Сравнительная характеристика липополисахаридов бактерий рода Fpancisella

Липополисахарид грамнегативных бактерий, являясь полифункциональным комплексом клетки, определяет многие иммунологические и патогенетические особенности течения инфекционного процесса. Широкий спектр биологических эффектов ЛПС объясняет пристальное внимание клиницистов и экспериментаторов к данному макромолекулярному компоненту микробной клетки. В первую очередь, это относится к наиболее патогенным бактериям, вызывающим опасные инфекции человека и, в частности, туляремийному микробу — возбудителю тяжелого токсико-аллергического заболевания.

Интенсивные исследования ЛПС Francisella tularensis, начавшиеся еще в 60-х годах (Knothe Н., Havemeister G., 1960), позволили выяснить существенную роль этой молекулы во взаимоотношениях паразит-хозяин. Как установлено, ЛПС туляремийного микроба является одним из основных факторов его патогенности, а процесс аттенуации бактерий коррелирует с нарушениями в структуре ЛПС (Хлебников B.C. с соавт., 1991; Павлович Н. В. с соавт., 1993; Sorokin V.M. et al., 1995). Показана также токсичность бактерий F. tularensis для белых мышей и крыс (Олсуфьев Н.Г., 1975; Анисимов Г. А., Борискин В. А., 1991), которая, предположительно, реализуется при участии эндотоксина (Мещерякова И.С., 1990). Кроме того, S-ЛПС определяет резистентность вирулентных бактерий к бактерицидному действию нормальной (неиммунной) сыворотки млекопитающих, а также обеспечивает их устойчивость к фагоцитозу (Pavlovich N.V., Sorokin V.M., 1995; Sorokin V.M. et al., 1996). Получены убедительные доказательства, что ЛПС возбудителя туляремии является важнейшим иммуногеном бактериальной клетки. В частности, природные штаммы синтезируют S-ЛПС с видоспеци-фическими О-полисахаридными цепями (Хлебников B.C. с соавт., 1991, 1993; Tochtamysheva N.V. et al., 1995), на выявлении антител против эпито-пов которых базируется основной методический подход в диагностике туляремии (Мещерякова И.С., Павлова И. П., 1991; Марков Е. Ю. с соавт., 1991; Grunow R. et al., 2000). Вместе с тем, до настоящего времени остается своеобразной загадкой биологическая инертность очищенных препаратов ЛПС, выделенных даже из вирулентных штаммов возбудителя. Так, обнаружено, что они не вызывают реакцию Шварцмана, не обладают пироген-ностью и токсичностью для лабораторных животных и не способны индуцировать у них специфический иммунитет (Марков Е.Ю., 1991; Knothe Н., Havemeister G., 1960; Maclennan A. et al. 1976; Sandstrom G. et al. 1992; So-rokin V.M. et al., 1995). При этом обращает на себя внимание тот факт, что абсолютное большинство работ, посвященных ЛПС туляремийного микроба, выполнено на препаратах, полученных классической водно-фенольной экстракцией по Вестфалю. Однако, известно, что данный метод является достаточно жестким и может приводить к нарушениям в нативной структуре ЛПС (Okuda S. et al., 1975; Tsang J.C. et al., 1974; Darveau R.P., Hancock R.E., 1983; Марков Е. Ю., 1991). Поэтому представляется перспективным поиск более «щадящих» способов очистки ЛПС с последующим изучением иммунохимических и биологических свойств выделенных препаратов. Принимая во внимание нетоксичность очищенных препаратов ЛПС возбудителя туляремии, определенный интерес представляет также направление, связанное с выявлением таких известных «полезных» свойств ЛПС как иммуномодулирующая и антитоксическая (антагонистическая) активности, описанные для некоторых грамнегативных бактерий (Сибиряк С.В., Алехин.

E.К., 1988; Christ W.J. et al., 1995). На момент начала нашего исследования в доступной литературе отсутствовали работы по изучению данных характеристик у ЛПС F. tularensis и других видов франциселл — F. novicida (-like) и.

F.philomiragia. В отношении последних нельзя не отметить вообще крайне скудные сведения о структуре и биологических свойствах их ЛПС. Вместе с тем, возможная этиологическая роль этих видов франциселл в различных патологических процессах у человека (пневмонии, хронический лимфогрануломатоз и др.) (Мещерякова И.С. с соавт., 1995) определяет актуальность поиска общедоступных методических подходов к диагностике таких заболеваний, которая на сегодняшний день разработана весьма слабо. Более того, сравнительное исследование химической и антигенной структуры, а также других свойств ЛПС франциселл, может внести свой вклад в уточнение таксономических связей различных представителей рода Francisella.

Таким образом, анализ данных литературы демонстрирует, что, несмотря на интенсивные исследования ЛПС F. tularensis, в настоящее время многие детали патогенетического воздействия ЛПС туляремийного микроба и других франциселл на макроорганизм остаются не достаточно изученными.

Цель исследования;

Сравнительное изучение биологических свойств, иммунохимической структуры и диагностической ценности липополисахаридов бактерий рода Francisella.

Задачи исследования:

1. Получение и очистка препаратов ЛПС из бактерий природных и му-тантных штаммов туляремийного микроба и других видов рода Francisella с помощью разных методов.

2. Сравнительный анализ структуры и иммунохимических характеристик ЛПС природных и ЛПС-дефектных штаммов F. tularensis, а также других франциселл.

3. Сравнительное изучение токсических свойств живых бактерий рода Francisella и выделенных из них препаратов ЛПС для белых мышей и белых крыс.

4. Исследование иммуномодулирующих, антитоксических и иммуно-генных свойств препаратов ЛПС разных представителей рода Francisella.

5. Разработка диагностических препаратов на основе ЛПС для детекции бактерий рода Francisella и видоспецифических антител в иммунных сыворотках.

Научная новизна и теоретическая ценность работы.

В результате проведенных исследований получены новые данные о структуре и химическом составе ЛПС всех представителей рода Francisella — F. tularensis, F. novicida, F. novicida-like и F. philomiragia. Обнаружено, что все виды франциселл синтезируют S-ЛПС, однако структура ЛПС F. philomiragia имеет характерные особенности, отличающие его от ЛПС других представителей рода. Впервые установлено, что природные вирулентные штаммы возбудителя туляремии одновременно синтезируют 2 формы S-ЛПС, отличающиеся по электрофоретической подвижности и антигенной специфичности. На модели коллекции мутантов с различными дефектами в структуре ЛПС продемонстрирована прямая корреляция между токсичностью туляремийного микроба и хемотипом ЛПС. Выявлено, что очищенные препараты ЛПС всех представителей рода Francisella не токсичны для лабораторных животных, но обладают определенными иммуно-модулирующими и антитоксическиими свойствами. Продемонстрировано, что у большинства таксонов рода Francisella видоспецифические антигенные детерминанты локализованы на О-полисахариде S-ЛПС. Доказано, что очищенные образцы ЛПС перспективны для создания высокоспецифичных диагностических препаратов.

Практическая ценность работы.

На основе препаратов ЛПС, выделенных из бактерий F. tularensis, F. novicida, F. novicida-like и F. philomiragia разработаны антигенные полимерные и эритроцитарные диагностикумы для иммунологической диагностики и внутриродовой дифференциации этих микробов. Ученым Советом Ростовского НИПЧИ утверждены методические рекомендации «По использованию препаратов ЛПС бактерий рода Francisella в качестве сенситинов для антигенных диагностикумов» (протокол № 6 от 29.07.99.) и комплект научной документации: Экспериментально-производственный регламент, Фармакопейная статья предприятия, Временная фармакопейная статья и Инструкция по применению на диагностикум туляремийный антигенный полимерный сухой для выявления противотуляремийных антител и антигенов возбудителя туляремии в серологических реакциях (протокол № 4 от 20.04.2000).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Представители рода Francisella — F. novicida, F. novicida-like, также как и F. tularensis, синтезируют S-ЛПС, на О-полисахариде которого локализованы видоспецифические антигенные детерминанты. Природные штаммы возбудителя туляремии синтезируют одновременно две формы S-ЛПС, характеризующиеся различной электрофоретической подвижностью и антигенной специфичностью.

2. F. philomiragia синтезирует липоолигосахарид, который по своей иммунохимической структуре и биологическим свойствам существенно отличается от ЛПС других видов франциселл, что может свидетельствовать в пользу таксономической обособленности этого микроба.

3. Живые бактерии типичных штаммов F. tularensis и F. novicida обладают выраженной токсичностью для белых крыс и мышей, утрата которой у возбудителя туляремии прямо коррелирует с нарушениями в структуре ЛПС. В то же время, препараты ЛПС, выделенные из бактерий всех видов рода Francisella, не обладают токсичностью и иммуногенностью для лабораторных животных, но характеризуются определенным уровнем иммуно-модулирующей и антитоксической активности.

4. ЛПС всех франциселл содержат видовые антигенные эпитопы и могут быть использованы в качестве высокоспецифичных антигенных препаратов при разработке антигенных диагностикумов для детекции бактерий рода Francisella и видоспецифических антител в иммунных сыворотках.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на научных конференциях и конкурсах молодых ученых Ростовского НИПЧИ (1997 — 2000), а также были представлены на 8 Международном Конгрессе по микробиологии (Израиль, 1996), II и III международных конференциях по туляремии (Чехия, 1997; Швеция, 2000), на научных конференциях: «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний» (Киров, 1998), «Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария» (Екатеринбург, 1999).

Структура диссертации.

Работа изложена на 141 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 211 источников, в том числе 50 отечественных. Диссертация иллюстрирована 23 рисунками и 10 таблицами.

ВЫВОДЫ.

1. Представители рода Francisella — F. novicida, F. novicida-like, также как и F. tularensis, синтезируют S-ЛПС, на О-полисахариде которого локализованы видоспецифические антигенные эпитопы. Впервые установлено, что природные штаммы возбудителя туляремии синтезируют одновременно две формы S-ЛПС, характеризующиеся различной электрофоретической подвижностью и антигенной специфичностью.

2. F. philomiragia синтезирует липоолигосахарид, который по своей иммунохимической структуре и биологическим свойствам существенно отличается от ЛПС других видов франциселл, что подтверждает таксономическую обособленность этого микроба.

3. Живые бактерии типичных штаммов F. tularensis и F. novicida обладают выраженной токсичностью для белых крыс и мышей, утрата которой у возбудителя туляремии прямо коррелирует с нарушениями в структуре ЛПС.

4. Препараты ЛПС, выделенные из бактерий всех видов рода Francisella, не обладают токсичностью и иммуногенностью для лабораторных животных, но характеризуются определенным уровнем иммуномодули-рующей и антитоксической активности.

5. ЛПС всех франциселл содержат видовые антигенные эпитопы и могут быть использованы в качестве высокоспецифичных антигенных препаратов при разработке антигенных диагностикумов для детекции бактерий рода Francisella и видоспецифических антител в иммунных сыворотках.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Важная роль ЛПС грамнегативных бактерий во взаимоотношениях паразит-хозяин делают этот макромолекулярный комплекс микробной клетки интересным объектом для исследования. Многочисленные публикации посвящены и изучению различных аспектов действия ЛПС туляремийного микроба — факультативного внутриклеточного паразита, вызывающего тяжелый инфекционный процесс у человека. Так, в настоящее время считается четко установленной прямая корреляция между структурой ЛПС F. tularensis и его патогенностью и иммуногенностью (Хлебников B.C. с соавт., 1991; Pavlovich N.V., Sorokin V.M., 1995). В качестве видоспецифиче-ского иммунодоминантного комплекса ЛПС возбудителя туляремии предложен как компонент молекулярной вакцины (Хлебников B.C. с соавт., 1991; Khlebnikov V.S. et al., 1996; Khlebnikov V.S., 2000). Моноклональные антитела против О-полисахарида ЛПС F. tularensis обладают протективными свойствами, предотвращая гибель животных от туляремийной инфекции (Хлебников B.C. с соавт., 1992). Вместе с тем, некоторые аспекты патогенетической роли ЛПС F. tularensis остаются мало понятными. В частности, своеобразной загадкой является «биологическая инертность» очищенных препаратов ЛПС, характеризующихся отсутствием токсической и иммуно-генной активностей (Марков Е.Ю. с соавт., 1991; Sandstrom G. et al., 1992; Sorokin V.M. et al., 1995). При этом на сегодняшний день нет даже рабочей гипотезы, объясняющей столь очевидный парадокс. Нельзя не отметить также крайне скудные сведения об ЛПС других представителей рода Francisella — F. novicida (-like) и F.philomiragia. Последние, как известно, могут вызывать клинически схожие с туляремией заболевания у человека (Hollis D.G. et al., 1989), что диктует необходимость не только в их углубленном изучении, но и в разработке дифференциально-диагностических подходов к их детекции и идентификации. Подобные пробелы в наших знаниях и определили цели и задачи настоящего исследования.

Учитывая тот факт, что биологическая активность ЛПС существенно зависит от метода выделения препарата (Proctor R.A., 1985), а подавляющее большинство известных работ выполнено на препаратах ЛПС F. tularensis, полученных классической водно-фенольной экстракцией по Вестфалю, мы провели сравнительное изучение некоторых параметров препаратов ЛПС, выделенных из типичных вирулентных штаммов возбудителя туляремии с помощью двух методов — стандартной процедуры по О. Westphal, К. Jann (1965) и экстракцией детергентами по методу R'. Darveau, R. Hancock (1983).

Анализ полученных образцов ЛПС в реакции иммунопреципитации и реакции нейтрализации антител показал наличие у них сопоставимой (если не идентичной) антигенной активности.

При исследовании структуры (хемотипа) ЛПС в ПААГ электрофорезе с окраской гелей серебром и иммуноблоттинге установлено, что природные, штаммы туляремийного микроба синтезируют S-тип ЛПС, представленный в виде гетерогенных полос с образованием «лестницы». Вместе с тем, в зависимости от способа выделения использованные методы позволили выявить существенные отличия в структуре и частотном распределении молекул ЛПС. Например, фенольные препараты содержали, преимущественно, высокомолекулярную фракцию длинноцепоченых молекул ЛПС, тогда как детергентные образцы имели дополнительно большое количество короткоцепочечных и R-молекул ЛПС. Более того, если препараты по Вестфалю при электрофоретическом разделении формировали «лестницу» из одинарных полос, то детергентные ЛПС изучаемых штаммов образовывали «лестницу» из двойных «дуплетных» линий. Подобный феномен описан для некоторых ЛПС грамнегативных бактерий и, предположительно, обусловлен модификацией молекул ЛПС в процессе их синтеза (Goldman R.C., Lieve L., 1980; Hitchcock P., Brown Т., 1983; Peterson A.A., McGroarty E.J., 1985). Однако, природа и причины возникновения модифицированных форм ЛПС остаются до настоящего времени не идентифицированными.

Результаты нашего исследования подтверждают опубликованные ранее для других микроорганизмов данные литературы о том, что метод Darveau и Hancock позволяет выделять из бактериальной клетки более широкий спектр молекул, включая короткоцепочечные и R-молекулы, а также модифицированные формы ЛПС (Darveau R., Hancock R., 1983; Maclntyre S. et al., 1986). Это преимущество весьма перспективно при работе с ЛПС-дефектными мутантами и культурами микробов с еще не установленной структурой ЛПС, так как дает возможность проведения корректного сравнительного изучения образцов, изолированных в одинаковых условиях. В противном случае, возникает необходимость использования, по меньшей мере, двух различных способов — по О. Westphal, К. Jann (1965) для S-хемотипа ЛПС и по С. Galanos et al. (1969) — для SRили R-типов молекул. Поэтому для проведения дальнейшего исследования мы выделили ЛПС из авирулентных капсулодефицитных (cap") мутантов F. tularensis и новых представителей рода Francisella — F. novicida (-like) и F. philomiragia с помощью метода Darveau и Hancock.

— Все полученные образцы характеризовались высокой степенью чистоты и не содержали регистрируемых примесей белка и нуклеиновых кислот, что позволило нам расценивать изучаемые свойства препаратов как свойства, обусловленные именно молекулами ЛПС.

Сравнительный анализ структуры исследуемых ЛПС в ПААГ-электрофорезе с окраской ионами серебра показал, что, как и F. tularensis, другие таксоны рода Francisella синтезируют S-тип ЛПС. В то же время, если ЛПС F. tularensis и F. novicida (-like) формировали лестницу с двойным пиком распределения (формирование высокои низкомолекулярных фракций), типичным для S-ЛПС бактерий семейства Enterobacteriaceae, то препарат из F. philomiragia имел значительные отличия. Так, ЛПС этого вида был представлен двумя мажорными фракциями со средней электрофоретической подвижностью, что может свидетельствовать в пользу его липооли-госахаридной природы.

В противоположность тому, что препараты S-ЛПС природных штаммов F. tularensis формировали на электрофореграммах лестницу, все изученные авирулентные капсулодефицитные мутанты туляремийного микроба синтезировали дефектные формы ЛПС, у которых отсутствовала гетерогенность (R-тип ЛПС). Таким образом, варианты бактерий, полученные ранее как капсулодефицитные (Павлович Н.В. с соавт., 1993), являются, по сути, ЛПС-дефектными R-мутантами возбудителя туляремии. При этом их известные биологические свойства (отсутствие патогенности и им-муногенности для чувствительного хозяина) (Павлович Н.В. с соавт., 1993) доказывают прямую корреляцию между структурой ЛПС и патогенностью бактериальной клетки.

Как показано на примере многих (но не всех) грамнегативных бактерий, именно S-хемотип (О-полисахарид) определяет их видои группоспе-цифичность (Nghiem Н.О. et al., 1982; Kenne L., Lindberg В., 1983). Данная закономерность справедлива и в отношении возбудителя туляремии, однако, для представителей других видов франциселл подобные сведения отсутствуют. Поэтому, задачей следующего этапа нашего исследования явилось изучение иммунохимической структуры и антигенной специфичности ЛПС бактерий рода Francisella.

Для реализации поставленных целей были получены иммунные сыворотки кроликов против всех видов франциселл. Проведенное сопоставительное изучение антигенного состава микробных клеток, а также выделенных из них препаратов ЛПС и их полисахаридных фракций, продемонстрировало, что антигенные эпитопы, специфичные для видов F. tularensis, F. novicida и F. novicida-like, имеют полисахаридную природу и локализованы на О-цепи ЛПС. Так, в РИП мы наблюдали четкие линии преципитации препаратов полисахаридов ЛПС только с гомологичными иммунными сыворотками. Бактериальные клетки франциселл характеризовались наличием как видоспецифических, так и общих перекрестно-реагирующих антигенов, образующих преципитаты с гетерологичными сыворотками против таксонов рода Francisella. Тот факт, что подобные детерминанты отсутствовали в препаратах ЛПС, может свидетельствовать в пользу их белкового происхождения. Такие белковые антигены у франциселл обнаружены и описаны И. В. Родионовой с соавт. (1991, 1997) и И. С. Мещеряковой с соавт. (1995).

Антигенная композиция F. philomiragia резко отличалась от других видов, так как при наличии выраженных преципитатов с бактериями, у препарата ЛПС и его полисахаридной фракции регистрировалось в РИП лишь слабое взаимодействие с иммунной сывороткой против F.philomiragia. Последнее позволяет предположить, что ЛПС этого микроба в силу обнаруженных нами структурных особенностей (короткие О-цепи) не является иммунодоминантным компонентом клетки. Вместе с тем, с помощью другого метода — РНАт с разработанным на основе ЛПС F. philomiragia экспериментальным антигенным диагностикумом, нам удалось доказать, что ЛПС F. philomiragia содержит видоспецифические антигенные эпитопы, детекция которых может быть использована для диагностики и идентификации этого вида микроорганизмов. В частности, применение разработанного диагностикума позволило выявлять 2,5 — 5×107 м.кл./мл бактерий и 3 — б мкг ЛПС в специфической 3-х компонентной серологической реакции нейтрализации антител.

С целью более детального исследования иммунохимической структуры ЛПС франциселл и их взаимодействия со специфическими антителами мы воспользовались наглядным и чувствительным методом иммуноблот-тинга. Как и в предыдущих экспериментах, результаты иммуноблоттинга подтвердили, что ЛПС является высокоспецифичным антигеном микробной клетки, реагируя только с сыворотками своего вида. В то же время при обработке иммуноблотов кроличьей противотуляремийной сывороткой в препаратах ЛПС F. novicida, F. novicida-like и F. philomiragia проявлялась слабая антиген-активная зона в области липид, А + кор, обусловленная, по-видимому, присутствием в коровом олигосахариде родовых перекрестных антигенных детерминант.

В связи с тем, что именно возбудитель туляремии является высоко патогенным представителем рода, более подробно были изучены препараты ЛПС, выделенные из 3-х вирулентных штаммов F. tularensis и их изогенных авирулентных ЛПС-дефектных мутантов. Для этого мы использовали как кроличью поликлональную сыворотку против F. tularensis 15/10, так и ви-доспецифичные моноклональные антитела против О-блока ЛПС F. tularensis 15/10. При изучении характера связывания препаратов ЛПС туляремийного микроба с иммунглобулинами противотуляремийной сыворотки установлено, что все S-ЛПС природных штаммов формируют лестницу из двойных «дуплетных» полос, тогда как картина взаимодействия антител с R-ЛПС зависела от исследуемого штамма. В частности, если у R-ЛПС F. tularensis 543 cap" и 261 cap" иммунологически-активные зоны выявлялись лишь в коровой области, то ЛПС штамма 503 cap" содержал эпитопы, связывающиеся с про-тивотуляремийными антителами с образованием характерной для S-хемотипа лестницы из одинарных линий. Электрофоретическая подвижность полос «одинарной» лестницы ЛПС этого авирулентного мутанта соответствовала нижним полосам дуплетов S-ЛПС родительских вирулентных штаммов.

Применение МКА и набора ЛПС мутантных авирулентных штаммов дало возможность получить прямые доказательства того, что природные штаммы возбудителя туляремии синтезируют одновременно 2 формы S-ЛПС с различной антигенной специфичностью. Так, S-ЛПС типичных штаммов при взаимодействии с МКА формировал одинарную лестницу, соответствующую верхним линиям дуплета на иммуноблотах с поликлональной сывороткой. Нижние полосы дуплетов природного S-ЛПС, как и выявленный у авнрулентного штамма 503 cap" одинарный S-ЛПС, не содержали антигенных эпитопов, связывающих О-видоспецифичные МКА. Анализ полученных результатов позволяет заключить, что обнаруживаемые «дуплет-ные» линии S-ЛПС вирулентных штаммов туляремийного микроба представляют собой две самостоятельные формы S-ЛПС, отличающиеся по электрофоретической подвижности и О-антигенной специфичности. На модели ЛПС-дефектных штаммов показано, что формирование авирулентного фенотипа коррелирует с нарушениями в синтезе первой формы S-ЛПС, взаимодействующей с видовыми МКА, тогда как вторая форма S-ЛПС у некоторых мутантов может быть сохранена (например, F. tularensis 503 cap"). Биологическая целесообразность синтеза микробной клеткой второй формы S-ЛПС остается на сегодняшний день не совсем понятной, так как изученные авирулентные мутанты с R-хемотипом ЛПС или сохранением второй формы S-ЛПС не отличались друг от друга по своим основным биологическим свойствам, описанным ранее (Павлович Н.В. с соавт., 1993).

Тот факт, что все исследованные нами препараты ЛПС франциселл, включая ЛПС-дефектные формы туляремийного микроба, имеют различия, в первую очередь, по О-полисахаридному компоненту, определил наш интерес к изучению их углеводного состава. Как установлено, все образцы ЛПС природных штаммов франциселл содержали сопоставимые количества нейтральных Сахаров, но значительно отличались по аминосахаридному составу. Наиболее близкими по этому показателю были ЛПС F. tularensis и F. novicida, тогда как ЛПС F. philomiragia содержал в 3 — 4 раза меньше, а F. novicida-like — в.2,5 — 3 раза больше аминогексоз по сравнению с ЛПС возбудителя туляремии. Обнаружено также, что ЛПС родительских вирулентных штаммов F. tularensis имели достоверно более высокие количества аминосахаров, чем R-ЛПС авирулентных мутантов, что согласуется с данными N. V: Tochtamysheva et al. (1995) о наличии в О-блоке ЛПС туляремийного микроба четырех аминосахаридных остатков.

Хроматографический анализ углеводного профиля изучаемых препаратов позволил выявить и качественные отличия в ЛПС различных франциселл. В большей степени это относится к ЛПС F. philomiragia, который содержал необычный доминирующий аминосахар с низкой подвижностью, в то время как углеводный состав препаратов F. tularensis и F. novicida были близкими. Интересно, что ЛПС из бактерий F. novicida-like, которые вместе с F. novicida включены в качестве 4-го подвида в вид F. tularensis, характеризовался наличием двух высокоподвижных углеводов, отсутствующих у других видов. Полученные результаты по изучению структурно-химического строения ЛПС представителей рода Francisella свидетельствуют в пользу того, что наибольшая таксономическая близость свойственна возбудителю туляремии и F. novicida и подтверждают правомочность включения последней в вид F.tularensis. В то же время, значительные отличия, выявленные нами у ЛПС F. philomiragia, поддерживают мнение исследователей, оспаривающих включение этого вида в род Francisella (Мещерякова И.С., 1995). Вопрос о таксономической близости F. novicida и F. novicida-like нуждается в дополнительном изучении.

Сравнение хроматограмм препаратов родительских вирулентных и мутантных авирулентных вариантов F. tularensis продемонстрировало, что S-ЛПС содержит слабоподвижный углевод, отсутствующий в образцах R-ЛПС, который, по-видимому, является одним из составляющих звеньев О-полисахаридной цепи.

Общеизвестно, что структура молекулы определяет ее функциональную активность. В отношении ЛПС важное значение придается наличию в его коровой области кетодезоксиоктоновой кислоты (КДО), которая, как установлено, играет существенную роль в реализации токсичности ЛПС (Mansheim В. et al., 1979; Kasper D. et al., 1979). В то же время, согласно результатам G. Sandstrom (1992), фенольные препараты ЛПС туляремийного микроба содержат в 1000 раз меньше КДО, чем ЛПС E.coli. В представленных данных вызывает недоумение молярное несоответствие, так как в известных по химическому строению ЛПС энтеробактерий обнаружено от двух до трех молекул КДО (Proctor R.A., 1984; Книрель Ю. А., Кочетков.

Н.К.).

Проведенное нами количественное и качественное (хроматография) определение КДО в препаратах ЛПС бактерий рода Francisella выявило, что большинство исследуемых образцов содержат КДО, количество которого в 2−3 раза меньше (исключение составил ЛПС F. philomiragia — в 5 раз), чем в контрольных препаратах ЛПС E.coli. Это предполагает, что в состав кора ЛПС франциселл входит, по меньшей мере, одна молекула КДО. Необходимо отметить, что используемый для обнаружения КДО тиобарбитуровый метод позволяет выявлять лишь те формы КДО, которые имеют незамещенные вицинальные группы (Определитель бактерий Берджи, 1997; Lee С.Н., Tsai С.М., 1999). Поэтому, нельзя исключить вероятность того, что ЛПС франциселл, в действительности, содержит большее число молекул КДО, которые не регистрируются общепринятым методом. Подобный феномен описан для ЛПС Bacteroides (Определитель бактерий Берджи, 1997).

Тот факт, что иммунохимические характеристики полученных-нами методом Darveau и Hancock препаратов ЛПС франциселл отличались от достаточно хорошо изученных фенольных ЛПС F. tularensis, определил целесообразность изучения их биологических свойств.

Как известно, одним из классических свойств ЛПС грамнегативных бактерий является его токсичность для лабораторных животных (Proctor R.A., 1985). Токсический эффект оценивается, обычно, по количеству павших животных в сроки, не превышающие 48 ч (Езепчук Ю.В., 1985; Liide-ritz О. et al., 1981). При этом для туляремийного микроба показано, что наиболее адекватной биологической моделью для изучения именно токсичности микробов служат малочувствительные к туляремийной инфекции белые крысы (Олсуфьев Н.Г., 1975; Мещерякова И. С., 1990). Однако, как продемонстрировали Г. А. Анисимов и В. А. Борискин (1991), для оценки токсичности F. tularensis при определенных условиях могут быть использованы и высокочувствительные белые мыши.

Поэтому, используя два вида животных — белых крыс и белых мышей мы провели сравнительные эксперименты по определению токсичности живых микробов и выделенных из них препаратов ЛПС. Результаты этого изучения четко выявили, что только живые бактерии природных штаммов F. tularensis и F. novicida, синтезирующие полноценный S-ЛПС, способны вызывать гибель крыс и мышей в первые 24 — 48 часов после заражения. При тех же дозах живые культуры туляремийного микроба с дефектными формами ЛПС подобными свойствами не обладали. Очищенные препараты ЛПС, вне зависимости от хемотипа (Sили R-хемотип), характеризовались отсутствием токсичности даже при внутривенном введении в дозе 10 мг/мышь. Более того, специально выполненные эксперименты по оценке токсичности бактериальных суспензий вирулентных штаммов F. tularensis, которые были обеззаражены различными методами (прогревание, формалин, ацетон, пары хлороформа, УФО), также продемонстрировали полную нетоксичность убитых бактерий для белых крыс и мышей. Эти данные позволяют сделать вывод, что, во-первых, именно S-ЛПС вирулентных штаммов участвует (если не определяет) в феномене токсичности туляремийного микроба для макроорганизма, а, во-вторых, для реализации этого свойства ЛПС должен быть представлен только живой бактериальной клеткой.

С целью выяснения вопроса, на каком этапе in vivo происходит «сбой» токсического эффекта ЛПС, мы исследовали воздействие препаратов на макрофаги чувствительного хозяина (мышь), которые представляют собой важнейшую мишень действия эндотоксинов. Как установлено, и S-ЛПС вирулентных штаммов, и R-ЛПС авирулентных вариантов F. tularensis оказывают определенное цитотоксйческое действие на фагоциты животных, причем R-ЛПС обладает более выраженным повреждающим эффектом. В то же время дальнейшего развития эндотоксического шока с летальным исходом при введении животным ЛПС франциселл не происходит. Полученные, нами результаты, а также известные данные о нетоксичности препаратов ЛПС по Вестфалю (Knothe Н., Havemeister G., 1960; Sorokin V.M. et al., 1995) или по Буавену (Шипицина Г. К., 1955) предполагают, что подобное свойство присуще очищенным препаратам ЛПС F. tularensis вне зависимости от метода их выделения. Более того, как показали наши эксперименты, этот признак (нетоксичность) характерен и для очищенных препаратов всех бактерий рода Francisella, включая необычный по структуре ЛПС F.philomiragia.

Важным аспектом биологического воздействия ЛПС на макроорганизм является его цитокининдуцирующая активность, которая обеспечивает выраженный иммуномодулирующий эффект этой молекулы. Однако подобное «полезное» действие ЛПС для большинства грамотрицательных бактерий нивелируется высокой токсичностью препаратов для макроорганизма. Для преодоления этого предпринимаются попытки получения имму-номодуляторов на основе нетоксичных форм ЛПС, химической детоксика-ции молекулы или синтеза нетоксичных аналогов ЛПС (Proctor R.A. et al., 1989; Takayama К. et al., 1989; Christ WJ. et al., 1995). В отношении ЛПС возбудителя туляремии данная проблема отпадает, так как доказана его нетоксичность даже для высокочуствительных животных. Вместе с тем, на момент начала нашего исследования в литературе отсутствовали сведения об иммуномодулирующей активности ЛПС F. tularensis и других франциселл. Еще одним интересным и полезным последствием взаимодействия нетоксичных молекул ЛПС с организмом хозяина представляются их антитоксические (антагонистические) свойства в отношении токсичных ЛПС. В основе такого действия лежит конкуренция атоксичных молекул за сайты связывания в макроорганизме, вследствие которой последние становятся недоступными (нечувствительными) для токсичных ЛПС. Как и в предыдущем случае, мы не встретили в литературе работ, посвященных изучению антитоксической активности ЛПС бактерий рода Francisella, что определило необходимость исследования данного феномена.

Установлено, что препараты ЛПС франциселл не являются биологически инертными молекулами, так как они обладают определенными имму-номодулирующими и антагонистическими свойствами. При этом интересно, что S-хемотип ЛПС является наиболее эффективным иммуномодулято-ром, тогда как R-ЛПС из мутантных штаммов F. tularensis — анагонистом эндотоксинов. Тот факт, что нам удалось обнаружить у очищенных препаратов ЛПС франциселл подобную биологическую активность предполагает, что они имеют общие с классическими эндотоксинами сайты связывания в макроорганизме (антитоксические свойства) и способны индуцировать ци-токиновый ответ у клеток мишеней (иммуномодулирующие свойства). Это свидетельствует в пользу того, что, по меньшей мере, на первых этапах своего действия in vivo препараты ЛПС бактерий рода Francisella ведут себя как типичные эндотоксины, однако на последующих стадиях для развития токсического эффекта им необходима функциональная поддержка живой микробной клетки. Последнее подтверждается и тем обстоятельством, что убитые бактерии, также как и изолированные препараты ЛПС, не обладают токсичностью для. лабораторных животных.

Наши попытки выявить у очищенных препаратов ЛПС туляремийного микроба обнаруженные у ЛПС других грамотрицательных бактерий антителоиндуцирующую и протективную активности, к сожалению, не увенчались успехом. Так, иммунизация белых мышей и кроликов с использованием различных схем введения препаратов не обеспечивала их защиту при последующем заражении вирулентным штаммом F.tularensis. Кроме того, в сыворотках иммунизированных препаратами ЛПС животных мы регистрировали лишь низкие титры специфических противотуляремийных антител. В противоположность этому, иммунизация лабораторных животных живыми бактериями всех видов франциселл индуцировала в макроорганизме интенсивный антительный ответ с преимущественной направленностью к видоспецифическим антигенным эпитопам ЛПС. Именно этот факт определил целесообразность выявления диагностической ценности полученных нами препаратов ЛПС. Поэтому, были разработаны антигенные диагностические препараты с использованием в качестве сенситинов ЛПС бактерий рода Francisella. Апробация данных диагностикумов показала их высокую чувствительность и специфичность как для детекции видоспецифических иммуноглобулинов (РПГА), так и для обнаружения бактерий и их антигенов (РНАт). При отсутствии на сегодняшний день диагностических препаратов для серологической диагностики инфекций, вызванных F. novicida, F. novicida-like и F. philomiragia, результаты нашего исследования показывают перспективность использования ЛПС этих микробов как высокоспецифичных антигенных препаратов. Предложенный нами антигенный полимерный туляремийный диагностикум успешно прошел комиссионные испытания и имеет учрежденченский уровень внедрения (Ученым Советом Ростовского НИПЧИ утвержден комплект научной документации: Экспериментально-производственный регламент, Фармакопейная статья предприятия, Временная фармакопейная статья и Инструкция по применению на диагностикум туляремийный антигенный полимерный сухой для выявления противотуляремийных антител и антигенов возбудителя туляремии в серологических реакциях).

Таким образом, результаты нашего исследования продемонстрировали, что препараты ЛПС всех представителей рода Francisella характеризуются отсутствием токсичности, но обладают определенными иммуномоду-лирующими и антагонистическими активностями. При этом, на модели живых1 бактериальных клеток установлено, что именно ЛПС франциселл ответственен за такие важнейшие биологические свойства как токсичность и иммуногенность. Даже незначительные нарушения в синтезе ЛПС прямо коррелируют с утратой их токсичности для белых крыс и вирулентности для белых мышей. Более того, гибель микробной клетки с полноценным S-ЛПС (природные штаммы) также приводит к утрате биологической активности этой уникальнои молекулы. В этой связи, перспективным направлением дальнейших исследований является, на наш взгляд, поиск возможных механизмов реализации токсического потенциала ЛПС франциселл in vivo. Нельзя исключить, что, попадая в организм хозяина, только живая клетка способна обеспечить доставку ЛПС к мишеням его максимального токсического действия, либо в макроорганизме происходит модификация молекулы ЛПС в токсическую форму.

•117.