотидов в 30 раз снижается скорость диссоциации комплекса «фермент/праймер-матрица» ..

Отношения kPoi/K.

В работе (Rigourd et al., 2000) показано, что на стадии инициации пирофосфоролиз так же сильно подавлен, как и включение нуклеотидов. Для выщепления 3'-концевого остатка dTMP: kpyro=0.70 s'1, Kd (ppi) =12 шМ в элонгации (синтез (-) цепи ДНК), и кРУго=0.0048 s" 1, Kd (ppi) = 4.4 мМ при инициации, т. е. пирофосфоролиз остатка dTMP при инициации происходит примерно в 140 раз медленнее, чем при элонгации, что по порядку величины соответствует уменьшению скорости включения нуклеотидов при инициации по сравнению с элонгацией. Вьпцепление остатка AZTMP в элонгации (в сходной системе) характеризуется kpyro= 1.3 s" 1, Kd (ppi) = 21 мМ, а при инициации при высокой концентрации PPi (6 мМ) остаток AZTMP выщепляется лишь из 20% терминированного праймера (достигается плато). Причины этого эффекта не ясны..

АТР-зависимое выщепление З'-концевого остатка AZTMP мутантной полимеразой RT (67/70/2i5/2i9), как показано в работе (Rigourd et al., 2002), на стадии элонгации практически не зависит от природы матрицы. Так на ДНК-матрице константа вьпцепления 3'-AZTMP в присутствии 3.5 мМ АТР оказалась равной 1.38×10'3 s*1 (для полимеразы дикого типа — 3.7×10″ 4 s1), на РНК матрице — 2.1×10'3 s'1 (для полимеразы дикого типа данных нет, т.к. даже при длительной инкубации остаток AZTMP выщеплялся из менее 5% от общего количества терминированных праймеров)..

При инициации (в праймер-матричной системе: геномная РНК — tRNA3Lys-dC-AZTMP3O ни мутантная полимераза, ни фермент дикого типа не оказались способными выщеплять остаток AZTMP в присутствии 3.5 мМ АТР даже при очень длительной инкубации (до 24 ч, с периодическим добавлением свежей порции фермента) (Rigourd et al., 2002)..

Механизмы устойчивости обратных транскриптаз к другим нуклеозидным ингибиторам.

На сегодняшний день известны два различных способа, с помощью которых может достигаться устойчивость мутантных полимераз к различным нуклеозидным аналогам: первый — за счет снижения сродства к трифосфатному производному нуклеозидного аналога, второй — за счет усиления вьпцепления уже встроившегося нуклеозидного аналога путем пирофосфоролиза либо псевдопирофосфоролиза, благодаря чему синтез ДНК может быть продолжен. К первому типу относятся случаи устойчивости мутантной полимеразы M184V кЗТСТР ((-)-р-1−2', 3'-дидезокси-3,-тиоцитидин-5'-трифосфат) (Feng et al., 1999; Krebs et el., 1997) и к ddCTP (Ueno and Mitsuya, 1997) — мутантной полимеразы A62V/V75I/F77L/F116Y/Q151M к ddATP, AZTTP, d4TTP, FddATP (2'-р-фтор-2', 3'-дидезоксиаденозин) и ddCTP (Ueno and Mitsuya, 1997) — мутантной полимеразы K65R к ddATP, FddATP, PMEApp (9-(2-фосфонилметоксиэтил) адениндифосфат) и ddCTP (Ueno and Mitsuya, 1997; Zhang et al., 1994)..

Резистентость к аналогам по второму механизму показана для AZT и сЦТ. Пирофосфоролиз можно рассматривать как механизм, объясняющий устойчивость именно мутантных полимераз к терминаторным остаткам, но при этом существует много данных, демонстрирующих отсутствие разницы в выщеплении 3'-терминирующего остатка между полимеразой дикого типа и резистентным к этому остатку мутантом (в литературе встречаются данные только для AZT, см. выше). В любом случае вьпцепление терминаторного остатка с участием пирофосфата in vivo может быть использовано как мутантными полимеразами, так и полимеразой дикого типа для разблокирования растущей цепи ДНК и продолжения ее синтеза. Эффективность такого «спасения» синтеза различна для различных терминирующих остатков, что может быть объяснено теми же критериями, что и степень эффективности реакции псевдопирофосфоролиза, а именновероятностью нахождения З'-остатка в z+i-сайте и эффективностью образования DEC-комплексов с комплементарным dNTP. Так показано, что синтез полноразмерной (-) цепи ДНК полимеразой дикого типа в присутствии нуклеозидных аналогов, 50 мкМ природных dNTPs и 150 мкМ PPi в случае AZTTP — в б раз, d4TTP — в 2.1, ЗТСТР — в 1.4, ddCTP — в 1.5, ddATP — в 1.2 раза происходит более эффективно, чем в отсутствие пирофосфата (Isel et al., 2001)..

Наиболее вероятным механизмом, с помощью которого можно объяснить устойчивость к нуклеозидным аналогам именно мутантных полимераз, является псевдопирофосфоролиз. Как показано выше, NTP-зависимое выщепление З'-концевого терминирующего остатка зависит от двух параметров. Первый — это эффективность выщепления в отсутствие комплементарных dNTPs, которая приблизительно одинакова для самых различных ингибиторов — AZTMP, ddAMP, ddTMP, d4TMP. Второй — это ингибирование выщепления в присутствии комплементарных трифосфатов. Для ингибирования выщепления остатков ddAMP, ddTMP, d4TMP (см. выше), а также ddCMP, DXG ((-)-Р-?-диоксолангуанозин — соединение, содержащее атом кислорода вместо 3'-углерода в рибозе) (Naeger et al., 2002) и, вероятно, для других аналогичных нуклеозидных аналогов требуются низкие концентрации комплементарных трифосфатов. При этом важно отметить, что именно структура самих терминаторов влияет на ингибирование комплементарным нуклеотидом (на образование закрытых DEC-комплексов и вероятность нахождения в /-сайте)..

Таким образом, реакция псевдопирофосфоролиза может рассматриваться в качестве механизма резистентности RT к нуклеозидным аналогам (за исключением, на сегодняшний день, только AZT) только при наличии мутаций или каких-либо других факторов, влияющих на образование закрытых комплексов в присутствии комплементарного нуклеотида..

Такая мутация была обнаружена — это дипептидная вставка между кодонами 69 и 70, обусловливающая устойчивость вирусов к широкому спектру нуклеозидных ингибиторов in vivo — AZT, ЗТС, ddl, ddC, d4T, PMEA (Larder et al., 1999; Winters et al., 1998). Устойчивость существенно повышается, если наряду со вставкой присутствуют замены 210W и 215Y (для AZT в 100 раз, ЗТС в 3.5 раза, ddl в 1.5 раза, ddC в 2 раза, d4T в 6 раз, РМЕА в 10 раз (данные по d4T и РМЕА — в присутствии только215У))..

Кинетические параметры реакции синтеза для полимераз, содержащих вставки различной последовательности и длины, приводятся в работе (Mas et al., 2000)..

Аминокислотные остатки 69−70 располагаются в субдомене «fingers» («пальцы»), в районе связывания входящего dNTP при полимеризации. После связывания субстрата, субдомен «fingers» переходит в «закрытую» конформацию — придвигается к субдомену «palm» («ладонь»), содержащему каталитические аспартаты, так что трифосфат оказывается в /+./-сайте активного центра. Точно так же происходит формирование DEC-комплексов в случае, когда на 3'-конце праймера находится терминирующий нуклеотидный остаток..

Нарушение связывания dNTP может приводить к тому, что для образования «закрытого» комплекса (в случае, когда на 3'-конце терминирующий остаток — образования DEC) будут требоваться более высокие концентрации трифосфатов и, соответственно, реакция псевдопирофосфоролиза будет ингибироваться большими концентрациями комплементарных dNTP, что может обусловливать повышение резистентности такой полимеразы к широкому спектру нуклеозидных ингибиторов при физиологических концентрациях трифосфатов..

Экспериментальные исследования подтверждают эти предположения. В работе (Meyer et al., 2003) показано, что наличие вставки (-S-S-, -S-GилиA-G-) приводит к трехкратному увеличению константы ингибирования синтеза ddAp4A комплементарным dNTP. Этот эффект существенно усиливается в присутствии дополнительных мутаций. Так при наличии вставки и замен M41L/T215Y константа ингибирования повышается в 18 раз (в этом случае 1С5о=50 мкМ, что сопоставимо с физиологической концентрацией dNTP в клетке). Важно отметить, что мутант, содержащий только M41L/T215Y — лишь в 1.2 раза менее чувствителен к комплементарному трифосфату. При одновременном наличии вставки и замен M41L/L210W/R211K/L214L/T215Y константа ингибирования комплементарным нуклеотидом повышается в 23 раза (IC50 = 65 мкМ). Видно, что имеется синергический эффект повышения константы ингибирования в присутствии вставки и других замен (мутации по отдельности влияют на IC50 существенно меньше, чем вместе). Особенно ярко этот эффект выражен для замены M41L/T215Y..

Сходные данные, демонстрирующие эффективное выщепление остатков (I4TMP и ddTMP полимеразой (до 10 раз эффективнее, чем RT (vt)), содержащей дипептидную вставку и T215Y, в присутствии физиологических концентраций (100 мкМ) dNTPs показано в работе (Boyer et al., 2002)..

Влияние замен T215Y и L210W при наличии вставки на увеличение эффективности вьпцепления терминаторных остатков, вероятно, связано не только с синергическим эффектом, повышающим константу ингибирования комплементарным dNTP, но и с усилением связывания стимулирующего нуклеозидтрифосфата, как предполагается в модели (Воуег et al., 2001, см. выше). Последний эффект — не специфичен по отношению к природе терминирующего остатка. Примечательно, что мутант, содержащий вставку и замену Т215Y, в присутствии 100 мкМ смеси четырех dNTP вьпцепляет З'-концевой остаток AZTMP лишь в 2 раза более эффективно, чем RT (wt) (З'-ddTMP и сЦТМР — более, чем в 10 раз), что, вероятно, говорит о том или подтверждает то, что в присутствии на 3'-конце остатка AZTMP образование DEC и без того затруднено (Воуег et al., 2002)..

Факторы, снижающие эффективность псевдопирофосфоролиза, катализируемого HIV RT.

Известно, что мутации устойчивости к фосфономуравьиной кислоте (PFA) — аналогу пирофосфата — повышают чувствительность фермента к AZT. Как следствие не обнаруживаются мутанты, обладающие резистентностью одновременно к двум этим соединениям. Более того, если мутацию устойчивости к PFA ввести в полимеразу, уже содержащую мутации устойчивости к AZT, то вирусы, содержащие такую полимеразу, станпвяхс, а лысл ко^чувстаихельными. к AZX? Lardet eL^l. J 989f#fc.MeUnrs eLaJ-.J 99,5: Tachedjian et al., 1996)..

Одной из таких мутаций является замена Al 14S. В работе (Arion et al., 2000) было показано, что наличие этой замены наряду с четырьмя мутациями, обусловливающими устойчивость вируса к AZT (D67N/K70R/T215F/K219Q), приводит к тому, что такая полимераза полностью теряет способность вьпцеплять 3'-остаток AZTMP из цепи ДНК. Этим, вероятно, и может объясняться эффект повышения чувствительности к AZT вирусов, содержащих такую полимеразу..

С другой стороны, важным обстоятельством является то, что in vitro мутант Al 14S намного (в 20 раз) менее чувствителен к AZTTP (как одиночный мутант, так и при одновременном наличии четырех «AZT-резистентных» мутаций) (Arion et al., 2000). Структурное объяснение этому может быть следующим. Остаток А114, наряду с D113, Y115hQ151, как следует из структуры тройного элонгационного комплекса, образует так называемый «3'-карман» (Huang et al., 1998), который окружает З'-ОН группу входящего dNTP. Замена Al 14S может приводить к стерическому затруднению при связывании объемной 3'-аз ид о группы AZTTP. Кроме того, остаток А114 находится вблизи как 3'концевой группы входящего dNTP, так и его 0-фосфата. Замена аланина на объемный сернн, может приводить к нарушению связывания как dNTP, так и пирофосфата при пирофосфоролизе и стимулирующего NTP при псевдопирофосфоролизе. Таким образом, можно структурно объяснить влияние этой замены на уровень пирои псевдопирофосфоролиза..

Подтверждается простая идея о том, что мутации, приводящие к устойчивости к аналогам пирофосфата (за счет нарушения его связывания и координации в активном центре), должны одновременно приводить к снижению уровня пирофосфоролиза и псевдопиросфоролиза. Поэтому механизм, по которому другие мутационные замены, приводящие к устойчивости к PFA (замены остатков 88,89, 92,113,161 (Mellors et al., 1995; Tachedjian et al., 1996)), ведут к снижению резистентности к AZT заключается, вероятно, также в снижении уровня NTP-зависимого вьпцепления 3'-остатка AZTMP..

Другая мутация, M184V, приводящая к резистентности к ЗТС на уровне включения ЗТСТР — также одновременно повышает чувствительность к AZT. Это происходит как в отсутствие, так и при одновременном присутствии «AZT-резистентных» мутаций (Tisdale et al., 1993; Larder et al., 1995; Boucher et al., 1993; Boyer et al., 20 026). В работах (Boyer et al., 20 026- Gotte et al., 2000) демонстрируется, что наличие этой мутации приводит к заметному снижению вьпцепления 3'-концевого остатка AZTMP в присутствии как пирофосфата, так и высоких концентраций АТР..

Возможны два альтернативных структурных объяснения влияния этой мутации на псевдопирофосфоролиз. Первое следует из модельных и рентгеноструктурных данных (см. выше): З'-остаток AZTMP должен находится преимущественно в i+1-сайте (из которого происходят реакции фосфоролиза), так как при нахождении остатка AZTMP в /сайте имеет место стерическое перекрывание между боковой группой одного из каталитических аспартатов (D185) и азидо-группой. Замена соседнего с этим аспартатом остатка M184V может приводить к уменьшению или исчезновению этого стерического препятствия. Второе возможное объяснение базируется на влиянии замены Ml841 на структуру двойного элонгационного комплекса RT-ДНК (Sarafianos et al., 1999). В этой работе демонстрируется, что положение 3'-концевого остатка праймера, находящегося в /-сайте в структуре двойного комплекса, образованного полимеразой дикого типа, отличается от положения этого же остатка в комплексе, образованного мутантной полимеразой Ml 841- т. е. эта замена влияет на ориентацию 3'-концевого остатка праймера. Если предположить, что подобные изменения могут иметь место и в случае, когда 3'-конец находится в /+/-сайте, то это может приводить к замедлению реакции псевдопирофосфоролиза..

Продукты реакции псевдопирофосфоролиза — динуклеозидтетраи трифосфаты — являются субстратами для различных ДНК-полимераз.

Продуктами реакции NTP-зависимого вьпцепления являются динуклеозид-5', 5″ -тетрафосфаты и динуклеозид-5', 5″ -трифосфаты (в случае r/dNTPи r/dNDP-стимулируемого вьпцепления, соответственно). В работе (Victorova et al., 1999) было продемонстрировано, что эти соединения могут служить субстратами в реакции полимеризации для четырех классов ДНКП — обратных транскриптаз (HIV RT), ДНКП, а и Р эукариот (ДНКП аир человека), прокариотических ДНКП I типа (ДНКП Е. coli и Т. aquaticus). Субстратные свойства этих соединений зависят как от их структуры, так и от природы фермента. Для HIV RT субстратная активность этих соединений оказалась наиболее близкой к активности соответствующих dNTP (см. табл. УП), в то время как для остальных ферментов они были в той или иной степени менее эффективными субстратами, чем dNTP. Это согласуется с данными о том, что реакция псевдопирофосфоролиза, которая является по сути реакцией, обратной включению динуклеозидтрии тетрафосфатов, наиболее эффективно осуществляется именно HIV RT..

Таблица VII. Кинетические параметры dAp4.

Субстрат Km, MKM Vmax (Np4N)/Vmax (dNTP) dAp4dA 2.6±0.6 0.56 dATP 0.5±0.3 — dTp4dT 2.1±0.4 0.96 dTTP 1.2±0.6 —.

Для всех ферментов динуклеозидтрифосфаты оказались менее эффективными субстратами, чем динуклеозидтетрафосфаты. При этом, если для HIV RT разница в активности между ними не превышала 10 раз, то для ДНКП IЕ. coli активность динуклеозидтрифосфатов оказалась на два порядка ниже, чем тетрафосфатов..

Нуклеотид-зависимое выщепление З'-концевого нуклеотида РНК РНК-полимеразами.

Поиск подобной реакции для РНК-полимераз (РНКП) интересен, особенно с точки зрения возможного ее участия в процессе коррекции синтеза РНК..

Нуклеотид-зависимое выщепление З'-концевого нуклеотида РНК на сегодняшний день детально исследовано только для мультисубъединичной РНКП Е. coli (Sosunov et al., 2003)..

В системе остановленного тройного элонгационного комплекса, содержащего РНКП Е. coli, ДНК (содержащую промотор) и РНК, образования динуклеозидолигофосфатов в присутствии высоких концентраций некомплементарных r/dNTP, r/dNDP не происходит. Однако при этом наблюдается стимуляция вьпцепления З'-концевого нуклеотида РНК в виде нуклеозидмонофосфата, т. е. наблюдается стимуляция 3'-5'-экзонуклеазной активности РНКП. Интересно, что данных, описывающих вьпцепление З'-концевого монофосфата, катализируемое бактериальными РНКП, в литературе до появления этой работы обнаружено не было..

Известно, что РНКП Е. coli обладает эндонуклеазной активностью. РНКП способна сдвигаться по ДНК назад относительно направления движения при синтезе, при этом 3'-конец синтезированной РНК через вторичный канал (канал в молекуле полимеразы, проходящий от активного центра к поверхности молекулыпредполагается, что по нему в активный центр доставляются нуклеозидтрифосфаты при синтезе) просовывается наружу (Komissarova and Kashlev, 1997а- 19 976- Nudler et al., 1997). В таком состоянии высунувшийся фрагмент РНК может быть эндонуклеолитически расщеплен РНК-полимеразой (Orlova et al., 1995). Эта активность существенно стимулируется в присутствии белковых факторов GreA и GreB у прокариот (Borukhov et al., 1993) и TFIIS у эукариот (Reines, 1992; Izban and Luse, 1992; 1993a- 19 936). При этом GreA более эффективно катализирует отщепление коротких 3'-концевых олигонуклеотидов, a GreB — более длинных..

Экзонуклеазная активность РНКП Е. coli подавляется стрептолидигином — антибиотиком, блокирующим работу активного центра фермента (Siddhikol et al., 1969; McClure 1980). Кроме того, мутации по каталитическим аспартатам приводят к резкому снижению как полимеризующей, так и нуклеазной активности РНКП (Sosunov et al., 2003а). Все это свидетельствует о том, что все каталитические активности РНКП (полимеризация, пирофосфоролиз, эндои экзонуклеазные реакции) осуществляются одним активным центром..

В известных ДНКП, обладающих экзонуклеазной активностью, имеется отдельный экзонуклеазный активный центр, отстоящий от полимеразного на определенном расстоянии (Derbyshire et al., 1988; Beese et al., 1991; 1993). При этом экзонуклеазный и полимеразный активные центры имеют сходную структуру (Joyce and Steitz, 1994). Обе реакции проходят по одному механизму — Sn2. Оба центра содержат два иона магния. В случае экзонуклеазной реакции (в экзонуклеазном активном центре) один из ионов (ион А) ориентирует и активирует молекулу воды (за счет понижения значения рКа, что способствует депротонизации) с образованием гидроксил-иона, который атакует атом фосфора расщепляемой фосфодиэфирной связив соответствии с механизмом реакции (Sn2) молекула воды располагается на одной линии с атакуемой фосфодиэфирной связью. В случае реакции полимеризации (в полимеразном активном центре) ион, А координирует и активирует З’ОН группу концевого NMP с образованием О'-иона, который атакует а-фосфат входящего нуклеотида. В обоих центрах второй ион Ме2+ (ион В) взаимодействует с уходящей группой и, действуя как кислота Льюиса, облегчает разрыв связи и высвобождение 3'- оксианиона за счет нейтрализации образующегося на нем отрицательного заряда. Оба иона Me взаимодействуют с несвязанным атомом кислорода атакуемого фосфата, стабилизируя переходное пентакоординационное состояние атома фосфора, а также способствуя правильной его ориентации в активном центре..

В работах (Sosunov et al, 2003; Sosunova et al, 2003) на основе трехмерной структуры элонгационного комплекса РНКП П (Gnatt et al., 2001) с учетом данных, полученных при исследовании экзои эндонуклеазной активности РНКП Е. coli, по аналогии со структурой полимеразного и экзонуклеазного активных центров ДНКП была построена модель единого активного центра РНКП Е. coli, осуществляющего как полимеризацию/пирофосфоролиз, так и экзои эндонуклеазные реакции, в том числе нуклеотид-стимулируемое экзонуклеазное расщепление (см. рис. 5). Механизм реакций аналогичен механизму соответствующих реакций у ДНКП, описанных выше. Отличием активного центра РНКП при экзонуклеазном расщеплении от экзонуклеазного центра ДНКП является то, что в ДНКП, помимо иона Ме2+, в координации воды в активном центре принимают участие два аминокислотных остатка (Туг 497 и Glu 357), тогда как для РНКП подходящих кандидатов для этой роли обнаружено не было (Beese et al., 1991, Sosunov et al., 2003)..

В случае NTP-стимулируемой экзонуклеазной реакции РНКП в координации иона металла, соответствующего иону, А в экзонуклеазном центре ДНКП, помимо двух аспартатов (D460 и D462) каталитической триады принимают участие Р-, у-фосфаты стимулирующего нуклеотида. Именно этим, вероятно, и объясняется стимулирующий эффект некомплементарного NTP. Это подтверждается экспериментальными данными о том, что в присутствии некомплементарного NTP резко повышается константа связывания этого металла (более чем в 50 раз)..

Физиологическое значение нуклеотид-зависимого выщепления монофосфата вряд ли может заключаться в коррекции неправильно встроившегося нуклеотидного остатка. Приведем некоторые расчеты. Скорость экзонуклеазного выщепления в присутствии некомплементарного нуклеотида возрастает примерно в 10−20 раз относительно нестимулируемого расщепления и составляет при 1 мМ концентрации нуклеотида величину порядка 0.25 мин'1 при 37 °C. В то время как скорость полимеризации при 1 мкМ концентрации субстрата составляет 0.12−0.17 мин*1 при 0 °C (определялась на другом элонгационном комплексе на том же промоторе (Сосунов, неопубл. данные) и на искусственной праймер-матричной системе (Sosunov et al., 2003а)). Температурный коэффициент для интервала 21−37°С, определенный для экзонуклеазного выщепления, составляет 5.6 (Sosunov et al., 2003). Экстраполируя эту величину для температурного интервала 0−21°С получаем величину 7.2 (для искусственной системы эта величина для полимеразной реакции составила 20). Таким образом, по приблизительным подсчетам скорость реакции полимеризации при 1 мкМ NTP при 37 °C составляет 5−20 min'1. При физиологической (100 мкМ, см. выше) концентрации NTP скорость согласно уравнению k=VmaxX[NTP]/[NTP]+Kra, с учетом величины Кт (ЫТР)=7мкМ (Sosunov et al., 2003а) составит 40−150 min'1 (37°С). Таким образом, при 1 мМ концентрации некомплементарного r/dNTP скорость экзонуклеазного выщепления оказывается в 150 600 раз ниже, чем скорость включения нуклеотида при концентрации 100 мкМ (учитывая, что суммарная концентрация некомплементарных нуклеотидов выше 1 мМ — эта разница может быть меньше). Константа диссоциации стимулирующего r/dNTP составляет 0.8±0.1 мМ..

Для ДНКП показано, что после встраивания неправильного нуклеотида в ДНК включение следующего происходит существенно медленнее, что позволяет ферменту вьпцепить неправильный нуклеотид, перебросив 3'-конец в экзонуклеазный активный центр (Donlin et al., 1991). Для РНКП (на примере РНКП П эукариот) также показано, что встраивание следующего нуклеотида за неправильно встроившимся происходит в 5−20 раз медленнее, чем после правильного нуклеотида (Thomas et al., 1998)..

Таким образом, учитывая, что скорость нуклеотид-зависимого выщепления (в присутствии 1 мМ некомплементарного r/dNTP) в 150−600 раз ниже скорости элонгации при физиологических концентрациях NTPs, можно заключить, что неправильно встроившийся нуклеотидный остаток за время паузы, которая происходит при включении следующего за ним нуклеотида, вероятно, просто не успеет выщепиться по такому механизму..

Для РНКП П также показано наличие экзонуклеазной активности, которая стимулируется белковым фактором TFIIS (Wang and Hawley, 1993) (влияние на эту активность некомплементарных нуклеозидтрифосфатов не изучалось). Как сказано выше, фактор TFIIS стимулирует также эндонуклеазное выщепление с высвобождением ди-, трии более длинных олигонуклеотидов. Для фактор-стимулируемой экзонуклеазной активности РНКП II было показано ее участие в механизме коррекции синтеза РНК in vitro (Thomas et al., 1998). Аналогичные эукариотическому фактору TFIIS прокариотические GreA и GreB, как показано в (Sosunov et al., 2003), не стимулируют экзонуклеазного вьпцепления в обычных условиях. Нами было показано (Сосунов и др., неопубл. данные), что существует другой, отличный от GreA и GreB фактор, вероятно, белковой природы, стимулирующий экзонуклеазную активность РНКП Е. coli. Следует ожидать, что, по аналогии с TFIIS, его роль может заключаться в коррекции синтеза РНК. К сожалению этот фактор к настоящему времени не выделен в чистом виде..

Существуют данные о наличии нуклеотид-стимулируемой нуклеазной активности у других РНКП. Так показано, что РНКП III эукариот обладает как экзо-, так и эндонуклеазной активностью (Whitehall et al., 1994; Bobkova et al., 1997; 1999). Показано, что в присутствии некомплементарных нуклеозидтрифосфатов возрастает уровень вьпцепления как моно-, так и дифосфатов (Whitehall et al., 1994). Демонстрируется, что механизм реакции отличен от механизма пирофосфоролиза. Хотя до настоящего времени не было показано, что нуклеазная активность осуществляется тем же активным центром, что и полимеразная — нет данных о влиянии на нуклеазную активность мутаций и антибиотиков, например, тагетитоксина (tagetitoxin), (Steinberg and Burgess, 1992), блокирующих полимеризацию, можно предположить, что она происходит по механизму, описанному для РНКП Е. coli..

Для РНКП вируса оспы, которая является гомологом мультисубъединичных РНКП прокариот и эукариот, также показано наличие экзонуклеазной активности, стимулируемой в присутствии лишь одного из трех некомплементарных трифосфатов — СТР (Hagler and Shuman, 1993). По данным этой работы можно заключить, что в присутствии СТР стимулируется вьпцепление монофосфата. Происходит ли при этом вьпцепление олигонуклеотидов, сказать затруднительно. Механизм этой реакции детально не изучен, но по аналогии можно предположить, что он сходен с механизмом, описанным для РНКП Е. coli..

Таким образом, и ДНКП и многосубъединичные РНКП обладают нуклеотид-стимулируемой нуклеазной активностью. Однако механизм этих реакций различен (рис. V). В случае ДНКП фосфат вьпцепляемого З'-концевого нуклеотида атакует один из кислородов стимулирующего нуклеозидгрифосфата (механизм аналогичен механизму реакции пирофосфоролиза), при этом образуется динуклеозид-55″ -тетрафосфат. В случае же многосубъединичной РНКП Е. coli роль стимулирующего трифосфата сводится к привнесению, удержанию и координации иона магния, который координирует и активирует молекулу воды, которая, в свою очередь, атакует фосфат З'-концевого нуклеотида. в результате чего высвобождается нуклеозидмонофосфат (механизм аналогичен механизму экзонуклеазного расщепления, катализируемого экзонуклеазным активным центром ДНКП 1Е, coli) (рис. V)..

RNAP E. coli i+1)-site.

BASE.

Л®л т^ г>лвор' .тг ' > а" .

D-wap' У dna i+1)-site зазе:.

ШООГТШ1У.

NIP.

DISS о-.

I —fl (c).

• f л оно Г.

10J i-si1e В i+1)-site У.

HIV RT i-site D i+1)-site.

BASE.

Рис. V Механизм реакции полимеризации и нуклеотид-етимулируемого выщепления 3'-концевого нуклеотида РНК или ДНК для РНКП К coli (Л и В) и для HIV RT (С и D).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Ферменты.

В работе использовали следующие ферменты: ДНК-полимеразу IЕ. coli, фрагмент Кленова (Boehringer Mannheim), ДНК-полимеразу Т. aquaticus (Pharmacia Biotech), обратные транскриптазы вирусов миелобластоза птиц (AMV RT) и иммунодефицита человека (HTV RT) (Amersham), ДНК-полимеразы, а и р человека (выделены ранее в ЛХБА ИМБ РАН), РНК-полимеразу фага Т7 (любезно предоставлена лабораторией энзимологии транскрипции ИМБ РАН), РНК-полимеразу Е. coli, которая была выделена по описанной ниже методике (РНК-полимеразы, содержащие мутационные замены, были получены Е. Сосуновой), полинуклеотидкиназу бактериофага Т4 (Pharmacia Biotech и Biolabs), щелочную фосфатазу (Boehringer Mannheim) и фосфодиэстеразу змеиного яда (Worthington)..

1.1. Получение РНК-полимеразы Е. coli.

В работе использовалась полимераза, реконструированная из отдельных субъединиц. Субъединица р содержала последовательность из шести остатков His, что позволяло иммобилизировать собранный фермент на Ni-NTA-агарозной смоле (Qiagen). Выделение субъединиц осуществляли на основе методики (Borukhov and Goldfarb, 1993)..

1.1.1. Буферы, использовавшиеся при получении РНКП Е. coli.

Буфер для лизиса: 40 мМ трис-HCl рН 7.9- 0.3 М КС1,1 мМ EDTA, 0.1 мМ PMSF) — буфер А: 40 мМ трис-HCl рН 8.3- 1 М (NH4)2S04,1 мМ EDTA, 0.1 мМ DTTбуфер В: 20 мМ трис-HCl рН 8.3- 0.2 М КС1,1 мМ EDTA, 0.1 мМ DTT, 5% глицеринбуфер С: 40 мМ трис-HCl рН 5.5- 0.2М КС1,1 мМ EDTA, 0.1 мМ DTT и 5% глицеринбуфер D: 40 мМ трис-HCl рН 6.2- 0.2 М КС1,1 мМ EDTA, 0.1 мМ DTT и 5% глицеринбуфер Е: 40 мМ трис-HCl рН 8.3, 5% глицерин, 1 мМ EDTA, 0.1мМ DTTбуфер F: 40 мМ трис-HCl рН 8.3, 0.6 М NaCl, 1 мМ EDTA, 0.1 мМ DTT, 5% глицеринбуфер для хранения: 40 мМ трис-HCl рН 7.9- 2 М КС1,1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 50% глицеринденатурирующий буфер: 50 мМ трис-HCl рН 7.9- 6 М гуанидин-НС1,10 мМ MgCl2,10 цМ ZnCl2,1 мМ EDTA, 10 мМ DTT, 10% глицеринреконструирующий буфер: 50 мМ трис-HCl рН 7.9- 0.2 М КС1,10 мМ MgCl2, Ю мкМ ZnCl2,1 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 20% глицерин..

1.1.2. Выделение 0 и Р'-субъединиц.

Субъединицы экспрессировали в клетках Е. coli BL21(DE3). Гены р и Р'-субъединиц содержались в плазмидах рЕТ28р и рЕТ29Р', соответственно. Клетки растили при 37 °C до оптической плотности СЮбоо=0.7 о.е./мл, после чего индуцировали экспрессию субединиц, добавляя IPTG до конечной концентрации 1 мМ. После этого клетки инкубировали еще 3 часа при 37 °C и центрифугировали 15 мин при 3500 об/мин (все центрифугирования проводились при 4°С). Полученную биомассу хранили при -70°С. Для получения субъединиц 0.5 г замороженной биомассы ресуспендировали в 4 мл буфера для лизиса, содержащего 0.2 мг/мл лизоцима и 0.2% дезоксихолата натрия и инкубировали во льду 20 мин, после чего озвучивали на ультрасоникаторе Sonics&Materials в режиме: 3 сек импульс при величине амплитуды 38%, 9 сек паузасуммарное время озвучивания 3 мин. Полученную смесь центрифугировали 30 мин при 15 000 об/мин. Осадок ресуспендировали в 4 мл холодного лизирующего буфера, содержащего 0.2 мг/мл лизоцима и 0.2% н-октил-Р-Б-глюкопиранозида (Sigma), снова озвучивали и центрифугировали как описано выше. Осадок ресуспендировали в 4 мл холодного лизирующего буфера, содержащего 0.2% н-окгил P-D-глюкопиранозида и 1 мМ DTT, и снова озвучивали как описано выше. Суспензию, содержащую 20−25 мг рили р'-субъединицы, разносили в «эппендорфы» и центрифугировали 30 мин при 15 000 об/мин. Выделенные субъединицы хранили в виде осадка при -70°С..

1.13. Выделение а-субъединицы.

Ген а-субъединицы содержался в плазмиде рТ7а. Примерно 20 г замороженной биомассы клеток Е. coli HMS174(DE3)[pT7a] ресуспендировали в 100 мл буфера лизиса и гомогенизировали с помощью ультразвука 5 мин в режиме, указанном выше (п. 1.1.2.). Суспензию центрифугировали 30 мин при 13 000 об/мин. К супернатанту добавляли NaCl до конечной концентрации 1 М и 10% Polymin Р до концентрации 0.25%, аккуратно перемешивали в течение 5 мин, после чего центрифугировали 30 мин при 13 000 об/мин. К супернатанту добавляли сульфат аммония до конечной концентрации 1 М. Смесь инкубировали 15 мин во льду, после чего центрифугировали 30 мин при 13 000 об/мин. Полученный супернатант (~200мл) наносили со скоростью 80 мл/час на колонку Phenyl-Toyopearl TSK 650 М (2.6×20 см), уравновешенную буфером А. Колонку промывали с такой же скоростью 500 мл буфера, А (хроматография на колонках производилась на оборудовании FPLC, Pharmacia). Элюцию белка проводили линейным градиентом: 100% буфера, А —"¦ 100% буфера В объемом 600 мл со скоростью 120 мл/час. Фракции, содержащие а-субъединицу (элюировались при 38−50% буфера В), разбавляли в два раза буфером В и доводили рН до 5.2 с помощью 2 М ацетата натрия с рН 4.8. После этого раствор инкубировали 20 мин во льду и центрифугировали 30 мин при 13 000 об/мин. Супернатант со скоростью 50 мл/час наносили на колонку Butyl-Toyopearl TSK 650 М (1×10 см), уравновешенную буфером С, после чего колонку промывали 50 мл буфера С, затем 30 мл буфера D. Элюцию производили 30 мл буфера Е со скоростью 30 мл/час. Фракции, содержащие а-субъединицу (~20мл), разбавляли в 2 раза буфером Е и наносили на колонку DEAE-Toyopearl TSK 650 М (1.6×15 см), уравновешенную буфером Е. Колонку промывали 40 мл того же буфера. Элюцию производили следующим градиентом буфера F: 0 — 20% в 10мл, 20 — 40% в 200 мл и 40 — 100% в 30 мл. Субъединица, а элюировалась в виде одного пика между 25% и 35% буфера F. Фракции, содержащие чистую а-субъединицу (~25мг), были собраны, объединены и сконцентрированы с помощью Centricon 30 (Amicon). После концентрации раствор белка диализовали против буфера для хранения в течение ночи. Полученный раствор субъединицы с концентрацией 10 мг/мл хранили при -20°С..

1.13. Выделение ст-субъединицы.

Экспрессию о-субъединицы осуществляли в штамме Е. coli М5219, несущем плазмиду pMRG8, содержащую ген субъединицы. Индукцию экспрессии осуществляли путем резкого нагревания среды от 30 °C до 42 °C, при (Юбоо=0.3−0.4 о.е./мл, после чего клетки инкубировали еще 3 ч. Полученную биомассу хранили при -70°С. Для получения субъединицы 9 г замороженной биомассы ресуспендировали в 50 мл буфера для лизиса, содержащего 0.2% дезоксихолата натрия, инкубировали 20 мин во льду, затем смесь озвучивали на ультросоникаторе в течение 5 мин в режиме, описанном в п. 1.1.2., и центрифугировали 30 мин при 15 000 об/мин. Осадок ресуспендировали в 50 мл буфера для лизиса, содержащем 0.2 мг/мл лизоцима и 0.5% Tiyton XI00, снова озвучивали и центрифугировали. Осадок еще раз ресуспендировали в 50 мл буфера для лизиса с лизоцимом и Tryton XI00, озвучивали и центрифугировали. Полученный осадок ресуспендировали в 10 мл денатурирующего буфера, инкубировали 30 мин и центрифугировали 30 мин при 15 000 об/мин. Супернатант разбавляли в два раза денатурирующим буфером и диализовали в течение ночи против 2 л реконструирующего буфера. Осадок, образовавшийся за время диализа, удаляли центрифугированием в течение 30 мин при 15 000 об/мин. Супернатант (~30мл) в два раза разводили буфером Е и наносили со скоростью 60 мл/час на колонку DEAE-Toyopearl TSK 650 М (1.6×15 см), уравновешенную буфером Е. После промывки колонки 40 мл буфера Е а-субъединицу элюировали градиентом буфера F: 0 — 10% в 10 мл, 10 — 60% в 200 мл и 60 — 100% в 20 мл. Пик субъединицы элюировался в районе 30−45% буфера F. Фракции, содержащие о-субъединицу (~20мг), объединяли, концентрировали на Centricon 30 и диализовали ночь против буфера для хранения. Раствор субъединицы хранили при -20°С..

1.1.4. Сборка и очистка РНК-полимеразы E. coli.

Холофермент РНКП дикого типа получали по методике (Borukhov and Goldfarb, 1993) с небольшими модификациями путем сборки из отдельных субъединиц. Все процедуры выполняли при 4 °C. Выделенные р и р'-субъединицы ресуспендировали в денатурирующем буфере и инкубировали 1 ч во льду. Растворы центрифугировали 30 мин при 15 000 об/мин для удаления нерастворимого осадка и смешивали с остальными субъедницами в денатурирующем буфере в соотношении а: Р:Р':о = 2:8:4:1 до конечной концентрации белка 0.5 мг/мл (суммарное количество белка около 5 мг). Смесь субъединиц дважды диализовали по 8 часов против 2 л реконструирующего буфера, после чего центрифугировали 30 мин при 15 000 об/мин. К супернатанту добавляли эквивалентное количество о-субъединицы и инкубировали 50 мин при 30 °C. Затем холофермент осаждали. Для этого к раствору добавляли сульфат аммония до 65% концентрации от насыщения, инкубировали во льду не менее часа и центрифугировали 30 мин при 15 000 об/мин. Осадок растворяли в 300−500 мкл буфера В. Полученный раствор центрифугировали еще 3 раза по 30 мин при 15 000 об/мин и затем наносили на гель-фильтрационную колонку Superose 6 10/30 HR, уравновешенную буфером В. Фракции, содержащие холофермент РНКП, концентрировали до 200−500 мкл с помощью Centricon-30. Раствор холофермента хранили при -30°С в буфере для хранения..

2. ДНК.

2.1. Комплексы «праймер-матрица» для ДНК-полимераз.

В работе использовали следующие праймер-матричные комплексы: Комплекс, А .d (GGGTCAGTGCTGCAACATTTTGCTGCCGGTCACGGTTCGA). 5 '-[32P]-d (CCCAGTCACGACGT)oH.

Комплекс Б .d (GGGTCAGTGCTGCAACATTTTGCTGCCGGTCACGGTTCGA). 5' - [32P]-d (GTAAAACG ACGGCC) oh.

Комплекс В .d (GGGTCAGTGCTGCAACATTTTGCTGCCGGTCACGGTTCGA). 5'-[32P]-d (GTAAAACGACGGCC-[32P]A)OH.

В качестве матрицы использовали одноцепочечную ДНК фага М13тр10, выделенную по методике (Краев, 1988)..

На первом этапе получали концентрированный раствор фага (титр не менее 10″). Для этого к 200 мл ночной культуры реципиентного штамма клеток E. coli K12XL1 добавляли 20 мл свежей среды (2xYT), после чего в эту суспензию вносили фаг (бляшка с чашки Петри, на которой хранится фаг). Полученную смесь инкубировали при перемешивании 5 ч при 37 °C и центрифугировали 20 мин при 10 000 об/мин. Осветленную суспензию фага хранили при 4 °C..

На следующем этапе происходит наработка и выделение фаговой ДНК. Для этого 10 мл ночной культуры клеток доводили до 1 л средой 2xYT и добавляли 2 мл концентрированного раствора фага. После инкубирования (не более 6 ч при 37°С) клетки осаждали центрифугированием (4000 об/мин, 15 мин.). К супернатанту, содержащему фаговые частицы, добавляли 20%-ный ПЭГ-6000 с 2.5М NaCl (из расчета 1мл ПЭГ/NaCl на 3.5 мл супернатанта). Суспензию оставляли на 1 ч при +4°С и центрифугировали (12 000 об/мин, 25 мин). Осадок фага растворяли в 30 мл ТЕ и подвергали фенольной депротеинизации, для чего последовательно добавляли 15 мл фенола, 15 мл смеси фенол — хлороформ (последний содержал 1/24 часть изоамилового спирта) и 15 мл хлороформа с изоамиловым спиртом. Каждый раз смесь интенсивно перемешивали на магнитной мешалке в течение 15 мин и центрифугировали (2 мин, 3000 об/мин). Фаговую ДНК, содержащуюся в верхней водной фазе, осаждали, добавляя к ней 1/10 объема ацетата натрия, рН 5.0 и 2.5 объема этанола. Смесь оставляли на ночь при -20°С, после чего центрифугировали 10 мин при 10 000 об/мин. Осадок ДНК промывали холодным 70%-ным этанолом, спирт удаляли, осадок подсушивали на воздухе и растворяли в 3−5 мл ТЕ. Концентрацию ДНК доводили ТЕ до 200 пмол/мл..

ДНК-праймеры, входящие в состав комплексов, А и Б, синтезированы и любезно предоставлены С. Суржиковым (ИМБ РАН). Перед отжигом с матричной ДНК праймеры кинировали по 5'-концу [ Р]. В состав пробы для кинирования (10 мкл) входили: праймер (20−40 пмол), [у-32Р]АТР (12−25 пмол), 1х буфер для полинуклеотидкиназы (Amersham), Т4 полинуклеотидкиназа (10 ед. акт.). Пробу инкубировали 1 ч при 37 °C, после чего полинуклеотидкиназу инактивировали прогреванием в течение 10 мин при 65 °C. Отжиг проводили в смеси (100 мкл) следующего состава: ДНК фага М13тр10 (15−30 пмол), [5'-32Р]-праймер (20−40 пмол), 1х буфер для отжига (10 мМ Tris-HCl, рН 8.0, 5 мМ MgCl2). Смесь выдерживали 10 мин при 65 °C, затем охлаждали до 25 °C в течение 1 часа..

Очистку комплекса [5'-32Р]праймер-матрица от избытка [5'-32Р]праймера и у-[ Р]АТР проводили с помощью гель-фильтрации. Для этого пробу после отжига пропускали через 1 мл колонку с Biogel А-1.5т, уравновешенную ТЕ-буфером. Объем фракций составлял 30−35 мкл. После разделения количество радиоактивности во фракциях определяли по Черенкову в жидкостном сцинтилляционном счетчике Intertechnique (Франция). Находили фракции, содержащие праймер-матричный комплекс. Очищенные комплексы хранили при -20°С не более 20 дней..

Праймер-матричный комплекс В получали достраиванием 3'-конца праймера комплекса Б остатком aP]dAMP. Для этого смесь объемом 30 мкл, содержащую 30 нМ комплекс Б, буфер (10 мМ Tris-HCl (рН 7.9), 5 мМ MgCl2,1 мМ DTT), [a-32P]dATP (0.2 мкМ, уд. акт. 2000 Ки/ммоль) и фрагмент Кленова ДНКП IЕ. coli (2 ед. акт.), инкубировали 30 мин при 25 °C. Очистку комплекса проводили, как описано выше..

2.2. Матрица для синтеза РНК, осуществляемого РНК-полимеразой фага Т7.

В этом качестве использовали плазмиду pTZ-18R..

2.3. Матрицы для синтеза РНК, осуществляемого РНК-полимеразой Е. coli.

2.3.1. В качестве матрицы для тотального синтеза РНК использовали ДНК фага Т2, которую выделяли следующим образом. На первом этапе наращивали достаточное количество фага. Для этого к 30 мл 0.7% агара на LB (при 46°С) добавляли 450 мкл клеток Е. coli В (ОЭбоо — 0.7−0.8 о.е./мл) и 40 мкл суспензии фага (титр ЗхЮ6). После перемешивания агар разливали на 10 чашек Петри с подложками из 1.8% агара на LB. Чашки инкубировали ночь при 37 °C. Утром 0.7%-ый агар со всех чашек собирали в колбу, добавляли в нее 100 мл физиологического раствора, 3 мл хлороформа и интенсивно встряхивали в течение 45 мин. Полученную суспензию центрифугировали 30 мин при 4000 об/мин. К супернатанту (фаговому лизату) добавляли РНКазу (40 мкг/мл) и ДНКазу (40 мкг/мл), инкубировали 30 мин при 37 °C, после чего добавляли трипсин (5 мкг/мл) и инкубировали еще в течении 30 мин при 37 °C. Затем фаговый лизат осветляли центрифугированием (5000 об/мин, 20 мин.). Следующий этап — осаждение фага центрифугированием в течение 40 мин при 18 000 об/мин. Осадок подсушивали на воздухе, после чего добавляли к нему 50 мл 0.1 М NaCl и оставляли на ночь. К суспензии фага добавляли 40 мл 0.25 М EDTA (рН 8.0), 30 мл 10%-ной SDS и 3 мл 1 М Tris-HCl (рН 7.9), интенсивно встряхивали и немедленно добавляли 1 объем насыщенного фенола (см. ниже), после чего помещали на 30 мин на качалку (при этом после первых 15-ти минут к госпшсклл государственная.

41 БИБЛИОТЕКА смеси добавляли 1/10 объема хлороформа). Водную фазу переносили в чистую колбу и три раза повторяли последние операции, начиная с добавления фенола. Остатки фенола удаляли хлороформом (3 раза по 100 мл). Затем к водной фазе добавляли равный объем 96% этанола, выдерживали не менее 2-х часов при -20°С и центрифугировали 15 мин при 15 000 об/мин. Осадок ДНК высушивали на воздухе и растворяли в 5 мл ТЕ. Количество выделенной ДНК составило 3.4 мг..

Приготовление насыщенного фенола (не менее чем за сутки до использования): к 300 мл свежеперегнанного фенола добавляли 30 мл 1 М Tris-HCl (рН 7.9), 60 мл 0.25М EDTA (рН 7.9), 40 мл 10% SDS, 25 мл 5 М NaC104,45 мл Н20. Смесь перемешивали и хранили при +4°С..

2.3.2. Для получения тройных элонгационных комплексов РНКП/ДНК/РНК-транскрипт использовали ДНК размером 270 п.н., содержащую фрагмент промотора А1 бактериофага Т7. Такую ДНК вырезали с помощью рестриктаз ВатШ и HindSl из плазмиды pTZ19, содержащей этот фрагмент. Выделение плазмиды, ее рестрикция и последующее выделение вырезанного фрагмента из агарозного геля после электрофореза проводили как описано в (Sambrook et al., 1989). Начало транскрибируемой последовательности Т7А1 промотора:.

5'-ATCGAGAGGGl0ACACGGCGAA20T21AGCCAT27CCCAA-3'..

3. Нуклеозид-5'-трифосфаты, динуклеозидтетрафосфаты, олигонуклеотиды, умбеллиферонтрифосфат.

В работе использовали dNTP, rNTP, ddTTP фирм Amersham Pharmacia Biotech, и Boehringer Mannheim. сЦТТР, p-L-dTTP, dN-5' -pppp-5'-dN rU-5'-pppp-5'-rU, d4AiSo-5,-ppp-5,-dT-синтезированы в ЛХБА ИМБ РАН..

В работе использовали олигонуклеотиды фирмы Oligos etc..

Умбеллиферонтрифосфат (Um-TP) синтезировали из монофосфата (Um-MP) фирмы Sigma согласно (Hoard and Ott, 1965). В 50 мкл DMF, содержащем 4.8 мкл ТВА, растворяли 5 мг (20 мкМ) Um-MP и добавляли 16.2 мг (100 мкМ) CDI. За ходом реакции наблюдали с помощью ТСХ на силикагельных пластинках (Sigma) в системе диоксан-изопропанол-аммиак-вода в равном соотношении. Исходный продукт полностью переходил в имидазолид за 10 мин при комнатной температуре. Имидазолид осаждали из реакционной смеси эфиром. Осадок высушивали и растворяли в 50 мкл DMF. К раствору добавляли 24 мкл ТВА и 17.7 мг (100 мкМ) пирофосфорной кислоты. Реакция проходила практически полностью за 30 мин при комнатной температуре. Образовавшийся Um-TP выделяли с помощью ТСХ в вышеописанной системе..

4. Составы буферов реакционных смесей для ДНКПIЕ. coli: 10 мМ Tris-HCl (рН 7.9), 5 мМ MgCl2 и 1 мМ DTTдля обратных транскриптаз (HTV RT, AMV RT): 10 mM Tris-HCl (рН 8.2),.

5 мМ MgCl2,40 мМ КС1 и 1 мМ DTTдля ДНКП, а человека: 10 мМ Tris-HCl (рН 7.4), б мМ MgCl2,0.4 мМ DTTдля ДНКП р человека: 10 мМ Tris-HCl (рН 8.5), 5 мМ MgCl2,0.4 мМ DTTдля ДНКП Т. aquaticus: 100 мМ Tris-HCl (рН 9.0), 1.5 мМ MgCl2,50 мМ КС1,.

1 мМ DTTдля Т7 РНКП: 50 мМ Tris-HCl (рН 8.0), 10 мМ MgCl2,1 мМ DTTтранскрипционный буфер (ТБ) для РНКП Е. coli: 50 мМ Tris-HCl (рН 8.0), 10 мМ.

MgCl2,100 мМ КС1 и 1 мМ 2-меркаптоэтанол..

5. Условия реакций, катализируемых ДНК-полимеразами. Анализ продуктов реакций.

5.1. Реакция полимеризации (реакция удлинения праймера).

Реакционные смеси объемом 6 мкл содержали соответствующий 1х буфер, комплекс [5 '-32Р]-праймер-матрица (30 нМ), фермент (0.1 ед. акт. для ДНКП IЕ. coli, 0.5 — для Taq ДНКП, 2.5 — для обратных транскриптаз, 2 — для полимераз аир человека) и низкомолекулярные субстраты (dNTP, ddTTP, сЦТТР, P-L-dTTP, либо dN-5'-px-5'-dN') в различных концентрациях. Пробы инкубировали 20 мин при 25 °C (для ДНКП IЕ. coli), 30 мин при 60 °C (для Taq ДНКП) и 30 мин при 37 °C для всех остальных ДНКП. Реакции останавливали, добавляя к пробе 3 мкл формамида, содержащего 0.5 М EDTA и по 0.1% бромфенолового синего и ксиленцианола. Продукты реакции разделяли с помощью высоковольтного электрофореза в 14% или 20% ПААГе в присутствии 8 М мочевины. Перед нанесением на гель пробы прогревали 2 мин при 100 °C. Гель после электрофореза анализировали методом авторадиографии с использованием рентгеновской пленки Retina RXfilm..

5.2. Реакции пирофосфоролиза и псевдопирофосфоролиза.

Пробы объемом б мкл включали соответствующий для каждой полимеразы буфер, 30 нМ комплекс «праймер-матрица» (комплекс В), фермент (0.1 ед. акт. ДНКП IЕ. coli или 2.5 ед. акт. AMV RT) и либо PPj, либо некомплементарные нуклеозид-5'-трифосфаты (p-I-TTP, dCTP, гСТР) в различных концентрациях. Реакционную смесь инкубировали 30 мин при 25 °C (для ДНКП IЕ. coli) или 30 мин при 37 °C (для AMV RT). Остановку и анализ продуктов реакции проводили как в 5.1. Перед остановкой реакции формамидом с красителями из нее отбирали аликвоту для анализа низкомолекулярных продуктов методом ТСХ на пластинке PEI-целлюлозы F (Merck). Разделение продуктов проводили в 0.2 М К фосфатном буфере (рН 8.0), содержащем 10% этанола. После хроматографии пластинку высушивали и экспонировали с рентгеновской пленкой Retina RX film..

6. Условия реакции синтеза РНК, катализируемой Т7 РНК-полимеразой.

Реакционная смесь объемом 10 мкл содержала 1х буфер для Т7 РНКП, плазмиду pTZ-18R (0.1 мг/мл), 0.05 мкг Т7 РНКП, АТР, СТР, GTP (250 мкМ каждый), 0.6 пмол [а-32Р]АТР с уд. акт. 2000 Ки/ммоль и либо UTP (250 мкМ), либо Up4U (250−1000 мкМ). Пробы инкубировали в течение 30 мин при 37 °C..

Количество синтезированной РНК оценивали по количеству [а-32Р]АМР, включившегося в кислотонерастворимую фракцию. Для этого после окончания инкубации реакционные смеси полностью переносили на фильтры Whatman ЗММ. Фильтры высушивали и затем промывали в: 1 раз — 10 мин в 10% трихлоруксусной кислоте (ТХУ) (5 мл на один фильтр) и 2 раза по 10 мин в 5% ТХУ. Фильтры высушивали и их радиоактивность определяли по Черенкову в жидкостном сцинтилляционном счетчике Intertechnique (Франция)..

7. Условия реакций, катализируемых РНК-полимеразой Е. coli..

Анализ продуктов реакций.

7.1. Условия реакции тотального синтеза РНК.

Реакционная смесь объемом 10 мкл содержала 1х ТБ, ДНК фага Т2 (100 мкг/мл), РНКП Е. coli (40 мкг/мл), динуклеотидную затравку СрА (100 мкМ), АТР, СТР, GTP (50 мкМ каждый), 0.6 пмол [а-32Р]АТР (2000 Ки/ммоль) и либо UTP, либо Up4U (50−500 мкМ). Инкубацию проводили 30 мин при 25 °C. Количество синтезированной РНК оценивали так же как в случае Т7 РНКП (п. 6)..

7.2. Условия реакций в системе, содержащей остановленный тройной элонгационный комплекс (ТЭК).

7.2.1. Остановленные ТЭК получали согласно (Kashlev et al., 1996). Для получения 3'-меченного ТЭК-2Ш 1 пмол РНКП Е. coli в 10 мкл ТБ смешивали с 3 мкл суспензии Ni-NTA агарозы, предварительно уравновешенной тем же буфером, и инкубировали 3 мин при 25 °C. Затем к смеси добавляли 1 пмол матричной ДНК в объеме 1 мкл, инкубировали 5 мин при 37 °C и промывали холодным ТБ (4 раза по 1 мл). Реакцию транскрипции инициировали, добавляя праймирующий тринуклеотид ApUpC (10 мкМ), АТР, GTP и СТР (каждый 20 мкМ) (когда получали ТЭК, содержащий радиоактивные метки по длине РНК, вместо АТР добавляли 0.3 мкМ [а-32Р]АТР с уд. акт. 3000 Ки/ммоль). Реакционную смесь инкубировали 6 мин при 37 °C и промывали холодным ТБ (4 раза по 1 мл). При этом образовывался ТЭК-20 (см. последовательность начала транскрибируемой области Т7А1 промотора). К отмытому ТЭК-20 добавляли [a-32P]UTP (0.3 мкМ, 3000 Ки/ммоль), инкубировали 5 мин при 25 °C и снова промывали холодным ТБ. ТЭК-11, ТЭК-12, ТЭК-13, ТЭК-14, ТЭК-27 получали аналогичным способом, но используя другие комбинации NTPs и [a-32P]NTPs..

7.2.2. Условия реакции полимеризации и пирофосфоролиза.

Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала 1х ТБ, 1 пмол ТЭК и либо NTP, либо РР,. Концентрации NTP и РР, время и температура инкубации указаны на рисунках. Реакцию останавливали, добавляя равный объем «стоп-буфера» (7 М мочевина, 20 мМ EDTA, по 0,25% бромфенолового синего и ксиленцианола), продукты реакций разделяли с помощью электрофореза в 20%-ном денатурирующем ПААГе (акриламид:бис-акриламид — 20:3). Гели сканировали на фосфоимиджере ImageQuant (Applied Biosystems)..

7.2.3. Условия проведения экзонуклеазного расщепления.

Как правило, экзонуклеазное расщепление проводили при 37 °C в ТБ, содержащем различные концентрации ионов Mg2+. В некоторых случаях в составе ТБ вместо Mg2″ 1″ присутствовали ионы Мп2+. Реакцию останавливали так же, как в случае полимеризации. Концентрации ионов металла, время и температуры реакций приведены на рисунках. Транскрипционные буферы с различными значениями рН содержали: 50 мМ Pipes-HCl (рН 6), 50 мМ Tris-HCl (рН 7−9), 50 мМ CAPS-NaOH (рН 10) — остальные компоненты как в ТБ..

Структура продукта экзонуклеазной реакции — нуклезид-5'-монофосфата была подтверждена методами ТСХ (на силикагельной пластинке в системе изопропанол-диоксан-аммиак-вода в равном соотношении) и электрофореза в ПААГе. При этом в качестве маркеров использовали нерадиоактивные соединения..

7.2.4. Условия проведения эндонуклеазного расщепления.

Эндонуклеазное расщепление проводили в ТБ в присутствии 10-кратного избытка по отношению к РНКП факторов Gre А, либо Gre В. Остановка реакции и анализ продуктов — как в случае реакции полимеризации..

7.3. Условия реакций в системе, содержащей искусственный ТЭК.

Последовательность и схема нуклеинового каркаса искусственного ТЭК приведена на рис. 27 А в разделе «Результаты и обсуждение». Последовательность ДНК совпадает в последовательностью Т7А1 промотора в регистре -15 нт.+35 нт., относительно точки начала транскрипции. Цепи ДНК полностью комплементарны друг другу. РНК-праймер комплементарен матричной цепи РНК, за исключением двух нуклеотидов с 5'-конца. В экспериментах использовалась РЖ, содержащая радиоактивную метку [32Р] на 5'-конце. Кинирование РНК проводили следующим образом. Пробу объемом 20 мкл, содержащую 200 пмол РНК, 20 ед. акт. Т4 полинуклеотидкиназы (Biolabs), буфер для киназы (Biolabs) и 5 мкл [уР]АТР (24 мкМ, 0.17 MCi/мкл), инкубировали 30 мин при 37 °C, после чего фермент инактивировали прогреванием в течение 25 мин при 65 °C..

Для получения ТЕК 13 1 пмол иммобилизованной HaNi-NTA агарозе РНКП инкубировали с 1 пмол смеси матричной ДНК и РНК-праймера в течение 5 мин при 37 °C. После этого РНКП промывалась от не связавшихся нуклеиновых кислот холодным ТВ, не содержащим ионов Ме2+, во избежание эндонуклеолитического расщепления РНК. После промывки к комплексу РНКП/матричная ДНК/РНК добавляли 10-кратный избыток нематричной нити ДНК, инкубировали 5 мин при 37 °C и промывали холодным ТВ без ионов металла. Условия реакций — такие же, как для натуральных ТЭК..

8. Реакции, катализируемые щелочной фосфатазой и фосфодиэстеразой змеиного яда.

Реакции, катализируемые щелочной фосфатазой проводили в буфере, содержащем 100 мМ Tris-HCl (рН 9.2), и 10 мМ MgCb. Реакционные пробы объемом 10 мкл помимо буфера содержали 2−5 мкМ немеченные субстраты (АТР или dTp4dA) и 0.1 ед. акт. фермента, либо 3 нМ радиоактивно-меченные субстраты ([аР]АТР или.

ТрзpdA) и.

0.001 ед. акт. фермента. Пробы инкубировали 2−5 мин при 37 °C..

Реакции, катализируемые фосфодиэстеразой змеиного яда, проводили в буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl (рН 8.6), 30 мМ MgCh, 3 мМ КС1 и 0.4 DTT. Реакционные пробы объемом 10 мкл содержали также либо 2 мкМ немеченные субстраты (АТР или dTp4dA) и 0.5−1 ед. акт. фермента, либо 3 нМ радиоактивно-меченные субстраты ([а-32Р]АТР или dTp3−32pdA) и 0.05 ед. акт. фермента. Пробы инкубировали 30 мин при 37 °C..

Обе реакции останавливали, добавляя 1 мкл 0.5 М EDTA, рН 8.0 и прогревая 3 мин при 100 °C. Продукты реакций анализировали с помощью ТСХ на PEI-целлюлозе F (Merck) в системе: 0.2М Иа-фосфатный буфер (рН 8.0), содержащий 10% этанола..

9. Метод «железного расщепления» .

Данный метод применялся для оценки сродства ионов металла к активному центру РНКП. За основу была взята методика (Zaychikov et al., 1996). В 10 мкл ТВ без MgCb смешивали 1 пмол РНКП с 1 пмол ДНК, содержащей Т7А1 промотор. Реакцию начинали, добавляя к этой смеси 10 мМ DTT и Fe (NH4)2(S04)2 в концентрациях 20−70 мкМ. Смесь инкубировали 20−70 мин при 21 °C, после чего в нее добавляли (1/3 от объема смеси) буфер, содержащий 0.5 М Tris-HCl (рН 8.0), 5 мМ DTT, 30% глицерина, 5% SDS и 0.05% бромфенолового синего. Продукты реакции разделяли с помощью SDS-электрофореза в 8%-ном ПААГе и прокрашивали с помощью Кумасси R-250 как в (Sambrook et al., 1989)..

10. Определение К* Km, Vmai.

10.1. Определение Kd ионов Me2+ с РНКП.

Константы диссоции ионов металла и РНКП вычисляли из графиков зависимостей начальных скоростей экзонуклеазного расщепления от концентрации ионов металла. Начальные скорости реакций определяли в условиях, при которых укорачивалось не более 20% исходного количества РНК ТЭК..

10.2. Определение Кт и Vmax для NTP при синтезе РНК в системе, содержащей.

ТЭК.

Значения Кга для NTP определяли из графиков зависимостей начальных скоростей реакций синтеза от концентрации субстрата. Определение начальных скоростей реакций проводили в условиях, когда удлинялось не более 20% исходного количества РНК ТЭК. За величину Vmax принимали значение начальной скорости реакции синтеза при 2 мМ концентрации NTP..

103. Определение Кт и Vmax для dNTP и dN-5'-pppp-5'-dN при синтезе ДНК, катализируемом HIV RT.

В односубстратных реакциях удлинения праймера, катализируемых HIV RT, ВеЛИЧИНЫ Кщ И Vmax определяли графическим методом Лайнуивера-Бэрка. Концентрации субстратов и время реакции были подобраны так, чтобы количество образовавшегося продукта было прямо пропорционально времени реакции (3 нМ праймер-матричный комплекс, 0,2 ед акт. фермента, 5 мин при 37 °C, концентрации субстратов варьировали от 0,05 до 2 мкМ). Скорость реакции рассчитывали как количество продукта (долю удлиненного на один нуклеотидный остаток праймера от общего количества праймера, взятого в пробу) за единицу времени. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 16%-ном денатурирующем ПААГе. Количество праймера пропорционально плотности пятен на радиоавтографе. Для определения плотности пятен использовали прибор Molecular Dynamics 300A Computing Densitometer (США)..

выводы.

1. ДНК-полимераза IЕ. coli и обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц способны катализировать реакцию вьпцепления 3'-концевого нуклеотидного остатка ДНК в присутствии высоких концентраций некомплементарных нуклеозид-5'-трифосфатов. При этом 3'-концевой остаток вьпцепляется в виде динуклеозид-5', 5″ -тетрафосфата..

2. Динуклеозид-5', 5'-тетрафосфаты могут служить субстратами для различных классов ДНКи РНК-полимераз. Динуклеозид-55″ -трии пентафосфаты также являются субстратами для ДНК-полимераз, хотя и менее эффективными, чем тетрафосфаты..

3. РНК-полимераза Е. coli обладает 3'-5'-экзонуклеазной активностью..

4. Некомплементарные r/dNTP резко стимулируют эту активность..

5. На основе трехмерной структуры и данных, полученных при изучении 3−5'-экзонуклеазной активности, включающих в себя мутационный анализ, построена модель активного центра РНК-полимеразы Е. coli..

6. Все реакции, осуществляемые РНК-полимеразой Е. coli (полимеризация, пирофосфоролиз, экзои эндонуклеазные расщепления РНК), катализируются одним активным центром..

7. Активный центр РНК-полимеразы Е. coli включает два иона Mg* Один из ионов прочно связан с активным центром (Mg-I) — второй (Mg-П) — слабо. В случае реакции полимеризации ион Mg-П дополнительно стабилизируется в активном центре Р, у-фосфатами входящего NTP, в случае стимулированной экзонуклеазной активности — Р, у-фосфатами некомплементарного NTP. В зависимости от типа реакции (синтез либо деградация) ионы Mg2+ функционально меняются ролями..

8. В работе постулируется наличие сайта связывания некомплементарного нуклеозидтрифосфата (£-сайт), который может являться предварительным местом связывания входящего NTP и играть роль в отборе правильного NTP в процессе синтеза РНК. ч.