О достоверности процедуры выравнивания первичных структур биополимеров

В последние годы установлены нуклеотидные последовательности большого числа геномов различной сложности — в том числе секвенированы геномы человека и нескольких млекопитающих. Установлено приблизительное число генов, кодирующих белки. В результате посттранскрипционных процессов число белков увеличивается в 2−3 раза по сравнению с числом кодирующих генов. Есть большое число родственных генов и, соответственно, родственных белков, объединяемых в семейства, некоторые из которых состоят из многих сотен представителей. Например, семейство иммуноглобулинов, семейства других белков, которые по степени сходства и функциональным свойствам подразделяют на подсемейства. Постоянно возникает необходимость сопоставления полипептидных последовательностей для установления степени родства, выявления наиболее консервативных и потенциально значимых участков. Аналогичные задачи стоят при исследовании родственных белков из разных организмов, находящихся на разных ступенях эволюции. Их решение позволяет устанавливать степень родства, а также скорость эволюции тех или иных белков. Для сравнения родственных полипептидных последовательностей, а также выявления врожденных и соматических мутаций проводится процедура выравнивания.

В последние годы в различных областях медицины исследуется генетический полиморфизм в отдельных локусах генома человека: анализ мутаций при диагностике наследственных заболеваний, определение наследственной предрасположенности к онкологическим заболеваниям, а также диагностика этих заболеваний на ранних стадиях (Senchenko et al, 2004; Kolchinskiii, Barskii, Zasedatelev, 2007; Rubina et al., 2008; Amit et al, 2007). Аналогичные задачи стоят при исследовании родственных белков из разных организмов, находящихся на разных ступенях эволюции. Их решение позволяет устанавливать степень родства, а также скорость эволюции тех или иных белков, разрешать проблемы молекулярной филогении (Koonin et al. 2000, Makarova, Kramerov, 2007).

Формально, выравнивание двух последовательностей представляет собой процедуру размещения символов одной последовательности под другой с добавлением пробелов, таким образом, чтобы взвешенная сумма сопоставленных позиций (премии) и пробелов (штрафы) достигало экстремального значения (минимума или максимума, в зависимости от метода расстояний или сходства).

Задача построения алгоритма для осуществления такой процедуры на основе методов динамического программирования была решена разными авторами (Туманян с соавт., 1966; Needleman and Wunsch, 1970; Smith and Waterman, 1981; Поройков с соавт., 1984). Среди наиболее широко используемых алгоритмов выравнивания укажем BLAST (Altschul, et al. 1990), FASTA (Lipman and Pearson, 1985). В последнее время разработан ряд алгоритмов для выравнивания последовательностей, учитывающих специфику вторичных структур белков (Wallqvist et al., 2000; Литвинов с соавт., 2006), а также их пространственных структур (Yang, 2002). При этом важно пониматьнасколько алгоритмическое выравнивание, полученное оптимизацией той или иной целевой функции, восстанавливает эволюционное выравнивание аминокислотных последовательностей, т. е. такое выравнивание, в котором сопоставлены те позиции сравниваемых белков, которые происходят от одной и той же позиции их общего предка. Так, например, для построения эволюционных деревьев аминокислотных последовательностей в настоящее время широко применяются методы, основанные на определении расстояния между последовательностями (Saitou and Neil, 1987). Способы измерения расстояния между двумя последовательностями можно отнести к двум классам: 1-й — простым подсчетом доли (процентного содержания) несовпадающих позиций- 2-й — с использованием матриц весов замен аминокислот (Hollich et а1., 2005). При1 применении способов измерения расстояния второго типа необходимо иметь достоверные выравнивания каждой пары последовательностей, расстояние между которыми определяется. Процедура выравнивания, применяемая с целью выявления мутаций и делеций в белках, может иметь первостепенное значение для диагностики и выбора стратегии терапии заболеваний. Таким образом, решение вопроса о биологической корректности алгоритмически полученных выравниваний является актуальной задачей.

Цель настоящей работы состояла в разработке универсального метода оценки эффективности процедуры выравнивания двух последовательностей в зависимости как от эволюционного расстояния между выравниваемыми последовательностями, так и от типа применяемой процедуры выравнивания (алгоритм для глобального выравнивания Нидлмана-Вунша и для локального выравнивания Смита-Ватермана). Исходя из поставленной цели, были сформулированы задачи исследования:

1. На основании существующей модели эволюции аминокислотных последовательностей оценить качество восстанавливаемости истинных выравниваний методом глобального выравниваниявыяснить причины неточного восстановления истинных выравниваний.

2. На основании предложенной эволюционной модели произвести сравнительную оценку качества выравниваний, построенных глобальным и локальным алгоритмамивыявить предельные условия применения глобального и локального алгоритмов выравнивания.

выводы.

1. Исследование достоверности алгоритмических выравниваний, проведённое на модельных парах аминокислотных последовательностей в диапазоне эволюционных расстояний от 60 до 300 РАМ показало, что уровень восстанавливаемости истинных выравниваний алгоритмическими существенно зависит от эволюционного расстояния между последовательностями и составляет 97-^98% для расстояния 60 РАМ и 70-^-72% для расстояния 300 РАМ, независимо от длины последовательностей биополимеров.

2. Показано, что относительное возрастание показателя сходства выровненных последовательностей (1с1) алгоритмических выравниваний по сравнению с истинными выравниваниями, происходящее с увеличением эволюционного расстояния, связано с уменьшением суммарной длины вставок-делеций в алгоритмических выравниваниях последовательностей биополимеров. Таким образом, за счёт уменьшения длины вставок-делеций в алгоритмических выравниваниях завышается число совпадений, что приводит к снижению сходства с истинными выравниваниями.

3. Показано, что наиболее выраженной тенденцией в алгоритмическом выравнивании, вызывающей снижение его сходства с истинным, является уменьшенное число ' вставок-делеций относительно истинного (в «70% выравниваний от общего числа). Тенденция к увеличению средней длины вставок-делеций менее значительна (в 26% от общего числа выравниваний). Наличие именно этих двух тенденций в алгоритмических выравниваниях приводит к наибольшему отличию от истинных выравниваний. Уровень сходства с эталоном этих выравниваний в среднем на 6-н9% ниже уровня, достигаемого при равенстве как числа, так и средней длины вставок-делеций в алгоритмическом и истинным выравниваниях, что является ресурсом для улучшения процедуры выравнивания.

4. Проведено исследование по определению области применения глобального и локального вариантов алгоритма выравнивания Смита-Ватермана на модельных последовательностях неоднородной по длине гомологии. Получены зависимости мер качества глобального и локального выравниваний последовательностей полипептидов с негомологичными консолями от следующих величин: 1) эволюционного расстояния между гомологичными фрагментами последовательностей- 2) длины консолей- 3) асимметрии консолей (сдвига ядра). Показано, что при симметричном расположении консолей глобальный алгоритм показывает большую устойчивость к увеличению эволюционного расстояния и длины консолей, чем локальный алгоритм.

5. Разработана методика определения порога применения глобального алгоритма, то есть тех значений указанных параметров (см. пункт 4) до которого качество глобального выравнивания выше качества локального выравнивания, но после которого происходит резкое понижение качества глобального выравнивания, но качество локального не снижается.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Приношу глубокую благодарность моему руководителю Владимиру Гайевичу Туманяну за предложенную тему, постоянное внимание к работе и плодотворное обсуждение полученных результатов. Я благодарен Михаилу Абрамовичу Ройтбергу за участие в оценке результатов и за внесенные им конструктивные предложения по расширению области исследования. Глубоко признателен Наталии Георгиевне Есиповой за моральную поддержку и внимание.

Благодарю Петра Власова за предоставленные программы и техническую поддержку, а также всех сотрудников лаборатории, помогавших мне на отдельных этапах проведения работы.

1.8.

Заключение

.

За последнее время прогресс в области математического анализа биологических последовательностей был обусловлен двумя тенденциями: первая — уточнение формальных постановок задач с целью приблизить их к содержательным биологическим задачам и особенностям изучаемых объектоввторая — привлечение новых математических идей. В качестве примера такого прогресса в области биологически-адекватного сравнительного анализа последовательностей можно назвать введение понятие частотного профиля семейств последовательностей, разработку методов их построения и использования при поиске родственных последовательностей (Eddy, 1998; Sunyaev et al., 1999; Stark et al. 2003; Finkelstein AV, Roytberg MA., 1993). Как уже было упомянуто, способность алгоритмов выравнивания отражать биологическую специфику последовательностей во многом определяется типом используемой весовой функции (см. комментарий к теореме 3). Выделению класса весовых функций делеций, допускающих построение эффективного алгоритма выравнивания посвящены работы (Myers and Miller, 1988; Ройтберг, 1984), которые могут быть примером привлечения усовершенствованных математических методов.

Предсказанию дальних гомологий структур белков, основаванному на статистической значимости, посвяшено значительное число работ (Bray et al., 2000; John and Sali, 2004; Madden et al.,.2001; Mayr et al., 2007; Mitrophanov and Borodovsky, 2006; Shah et al., 2008).

Другим направлением в изучении выравниваний последовательностей белков является решение вопроса о соответствии алгоритмически полученных выравниваний биологически корректным.

Качество" алгоритмов выравнивания, т. е. соответствие между алгоритмическими и «эталонными» выравниваниями рассматривалось с разных точек зрения. При этом в качестве эталона обычно использовались выравнивания, основанные на сопоставлении пространственных структур, что основано на том соображении, что трехмерные структуры белков более консервативны, чем их последовательности (Doolittle, 1981), хотя это само по себе не является безусловным критерием. В работе Вингрона и Аргоса (Vingron and Argos, 1990) показана связь между устойчивостью (консервативностью) области оптимального глобального выравнивания во множестве субоптимальных выравниваний и её сходством со структурным выравниванием. Показано, что области оптимального выравнивания, наиболее часто повторяющиеся в субоптимальных выравниваниях, имеют большее сходство со структурным выравниванием.

В работах (Mevissen and Vingron, 1996; Schlosshauer and Ohlsson, 2002) оценка достоверности оптимального выравнивания основана на определении достоверности каждой пары сопоставленных аминокислотных остатков, в результате чего строится зависимость «индекса надёжности» (robustness index) от номера выровненной пары остатков. Так, в работе Мевиссена и Вингрона в качестве меры надёжности сопоставления i-ro и j-ro остатков принимается разность весов оптимального выравнивания и выравнивания с наибольшим весом, в котором элементы i и j не сопоставляются. В работе (Schlosshauer and Ohlsson, 2002) мера надёжности сопоставления i-ro и j-ro остатков основана на замещении дискретной функции «шах» в определении алгоритма динамического программирования на непрерывную функцию, зависящую от параметра. Это позволяет оценить наличие субоптимальных конкурентов для данной выровненной пары остатков и, таким образом, получить значение достоверности их сопоставления. Полученный для каждой пары индекс даёт представление о локальной достоверности выравнивания.

В работах Фогт с соавторами (Vogt et al., 1995), Доминик с соавторами (Domingues et al., 2000) и Сюняев с соавторами (Sunyaev et al., 2004.) и на основании сравнения структурных выравниваний с локальными алгоритмическими выравниваниями Смита-Ватермана были сделаны выводы о возможности восстановления структурного выравнивания алгоритмическим в зависимости от степени сходства белков. Кроме того, в работе (Sunyaev et al., 2004.) изучение внутренней структуры тех и других выравниваний позволило создать более эффективную процедуру выравнивания двух последовательностей, учитывающую не только средний уровень их идентичности, но и распределение более или менее совпадающих участков последовательностей в структурном выравнивании.

Недостатком всех цитированных работ является то, что алгоритмические выравнивания сравнивались не с истинным эволюционным выравниванием, которое неизвестно, а с его приближением, что вносит в результаты погрешность, величина которой не поддается оценке. Мы предлагаем для оценки качества алгоритмов сравнивать искусственно сгенерированные последовательности, для которых истинное выравнивание известно «по построению». Подобный численный эксперимент был осуществлен (Polyanovskii, et al., 1995), однако, построение тестового набора последовательностей не отражало в полной мере имеющихся данных об эволюционном процессе, поскольку применялась упрощенная схема внесения делеций (вставки вообще не рассматривались). Впоследствии при генерации тестовых последовательностей нами была использована общепринятая в настоящее время модель эволюции, описанная в (Dayhoff et al. 1978; Benner et al., 1993; Reese, et al., 2002), которая включала в себя точечные замены, а также вставки и делеции. Проведён сравнительный анализ структуры вставок-делеций и замен в алгоритмических и эталонных выравниваниях. Анализ показал, что различия между алгоритмическими и эталонными выравниваниями, в основном, проявляются в различии в количестве и средних длинах вставок-делеций. Получены численные значения средней достоверности метода глобального выравнивания с аффинными штрафами за делеции (глобальный вариант метода Смита-Ватермана) для эволюционных расстояний от 60 до 300 РАМ. Эти значения существенно выше, чем соответствующие значения для локального варианта метода Смита-Ватермана. Таким образом, появляется возможность альтернативной оценки качества выравнивания, вне зависимости от информации о пространственной структуре.

Это позволяет выяснить причины неточного восстановления истинных выравниваний вне ошибки, вносимой особенностями той или иной базы данных.

Глава 2. МЕТОД ОЦЕНКИ КАЧЕСТВА ГЛОБАЛЬНОГО ВЫРАВНИВАНИЯ ДВУХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ.

2.1. Общее описание процедуры определения качества выравнивания.

Процедура определения качества алгоритма парного выравнивания состояла в следующем. Строится тестовое множество, состоящее из 10 000 пар сгенерированных последовательностей в 20-буквенном алфавите, соответствующем кодам аминокислот. Первая последовательность в каждой паре — случайная последовательность, вторая получена из первой путём мутационного процесса, включающего как замены, так и вставки и делеции. Данные о внесенных в первую последовательность изменениях сохраняются и являются истинным выравниванием. Далее, с помощью тестируемого алгоритма строятся выравнивания для каждой тестовой пары последовательностей и производится сравнение алгоритмического выравнивания с истинным. Ниже описаны детали этой методики.

2.2. Генерация исходных последовательностей первые элементы пар).

Исходные последовательности — это случайные последовательности, в которых каждый символ генерировался датчиком случайных чисел независимо от остальных с некоторой частотой. Распределение частот встречаемости аминокислот было принято соответствующим среднему аминокислотному составу белков, приведенному в работе Дейхофф с соавт (Dayhoff М. е! а1., 1978). Мы построили два тестовых набора по 10 000 последовательностей в каждом, в одном все последовательности имеют длину 200, в другом — 500. Соответствие полученного распределения частот встречаемости аминокислот заданному распределению оценивалось величиной || АБ151г || / || Б1з1х ||, где.

— требуемое распределение частот встречаемости аминокислот, ADistrразность векторов реально полученного распределения и требуемого распределения,.

Х|| = Е |Xj| - норма числового вектора X =.

2.3. Модифицирование исходных последовательностей вторые элементы пар).

Модифицирование исходных последовательностей состояло из поэтапного внесения делеций, точечных замен (мутаций) и вставок. При этом на основе каждой исходной последовательности мы строили 4 тестовых пары, соответствующих эволюционным расстояниям 60, 100, 200, 300 РАМ (РАМPoint Accepted Mutations — число происшедших точечных замен). Таким образом, было получено 2×4=8 тестовых наборов по 10 000 пар последовательностей в каждом.

2.3.1 Делеции и вставки i) Суммарная длина вставок и делеций.

Суммарная длина вставок и делеций D для каждой исходной последовательности полагалась равной.

D = LP (indel)-M5, (1) где L — длина последовательности;

P (indel) — вероятность возникновения вставки-делеции, которая согласно работе Беннер с соавт.(Веппег S.A. et al., 1993), вычислялась по формуле:

P (indel) = 0.0224 — 0.0219- е («°-1 168*РАМ), (2) где РАМ — число, характеризующее эволюционное расстояние между исходной и измененной последовательностями;

Мб — математическое ожидание длины вставки-делеции:

M5 = Id=1.dmaxd-P{5=d}, (3) где P{5=d} - вероятность возникновения вставки-делеции длиной d, взятое из распределения Ципфа, которое, согласно работе Беннер с соавт., не зависит от значения эволюционного расстояния.

Для каждой пары исходной и модифицированной последовательностей суммарная длина вставок была равной суммарной длине делеций, и равна D/2. ii) Внесение делеций.

В исходной последовательности длины L, с помощью датчика случайных чисел, исходя из равномерного распределения, выбирался номер элемента последовательности N, 1.

Ш) Внесение вставок.

Начало вставки и ее длина определялись так же, как для делеций. При этом точка начала вставки выбиралась только из множества позиций последовательности, полученной после внесения делеций. В случае совпадения выбранной позиции с началом уже имеющейся вставки, попытка игнорировалась. Так как отсеивание попыток не зависело от длины предполагаемой вставки, то нет оснований предполагать возникновение систематической ошибки в распределении длин вставок. Буквенный состав вставок генерировался аналогично исходным последовательностям.

2.3.2 Точечные замены (мутации).

Точечные замены вносились после делеций и вставок в неделетированные участки исходной последовательности (вставки также игнорировались). Внесение замен выполнялось двумя способами:

1) с использованием матрицы замен РАМ1. Для каждой буквы исходной последовательности с помощью датчика случайных чисел из соответствующего столбца матрицы выбирается другая буква или та же самая. Число проходов последовательности равно требуемому значению эволюционного расстояния (60, 100, 200 или 300 РАМ) для мутированной последовательности.

2) с использованием матрицы замен, полученной возведением матрицы РАМ1 в степень равную числу, определяющему эволюционное расстояние (60, 100, 200 или 300 РАМ). Число проходов последовательности равно одному. При тестировании процедуры (1) было получено следующее соответствие средней доли совпадений (%6) числу РАМ (примерно одинаковые для обоих способов мутирования):