Действие протеолитических ферментов на вирионы вируса гриппа

Вирус гриппа является серьёзным патогеном человека, который на протяжении XX столетия вызвал три пандемии [1, 2]. Каждая из этих пандемий связана с обширной заболеваемостью, серьезными социальными проблемами, большими экономическими потерями и, в случае пандемии сезона 1918;1919, высокой смертностью [3, 4]. Однако, общее количество случаев заболеваемости и смертности на протяжении периодов между пандемиями на самом деле превосходит эти показатели для пандемий. Различают три типа вирусов гриппа: А, В и С. Вирус гриппа типа, А представляет наибольшую угрозу здоровью населения. Пандемии XX века были вызваны штаммами вируса гриппа типа, А подтипов H1N1 (1918), H2N2 (1957) и H3N2 (1968) [1].

В настоящее время, начиная с июня-июля 2009 г. началась пандемия нового штамма антигенно родственного вирусу гриппа свиньи (подтип H1N1). Пандемический штамм вируса возникает намного реже эпидемических штаммов, в результате комбинирования генетического материала вируса гриппа типа, А человека с генами вирусов гриппа птиц и/или млекопитающих, в результате чего образуется новый штамм, против которого у человека нет естественного иммунитета. Это приводит к началу пандемии — эпидемии в мировом масштабе. При этом имеется достаточно высокая вероятность появления в ближайшем будущем новых высоко патогенных штаммов вируса. Именно высокий пандемический потенциал сделал вирус гриппа объектом углубленных исследований.

Молекулярная структура оболочечных вирусов, к которым относится вирус гриппа, представляет собой яркий пример совершеннейших макромолекулярных комплексов, формирование которых достигается посредством высокой специфичности взаимодействия всех структурных компонентов вириона. Как проникновение вирусного генома внутрь клетки, так и морфогенез дочерних вирионов обеспечиваются согласованной работой основных вирусных белков оболочки вириона, главным образом, трансмембранных гликопротеинов гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) и мембран-ассоциированного матриксного белка Ml, образующего слой непосредственно под липидным бислоем вирусной мембраны. Это делает крайне актуальными работы, направленные на структурные исследования оболочки вириона. До настоящего времени исследование структурно-функциональных особенностей поверхностных гликобелков вируса гриппа остается одной из ключевых задач структурной вирусологии.

Впервые использование вирионов вируса гриппа, А как субстрата для действия протеолитического фермента бромелаина датировано 1970 годом в работе Компанса [5]. Позже этот прием был использован Брандом и Скеелом [6]. Целью этих авторов была последующая кристаллизация отщепляемых с поверхности вириона эктодоменов гемагглютинина. В использованных условиях протеолиза «шипы» нейраминидазы, по-видимому, полностью разрушались. Субвирусные же частицы, т. е. вирионы, лишённые частично или полностью эктодоменов гликобелков, ранее детально не изучались.

Принимая во внимание чрезвычайную сложность структурной организации вирионов вируса гриппа, необходимо было провести более углубленное исследование последействия протеолиза на интактный вирион. Кроме того, субвирусные частицы могли быть использованы как удобная система для выделения и структурного исследования С-концевых сегментов гемагглютинина, остающихся заякоренными в мембрану вириона после удаления эктодоменов гемагглютинина ферментом. Эти сегменты являются нетривиальной задачей для структурных исследований в силу своей гидрофобности и наличия пост-трансляционных модификаций.

Основной целью данной работы являлось определение возможностей протеолиза как инструмента для понимания структурно-функциональных особенностей компонентов оболочки вириона вируса гриппа.

В работе решались следующие задачи:

• изучение действия различных протеолитических ферментов на вирион вируса гриппа с целью подбора оптимального фермента и условий проведения протеолиза;

• анализ сохранности вирусной мембраны после проведения протеолитической обработки вирионов ;

• изучение явления доступности мембран-ассоциированного белка Ml в составе вириона ограниченному протеолизу ферментами при удалении поверхностных гликобелков;

• анализ первичной структуры С-концевого фрагмента малой цепи гемагглютинина и характера его посттрансляционной модификации высшими жирными кислотами.

Научная новизна и практическая значимость работы. В данной работе впервые подробно изучено действие протеолитических ферментов разных классов на интактные вирионы вируса гриппа. Показана эффективность подобного подхода для изучения особенностей структуры компонентов оболочки вириона. Сложность структурной организации данной макромолекулярной многокомпонентной биологической системы определяет сложность и многофакторность процесса протеолиза. Впервые показано, что протеолиз поверхностных гликобелков вириона приводит к нарушению целостности его мембраны и, как следствие, ограниченному протеолизу мембран-ассоциированного матриксного белка Ml. Изучение явления фрагментации белка Ml в составе вириона открывает возможности для изучения топографии его поверхности.

Впервые протеолиз целых вирионов был использован как подход для изучения структурной организации той области гомотримерного «шипа» НА, которая не была закристаллизована и, следовательно, не могла быть изучена методом рентгено-структурного анализа, а именно, области «ножки» шипа. В ходе работы был разработан ряд простых и эффективных методик выделения С-концевых сегментов гемагглютинина вируса гриппа из обработанных ферментом вирионов. На основании данных масс-спектрометрического анализа выделенных сегментов впервые были идентифицированы сайты расщепления гемагглютинина на поверхности вирионов целого ряда штаммов вирусов гриппа А, В и С ферментами разных классов и обнаружено, что локализация сайтов гидролиза определяется, главным образом, стерической доступностью зоны расщепления для молекулы фермента.

Впервые был изучен характер посттрансляционной модификации консервативных остатков цистеина С-концевого фрагмента гемагглютинина высшими жирными кислотами у рекомбинантных штаммов вируса гриппа А, включающих гемагглютинин с одиночными делециями сайтов ацилирования, а также у вирусов гриппа В и С. Таким образом, гипотеза о локализации стеарата на остатке цистеина, расположенном на границе трансмембранного и цитоплазматического доменов, была доказана для всех эволюционных типов вируса гриппа.

Результаты, полученные в данной работе, продвигают нас в понимании структурной организации оболочки вириона вируса гриппа, которое, в частности, необходимо для разработки новых эффективных средств защиты от инфекции.

Список сокращений.

БСА — бычий сывороточный альбумин.

ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография.

ТХУ — трихлоруксусная кислота.

ПААГ — полиакриламидный гель.

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота.

3Dтрехмерный (в ряде случаев использовано для сокращенного обозначения простанственной структуры).

ЗМЕ — Р-меркаптоэтанол DMF — диметилформамид DTT — дитиотреитол Glp — пироглутамил.

НА — гемагглютинин вирусов гриппа, А и В.

HEF-гемагглютинин-этераза вируса гриипа С.

NA — нейраминидаза вирусов гриппа, А и В.

PMSF — фенилметилсульфонилхлорид.

PSA — персульфат аммония pNA — и-нитроанилид.

SDS — додецилсульфат натрия.

STE — буферный раствор Трис-HCl, содержащий ЭДТА и NaCl ТЕ — буферный раствор Трис-HCl, содержащий ЭДТА. TEMED — N, N, Ы', Ы'-тетраметилэтилендиамин Ингибиторы:

Е-64 — Ь-А"ранс-эпоксисукцинил-лейциламидо (4-гуанидино)бутан PMSF — фенилметилсульфонилфторид.

выводы.

1. Предложено использование протеолиза в качестве нового подхода для изучения структурной организации компонентов оболочки вириона вируса гриппа. Изучено действие ряда сериновых, цистеиновых и металлопротеиназ на вирион вируса гриппа и подобраны оптимальные условия протеолиза поверхностных гликобелков бромелаином.

2. Изучено последействие протеолиза на интактный вирион вируса гриппа. Выявлено нарушение целостности липидного бислоя вирусной мембраны при обработке вирионов бромелаином в отсутствие восстанавливающего реагента.

3. Обнаружено явление доступности мембран-ассоциированного матриксного белка Ml ограниченному протеолизу бромелаином в составе вирионов при удалении поверхностных гликобелков. Выяснено, что белок Ml подвергается гидролизу бромелаином из-за нарушения целостности липидной мембраны вириона.

4. Проведен анализ первичной структуры С-концевого фрагмента малой цепи гемагглютинина. Впервые идентифицированы сайты расщепления гемагглютинина на поверхности вирионов вирусов гриппа А, В и С протеолитическими ферментами разных классов. Обнаружено, что локализация сайтов гидролиза определяется главным образом стерической доступностью основания «шипа» для молекулы фермента.

5. Изучен характер пост-трансляционной модификации консервативных остатков цистеина С-концевого фрагмента легкой цепи гемагглютинина высшими жирными кислотами у вирусов гриппа А, В и С. Подтверждена гипотеза о локализации стеарата на остатке цистеина, расположенном на границе трансмембранного и цитоплазматического доменов, для всех эволюционных типов вируса гриппа.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям, сотрудникам НИИ ФХБ имени А. Н. Белозерского МГУ доктору хим. наук Баратовой JT.A. и канд. биол. наук Кордюковой Л. В. за неоценимую помощь и руководство на протяжении всего времени выполнения и написания диссертационной работы.

Автор благодарит д.б.н. Маркушина С. Г. (ГУ ИВС имени И. И. Мечникова РАМН), академика РАМН, доктора мед. наук, проф. Каверина Н. В. (ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН), Кропоткину Е. А. и д.б.н. Гамбарян А. С. (ГУ ИПВЭ имени М. П. Чумакова РАМН), а также докт. М. Файта (Berlin Free University) за предоставление препаратов вируса, зав. отделом электронной микроскопии НИИ ФХБ имени А. Н. Белозерского, д.б.н., проф. Полякова В. Ю. за неоценимую помощь в проведении электронно-микроскопических исследований, к.х.н. Серебрякову М. В. (ФГУ НИИ ФХМ Росздрава) за проведение масс-спектрометрического анализа образцов и сотрудников лаборатории белков растений отдела функциональной биохимии биополимеров (д.б.н. Дунаевского Я. Е., д.б.н. Белозерского М. А., к.б.н. Элпидину Е.Н.) за предоставление оборудования для проведения денситометрического анализа электрофореграмм.

Автор очень признателен сотрудникам лаборатории химии белка кафедры Химии природных соединений Химического факультета МГУ д.х.н. Филипповой И. Ю., к.х.н. Лысогорской Е. Н., к.х.н. Баландиной Г. Н., к.х.н Бачевой А. В., Семашко Т. А. за постоянную поддержку и полезные методические советы в ходе выполнения работы, к.х.н. Оксенойт Е. С. за синтез субстрата для тестирования гидролитической активности бромелаина.

Автор также очень благодарен всем сотрудникам отдела хроматографии НИИ ФХБ им. А. Н. Белозерского за обучение и полезные советы в ходе выполнения экспериментальной работы, к.х.н. Гоптарь И. А., Аникиной О. М. и к.х.н. Семёновой С. А., и всем, оказавшим поддержку и помощь в процессе выполнения диссертационной работы.

1.5.

Заключение

.

Из обзора литературы следует, что к настоящему времени имеются кристаллографические данные о структуре водорастворимых фрагментов гликопротеина гемагглютинина многих штаммов вирусов гриппа типов, А и В, а также белка гемагглютинин-эстеразы вируса гриппа С. Также имеются данные рентгеноструктурного анализа для фрагмента (две трети молекулы) матриксного белка Ml.

С другой стороны, гораздо меньше ясности и возможных подходов к изучению заякоренного в мембрану вириона С-концевого сегмента гемагглютинина, а также для определения роли гибкой «ножки шипа» гемагглютинина в выполнении его функции. Для верной оценки значимости ацилирования остатков цистеина в биологии вируса гриппа необходимыми являются данные о характере и степени ацилирования С-концевого сегмента гемагглютинина, а также о распределении модифицирующих остатков (т.е. о характере ацилирования каждого из остатков цистеина). Адекватного подхода для структурного исследования ацилированния гемагглютинина на молекулярном уровне до недавнего времени в мировой науке не было. Первые появившиеся работы, которые происходят из нашей лаборатории, наметили возможность таких исследований с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии.

К настоящему времени получение структурной информации для каждого из мембранных и мембран-ассоциированных белков в составе оболочки вириона представляет интерес для понимания их функций на различных этапах жизненного цикла вируса.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1. Изучение протеолиза гемагглютинина на поверхности вирионов вируса гриппа.

2.1.1. Действие различных протеолитических ферментов на вирион вируса гриппа.

На первом этапе работы были изучены возможность и условия получения субвирусных частиц обработкой вирионов вируса гриппа рядом протеолитических ферментов.

На примере вируса гриппа штамма штамма A/Puerto Rico/8/34 был изучен протеолиз эктодоменов поверхностных гликопротеинов гемагглютинина и нейраминидазы в составе интактных вирионов протеиназами, относящимися к различным классам и различной специфичностю. Основное внимание было уделено гидролизу гемагглютинина.

Были использованы цистеиновые протеиназы бромелаин и папаин, сериновые протеиназы субтилизин Карлсберг, трипсин и а-химотрипсин, ферментный препарат проназа Е (протеиназа из Streptomyces griseus) и металлопротеиназа термолизин. После проведения реакции гидролиза вирионы отделяли от фермента и эктодоменов поверхностных гликопротеинов высокоскоростным центрифугированием через 20%-ный раствор сахарозы в буферном растворе (0.01 М STE (0.1 MNaCl, 0.01 М Трис-HCl, 0.001М ЭДТА, рН 7.4−7.6) или 0.01 М Трис-HCl, рН 7.4−7.6) и исследовали методом SDS-электрофореза по Лэммли (рис. 16.).

Рис. 16. Электрофоретический анализ препаратов субвирусных частиц, полученных обработкой вирионов вируса гриппа штамма A/Puerto Rico/8/34 протеолитическими ферментами (0.25−2 мг/мл). 1 — интактные вирионы- 2−11 — вирионы после 16 ч гидролиза при 37 °С: 2 — вирус: бромелаин = 4: 1,5 мМ Р-меркаптоэтанола- 3 — вирус: бромелаин = I: 1, без p-меркаптоэтанола, без остановки реакции- 4 — вирус: папаин = 2:1,5 мМ р-меркаптоэтанола- 5 — вирус: проназа = 2: 1- 6 — вирус: субтилизин Карлсберг =1: 2- 7 -вирус: трипсин = 1: 2 в буфере, содержащем ионы кальция, без остановки реакции- 8 -вирус: трипсин = 1: 2 в буфере, содержащем ЭДТА, без остановки реакции- 9 — вирус: а-химотрипсин = 1: 2- 10 — вирус: термолизин =1:1, без остановки реакции. MWбелковые маркеры для электрофореза.

Было обнаружено, что цистеиновые протеиназы бромелаин и папаин эффективно гидролизовали эктодомены гемагглютинина и нейраминидазы. Ферментный препарат проназа, а также сериновые протеиназы субтилизин Карлсберг и трипсин удаляли поверхностные гликопротеины частично, в то время как а-химотрипсин и металлопротеиназа термолизин их практически не гидролизовали.

При инкубации вирионов с трипсином была обнаружена зависимость результата реакции от наличия в системе хелатирующего агента ЭДТА: использование трипсина в буфере с хелатором приводило к избирательному отщеплению второго гликопротеина оболочки вириона — нейраминидазы (NA, рис. 16, дорожка 10, а также [104]), в то время как НА практически не удалялсяв присутствии ионов кальция наблюдался частичный гидролиз эктодоменов гемагглютинина.

На основании полученных данных для удаления поверхностных гл и коп роте и нов с поверхности вирионов было решено использовать цистеиновую протеиназу бромелаин.

2.1.2. Оптимизация протокола получения субвирусных частиц при обработке вирионов бромелаином.

Для оптимизации условий получения т.н. субвирусных частиц (вирионов, лишенных эктодоменов поверхностных гликопротеинов) процесс протеолиза белков оболочки вирионов цистеиновой протеиназой бромелаином был изучен более подробно.

2.1.2.1. Влияние времени проведения реакции на гидролиз гемагглютинина.

Используя в качестве начальных условий постановки ферментативной реакции условия, описанные в работе Бранда и Скеела (вирусные частицы суспендировали в 0,1 М буфере Трис-HCl, рН 7,2, содержащем 50 мМ меркаптоэтанола и 0,001 М ЭДТА, см. [6]), был проведен кинетический анализ гидролиза эктодоменов поверхностных гликобелков вирионов вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 бромелаином. Для этого через фиксированные промежутки времени после начала реакции в реакционную смесь добавляли необратимый ингибитор цистеиновых протеиназ Е-64, ультрацентрифугированием выделяли субвирусные частицы из реакционной смеси и проводили электрофоретический анализ (SDS-электрофорез в полиакриламидном геле по Лэммли) полученных образцов.

Полное удаление поверхностных гликопротеинов в данных условиях достигалось уже за Зч после начала гидролиза (рис.17).

1 2 3 4 5 6 MW, кДа при концентрации (3-меркаптоэтанола 50 мМбромелаин: вируе 1:1, 37 °C, остановка реакции 10″ 5 М Е-64. Вирионы инкубировали с ферментом в течение 0.5 ч (I), 1.5 ч (2), 3 ч (3), 6 ч (4), 18 ч (5). 6 — интактные вирионыMW — белковые маркеры для электрофореза.

2.1.2.2. Влияние соотношения ферментгвирус на процесс удаления гемагглютинина.

В ряде экспериментов было изучено влияние количества фермента в реакционной смеси на скорость гидролиза поверхностных гликопротеинов.

Для этого была изучена временная зависимость гидролиза гемагглютинина бромелаином в присутствии 50 мМ (3-меркаптоэтанола с поверхности вирионов при различном соотношении фермент: вирусный белок (измеренному по методу Петерсона, см. [113]). Сравнением интенсивностей полос гемагглютинина на электрофореграммах субвирусных частиц, полученных обработкой вирионов за одинаковые промежутки времени и различном соотношении вирус: фермент (которое проводили методом денситометрического анализа электрофоре грамм), было показано, что снижение количества фермента в 4 раза (вирус:фермент = 4: 1) не приводит к существенному увеличению времени, необходимого для полного удаления эктодоменов гемагглютинина (не представлено).

2.1.2.3. Влияние типа и концентрации восстанавливающих реагентов на гидролиз гемагглютинина.

Также было изучено действие бромелаина на вирион в присутствии различных количеств восстанавливающих реагентов двух типов — р-меркаптоэтанола и дитиотреитола.

В отдельном опыте была изучена активность бромелаина по гидролизу высокоспецифичного хромогенного субстрата цистеиновых протеиназ Glp-Phe-Ala-pNA в присутствии разных концентраций восстанавливающих реагентов (рис. 18, а и 19, а).

Наибольшая активность фермента наблюдалась в присутствии 5 мМ (3-меркаптоэтанола. Обработка нативных вирионов бромелаином при этой концентрации восстанавливающего реагента дала возможность получить субвирусные частицы, полностью лишенные эктодоменов гемагглютинина. (рис. 18, б).

Проведением кинетического анализа гидролиза вирионов бромелаином в присутствии двух различных концентраций меркапоэтанола (оптимальной (5мМ), при которой достигается наибольшая активность фермента, и более высокой (50 мМ), которая приводит к значительному снижению активности фермента, но была использована в классических методиках по выделению эктодоменов, было показано, что для полного удаления эктодоменов НА высокои низкоактивным ферментом при одинаковом соотношении бромелаин/вирус требовались одинаковые промежутки времени: 3 ч (рис. 20). По-видимому, скорость реакции в данной системе определяется не только удельной активностью фермента, но, главным образом, стерической доступностью субстрата.

В данной системе РМЕ действует сразу на несколько мишеней. Во-первых, он восстанавливает SH-группы в активном центре молекулы бромелаина. Высокая концентрация РМЕ, по-видимому, вызывает также и разрушение/перегруппировку S-S-связей между другими SH-содержащими аминокислотными остатками, приводя к инактивации фермента. Во-вторых,.

РМЕ воздействует на С-концевые сегменты НА2 в составе вириона. Нами было показано, что из субвирусных частиц, приготовленных в присутствии (ЗМЕ (50 мМ), экстрагируются не только трижды ацилированные, но также ди-, монои даже полностью деацилированные пептиды. После отмывки (ЗМЕ частично деацилированные молекулы могут образовать S-S-связи и, таким образом, стабилизировать оболочку вириона. Наконец, проникающий через мембрану (ЗМЕ, вероятно, может изменять пространственную структуру белка Ml, включающего три остатка цистеина.

1 2 MW, kDa.

IS.

NP-VM" -66.

М1.

— 45 -30.

— 20,1.

Ш -14,4 а) (б).

Рис. 18. (а). Зависимость гидролитической активности бромелаина от времени инкубации с низкомолекулярным субстратом GIp-Phe-AIa-pNA при 37 °C при концентрации Р-меркаптоэтанола (Р-МЕ) в реакционной среде, равной 0, 1, 5 и 50 мМ. Концентрация бромелаина в реакционной среде 0,025 мг/мл. (б) Электрофоретический анализ препаратов субвирусных частиц, полученных обработкой интактных вирионов вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 бромелаином в присутствии 5 мМ р-МЕ: 1 — субвирусные частицы (вирус: бромелаин 2:1, 3 ч, 37 °С) — 2 — интактные вирионыMW — белковые маркеры для электрофореза.

Удельная активность бромелаина, активированного дитиотреитолом, по отношению к низкомолекулярному субстрату оказалась максимальной в присутствии 1 мМ концентрации этого восстанавливающего реагента. Однако проведение реакции в аналогичных условиях с нативными вирионами не привело к желаемому удалению гемагглютинина с поверхности вирионов. Вместо этого на электрофореграмме наблюдалось.

0,5 1 1 время инкубации, ч появление полос легкой и тяжелой цепей гемагглютинина, свидетельствовавшее о восстановлении дисульфидной связи между НА1- и НА2-цепями молекулы (рис. 19, б.). ш * fe г я ^ л.

1| л ?

Е г ф ч а) (б).

Рис. 19. (а). Зависимость гидролитической активности бромелаина от времени инкубации с низкомолекулярным субстратом Glp-Phe-Ala-pNA при 37 °C при концентрации дитиотреитола (DTT) в реакционной среде, равной 0, 1, 5 мМ. Концентрация бромелаина в реакционной среде 0,025 мг/мл. (б). Электрофоретический анализ препаратов субвирусных частиц, полученных обработкой интактных вирионов вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 бромелаином в присутствии I мМ DTT: 1 — субвирусные частицы (вирус:бромелаин 2:1, 37 °C, 3 ч) — 2 — интактные вирионыMW — белковые маркеры для электрофореза.

В отсутствие восстанавливающих реагентов также наблюдался гидролиз низкомолекулярного субстрата бромелаином, при этом активность фермента сохранялась практически неизменной на протяжении длительного времени (см. рис. 18, а и 19, о) и была ниже, чем активность после активации небольшими концентрациями р-меркаптоэтанола.

Таким образом, на данном этапе работы было изучено действие различных протеолитических ферментов на интактные вирионы вируса гриппа. Были подобраны условия для удаления гликопротеинов с поверхности вирионов бромелаином. Полученные частицы в дальнейшем использовались для изучения локализации сайтов расщепления полипептидной цепи гемагглютинина использованными ферментами (см.

1 2 3 время инкубации, ч п. З). Однако оказалось, что присутствие в системе Р-меркаптоэтанола, используемого для восстановления тиоловых групп в активном центре фермента, приводит также к удалению части остатков жирных кислот, присоединенных тио-эфирной связью к консервативным остаткам цистеина, расположенных во внутривирионном фрагменте гемагглютинина. Таким образом, для изучения пост-трансляционной модификации С-концевых сегментов гемагглютинина остатками высших жирных кислот требовалось проведение реакции гидролиза в отсутствие восстанавливающих реагентов.

2.1.2.4. Действие бромелаина на вирионы вируса гриппа в отсутствие восстанавливающих реагентов.

Для получения субвирусных частиц вируса гриппа без изменения (по сравнению с интактными вирионами) количества остатков высших жирных кислот, ацилирующих консервативные остатки цистеина внутривирионных сегментов гемагглютинина, было изучено действие бромелаина на интактные вирионы вируса гриппа в отсутствие восстанавливающих реагентов.

Была изучена временная зависимость гидролиза поверхностных гликопротеинов. В отсутствие восстанавливающих реагентов гидролиз эктодоменов поверхностных гликопротеинов происходил медленнее: при соотношении вирус: фермент 1:1 полное удаление гликобелков происходило за 5−6 ч при 37 °C (см. рис. 20, а и 21, а полоса на электрофореграмме, соответствующая гемагглютинину, полностью отсутствует на дорожке № 4). При этом на электрофореграммах наблюдалось появление серии дополнительных полос в диапазоне молекулярных весов 9−23 кДа, которые по результатам их анализа методом трипсинолиза в геле с последующим анализом пептидных элюатов методом MALDI времяпролетной масс-спектрометрии были определены как фрагменты белка Ml и обозначены fl-f6 (см. рис. 16, дорожка 3). Электрофоретическая подвижность каждого фрагмента белка Ml и взаимные интенсивности полос сохранялись постоянными.

Электрофоретический анализ вирионов, обработанных бромелаином в отсутствие восстанавливающих реагентов за различные промежутки времени, показал, что фрагменты белка Ml, появляются на электрофореграмме в первые 0,5 ч реакции, когда весь НА практически сохранен (рис. 20, 21). В течение всего последующего времени доля фрагментированного белка Ml, число полос фрагментов и их интенсивность остаются одинаковыми. Следует отметить, что фрагментация матриксного белка не наблюдалась при инкубации суспензии интактных вирионов в отсутствие фермента при 37 °C в течение времени проведения реакции. Напротив, выделенный из вирионов «свободный» белок Ml при гораздо более «щадящих» условиях гидролиза бромелаином (вирус:бромелаин = 10:1, 5 мин, 37 °С) расщеплялся до коротких пептидов, которые не детектировались белковым электрофорезом по Лэммли (не представлено).

Негидролизованный белок, отн. ед.

Время инкубации, ч.

Рис. 20. Зависимость гидролиза бромелаином поверхностного гликопротеина НА и матриксного белка Ml в составе вирионов от времени инкубации с вирусными частицами при 37 °C при концентрации РМЕ в среде, равной 0 (а), 5 (б) и 50 мМ (в). Концентрация бромелаина 1 мг/мл. 1 — НА, 2- Ml. Относительное количество негидролизованного бромелаином НА и Ml в составе субвирусных частиц оценивали методом денситометрии полос в геле. В каждой дорожке геля долю НА и Ml нормировали на долю внутреннего белка NP.

Рис. 21. Анализ гидролиза молекул матриксного белка Ml и эктодоменов гемагглютинина в составе вирионов вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 бромелаином в отсутствие Р-меркаптоэтанола. Электрофоре грамма отражает белковый состав вирусных частиц, обработанных ферментом при 37 «С при соотношении реагентов (бромелаин:вирус) 1:1 в течение различных промежутков времени. Остановка реакции 105 м Е-64. Вирионы инкубировали с ферментом в течение 0.5 ч (1), 1.5 ч (2), 3 ч (3), 6 ч (4). 5 — интактные вирионыMW — низкомолекулярные пептидные маркеры.

1 2 3 4 5 MW, кДа 40 о®-1 л 35? с ю 20 X Й о. 10 I О 6 время инкубации, ч М1.

Снижение концентрации фермента закономерно уменьшало разрушение белка Ml. В то время как количество фрагментированного белка Ml в составе субвирусных частиц могло достигать 90% при соотношении вирус: бромелаин, равном I: I (рис. 9, дорожка 3), оно было значительно ниже при соотношении 4:1 (не представлено).

Таким образом, была показана возможность получения субвирусных частиц, лишенных поверхностных гликопротеинов, используя обработку интактных вирионов вируса гриппа бромелаином в отсутствие восстанавливающих реагентов. Также было обнаружено, что в этих условиях матриксный белок Ml подвергается частичному расщеплению ферментом.

2.2. Изучение явления доступности мембран-ассоциированного белка Ml в составе вириона ограниченному протеолизу ферментами при удалении поверхностных гликопротеинов.

2.2.1. Электронно-микроскопический анализ вирусных препаратов.

Чтобы понять, почему белок Ml, расположенный внутри вириона под лигшдной мембраной, становится доступным действию фермента, был проведен электронно-микроскопический анализ тонких срезов контрольных интактных вирионов и субвирусных частиц вируса гриппа штамма A/Puerto Rico/8/34, полученных протеолитической обработкой вирионов бромелаином в отсутствие восстанавливающих реагентов (рис. 22). Было обнаружено, что липидная мембрана на большей части поверхности субвирусных частиц отсутствует. На рис. 22, а представлена электронная микрофотография интактного вириона штамма A/Puerto Rico/8/34, на которой виден слой «шипов» гликопротеинов (белая стрелка), окружающих нативную вирусную частицу. На микрофотографии, представленной на рис. 22, б, показана типичная субвирусная частица из препарата, полученного обработкой вирионов бромелаином в отсутствие восстанавливающего реагента. Видно, что слой гликопротеиновых «шипов» отсутствует. Кроме того, рядом с участками сохранившегося липидного бислоя (указаны белой стрелкой) есть области, где бислой нарушен (черная стрелка). а) (б).

Рис. 22. Электронные микрофотографии тонких срезов интактных вирионов вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 (а) и вирионов, обработанных бромелаином в отсутствие восстанавливающих реагентов (б).

На основании полученных результатов был сделан вывод о том, что белок Ml, прилегающий изнутри к липидной оболочке, подвергается ограниченному протеолизу бромелаином в результате нарушения целостности мембраны вирионов. Это нарушение могло происходить в процессе проведения гидролиза вирионов бромелаином в отсутствие восстанавливающего реагента или/и при последующем центрифугировании препарата субвирусных частиц на холоду, которое проводили с целью освобождения обработанных ферментом вирионов от избытка фермента после реакции.

2.2.2. Влияние условий ингибирования на фрагментацию белка Ml.

Далее было изучено влияние условий ингибирования гидролиза на фрагментацию белка Ml — действие двух типов ингибиторов цистеиновых протеиназ при двух температурах инкубации реакционной смеси после остановки реакции.

При исследовании временной зависимости удаления НА в присутствии Р-меркаптоэтанола реакцию гидролиза стандартно останавливали ингибитором Е-64 (10 мкМ, инкубация при комнатной температуре 15 мин), а затем до центрифугирования серию образцов хранили при 4 °C (16−18 ч). В отсутствие восстанавливающего реагента в этих условиях в составе субвирусных частиц обнаруживали фрагменты белка Ml (рис. 23, а). Однако если образцы выдерживали с ингибитором 16—18 ч при температуре 37 °C, то фрагменты белка Ml практически отсутствовали. В отличие от Е-64, HgC^ (100 мкМ) не подавлял фрагментацию белка Ml даже при повышенной температуре (рис. 23, б). При этом оба ингибитора останавливали гидролиз поверхностного НА за короткие промежутки времени при 20 °C. б).

1^t «T.

— у.

-(NAbНАNP 20.).

14.4 фрагменты Ml.

IЖ" jt ®-а? 1 '.

Рис. 23. Электрофоретический анализ препаратов субвирусных частиц, полученных обработкой вирионов вируса гриппа бромелаином в отсутствие (3-меркаптоэтанола при разных условиях остановки реакции: соотношение вирус — бромелаин = 2:1 (ш/ш). (а) — 3 ч гидролиза при 37 °C, остановка реакции Е-64 (10 мкМ) в течение: 15 мин при 20 °C, затем 16 ч при 4 °C (1) или 16 ч при 37 °C (2) — (б) — после «нулевой» точки (5 мин гидролиза при 20 °С) инкубация в присутствии HgCb (100 мкМ, 1, 2) или — Е-64 (10 мкМ, 3, 4) в течение 16 ч при 37 °C (1, 3) или 15 мин при 20 °C, затем 16 ч при 4 °C (2, 4) — 5 -интактные вирионы.

Таким образом, неполное ингибирование бромелаина в отсутствие в инкубационной среде восстанавливающего реагента при стандарно используемой процедуре остановки реакции (10 мкМ Е-64, инкубация при комнатной температуре 15 мин), является одним из факторов, влияющих на фрагментацию белка Ml в составе вириона.

2.3. Анализ структуры заякоренного в мембрану вириона С-концевого сегмента гемагглютинина.

2.3.1. Отработка способов экстракции С-концевых сегментов гемагглютинина из субвирусных частиц.

К настоящему времени данные о структуре С-концевого сегмента НА2-цепи, включающего трансмембранный домен (TMD) и цитоплазматический домен (СТ) и трижды ацилированного по остаткам цистеина жирнокислотными остатками, незначительны, однако представляют значительный интерес в связи с возможным участием их в процессе слияния мембран при проникновении вируса в клетку и/или процессе сборки дочерних вирионов перед их выпочковыванием с плазматической мембраны зараженной клетки.

Ранее в нашей лаборатории совместно с Институтом Биомедицинской Химии имени В. Н. Ореховича и ГУ НИИ Физико-химической медицины Росздрава был предложен протокол исследования тонкой структуры С-концевых сегментов НАг, экстрагированных из обработанных бромелаином вирионов (т.н. субвирусных частиц), с использованием МС-анализа. Предложенный поход наметил путь для изучения характера ацилирования консервативных остатков цистеина, расположенных на внутривирионных фрагментах гемагглютинина у различных эволюционных групп вируса гриппа. Однако, данный метод позволял получать ацилированный пептид с низким выходом, достаточным только для проведения масс-спектрометрического анализа. Низкий выход экстракции не давал уверенности, что остальная (неэкстрагированная) часть пептида обладает теми же химическими свойствами (характером ацилирования), поскольку отсутствие даже одного из трех связанных с пептидом жирно-кислотных остатков серьезно снижает гидрофобность ацилированного пептида.

Для того чтобы разобраться, отражает ли обнаруженный нами характер ацилирования свойства всего пула С-концевых сегментов НА или только его небольшой фракции, мы разработали альтернативный метод выделения С-концевого сегмента НА2 из субвирусных частиц, полученных обработкой нативных вирионов вируса гриппа цистеиновой протеиназой бромелаином. Метод заключается в солюбилизации субвирусных частиц при температуре 30 °C смесью неионных детергентов октилглюкозид/айгепал (NP-40) с последующим разделением солюбилизата (супернатанта) и осадка центрифугированием при 14000xg в течение 40 мин при комнатной температуре на настольной центрифуге Microfuge 18 (Beckman Coulter). Как оказалось, данный метод экстракции позволял выделять количества С-концевых пептидов НА2, достаточные для характеристики его состава методом аминокислотного анализа — стандартного метода для определения аминокислотного состава белкового объекта.

Препараты С-концевого сегмента НА2, выделенного из субвирусных частиц вируса гриппа штамма A/Puerto Rico/8/34 были исследованы параллельно двумя методами: MALDI-TOF масс-спектрометрическим анализом и аминокислотным анализом. Полученные результаты представлены в таблице 1. Данные аминокислотного анализа показали, что состав экстракта хорошо согласуется с данными из базы данных по аминокислотной последовательности С-концевого пептида цепи НА2, включающего трансмембранный и цитоплазматический домены. Кроме того, расчет выхода при экстракции С-концевых сегментов НА2 смесью октилглюкозид/айгепал показал, что при данном способе экстракции происходит практически количественный переход пептида в солюбилизат (супернатант). Масс-спектрограммы солюбилизатов показали, что выделенные таким образом С-концевые сегменты НА2 имеют тот же характер ацилирования, что и пептиды, экстрагированные в органическую фазу (не представлено).