РНК — полимераза E. coli и регуляция транскрипции

Положение, что все организмы контролируют экспрессию генетической информации, хранящейся в их ДНК, стало уже биологическим трюизмом. ДНК каждой клетки любого организма содержит большое число генов, каждый из которых кодирует специализированную информацию, в сумме программируя громадный биологический и биохимический потенциал, никогда целиком клеткой не реализуемый. Избирательное и ограниченное использование этого потенциала, адекватное моменту времени и условиям внешней среды, предохраняет организм от ненужных энергетических трат и тем самым даёт ему селективное преимущество. Реализация клеточного потенциала должна быть скоординирована таким образом, чтобы обеспечить, во-первых, эффективную репродукцию клетки и во-вторых, выживание её в условиях селективного давления окружающей среды. Только в этом случае возникшие регуляторные системы могли сохраниться в эволюционном процессе. Эти требования, предъявляемые эволюционным отбором к регуляторным механизмам, хорошо прослеживаются на существующих регуляторных системах, которые выполняют две главных задачи: I/ осуществляют контроль за реализацией программы биологического развития, ведущей к клеточной репродукции (контроль клеточного развития) и 2/ обеспечивают адекватный и энергетически выгодный ответ клетки на изменение условий внешней среды (адаптивный контроль) .

В данном обзоре и работе будут разобраны регуляторные механизмы, функционирующие на уровне генной экспрессии, у ?. соЕь. Последние 30 лет называют эпохой ренессанса в биологии и это, главным образом, благодаря многочисленным исследованиям и фундаментальным достижениям в области регуляции активности генов в прокариотах, полученным, в основном, на Ь. сой и колифагах.

Литература

по этой проблеме столь обширна и информативна, что рассмотреть здесь все.

— б известные сейчас регуляторные системы i. coi'1 не представляется возможным. Положение осложняется отсутствием общей теории, которая позволила бы унифицировать их с позиций какого-нибудь универсального принципа или в рамках небольшого числа общих принципов. С каждой вновь открытой регуляторной системой накапливались всё новые исключения, не. укладывающиеся в классическую схему регуляции Жако-ба и Моно /I/, отличающиеся от неё не только в деталях, но во многих случаях и по основному механизму. В настоящее время таких исключений накоплено так много, что исследователям пришлось расстаться с оптимистической мыслью об универсальности принципа Жакоба-Мо-но и осознать факт многобразия стратегических приёмов и принципов, использованных природой при создании регуляторных систем. За последние 15 лет кроме негативного контроля Жакоба-Моно была найдена позитивная регуляция с помощью специализированных белков-регуляторов индивидуального /2/ или общего действия /3−5/- обнаружены специфические регуляторные механизмы, действующие на стадии тер-минации транскрипции /6,7/- стала известна регуляция, осуществляемая через сопряжение транскрипции и трансляции, и очень своеобразное проявление этого механизма — аттенюация /8−10/-' становится очевидным, что в I. coti, по-видимому, широко распространен сложный транскрипционный контроль, проявляемый окончательно через стадию трансляции и потоку называемый трансляционным контролем /II/- вместо постулированного Жакобом и Моно конститутивного синтеза белков-регуляторов оказалось, что многие из них подвержены аутогенному контролю /12/, который, вероятно, вообще характерен для экспрессии белков, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами /13/- найдены интегрирующие системы регуляции /14, 15/- стало известно явление ретрорегуляции, механизм которого пока не вполне понятен. /16/- кроме классической однонаправленной полицистронной транскрипции существует дивергентная, конвергентная и «разорванная» транскрипция ¦ оперонов /17/ с вытекающими отсюда дополнительными ре-гуляторными возможностями /18,19/. По образному выражению одного из специалистов, исследование регуляторных механизмов прокариот стало тем-то вроде «массового увлечения коллекционированием молекулярных штампов» /17/.

Хотя узнавание любого нового регуляторного механизма, которым трирода снабдила клетку, расширяет наши горизонты в понимании основ шзнедеятельности и занятие им увлекательно и интересно само по себе, зсё-таки на какой-то стадии появляется неудовлетворённость непрогно-шруемостью новых регуляторных систем и возникает желание прежде, гем двигаться дальше, получить ответ на следующие вопросы: Как много [овых регуляторных механизмов можно ещё ожидать обнаружить у со И? е. познаваемы ли они в обозримый промежуток времениесть ли сре-?и них та ключевая система, которой, возможно, не достаёт исследова-'елям для формулирования универсального принципа, и связанный с этим опрос о возможности построения общей теории, которая позволила бы бъяснять и предсказывать разнообразие регуляторных систем в конкретнее терминах связи между их структурой и функциональной и экологиче-кой информацией регулируемых ими систем.

При любых попытках ответить на эти вопросы необходимо принимать о внимание прежде всего эволюционное прошлое существующих регуляторах систем, рассматривая его в двух главных аспектах. /. Разнообразие механизмов, с помощью которых регулируется генети-зский потенциал клетки, отражает разнообразные потребности организма, зтрудно понять, что регуляторная система, которая совершнствовалась эволюционном процессе по её способности обеспечивать клетку постоян-эй высокой концентрацией какого-либо белка, должна принципиально от-дчаться от системы, отобранной за её способность быстро изменять энцентрацию какого-то белка в ответ на неожиданные изменения окружа-цей среды. Такое рассмотрение, по сути, с позиций адаптивной ценно-. сти естественного отбора, констатируя разнообразие регуляторных механизмов, позволяет в то же время объединять их, группируя по «специализации», что, вероятно, отражается в существовании общих типов регуляции / например, негативная регуляция, характерная для многих катаболитных и биосинтетических оперонов/. Теоретическое моделирование эволюции основных клеточных процессов /биосинтетических, катаболитных, белок синтезирующего аппарата/ показывает, что каждый из них характеризуется своим основным типом регуляции и что общее количество разных типов регуляции, возможных в 6. соИ, вполне ограниченно /13/ и в этом смысле реально познаваемо, более того, можно надеяться, что большая часть их, процитированная выше, уже выявлена. 2/. Учитывая случайный характер мутационного процесса, приводящего к возникновению каждой конкретной регуляторной системы, нужно ожидать многообразие в деталях даже среди однотипных регуляторных систем, которые играют одинаковую роль по отношению к сходным метаболическим процессам одного организма /например, негативная и позитивная регуляция Вас и^{аЕоперонов} сой /, либо по отношению к одному и тоьгу же клеточному процессу у разных организмов /например, регуляция Ьгроперона в Ц. соИ/ £етйа, Фзеи&тт, ВваМщ, МмШоскг /I?/ /. Это многообразие отражает способность эволюционного процесса предлагать разные (функционально эквивалентные) решения на одну и ту же регуляторную задачу. Свойства регуляторной системы, как и любой биологической системы вообще, отображают не только её настоящую функцию, но и её историю, и в этом смысле каждая конкретная система, имеющая своё собственное прошлое, уникальна и не предсказуема.

Возвращаясь к поставленным выше вопросам, приходится ответить отрицательно о возможности построения универсальной теории, обладающей как объясняющей, так и предсказательной силой в отношении однозначной взаимосвязи между структурной организацией регуляторной системы и функциональной и экологической информацией регулируемой ею системы. По-видимому, само требование фрмулирования универсальной теории регуляции в таких терминах неправильно или, по меньшей мере, безнадежно на современном этапе. Знание конкретного устройства и функционирования каждой индивидуальной регуляторной системы может быть только эмпирическим и требует экспериментального исследования именно этой системы.

ДНК Ь. сЖ содержит ~4000 генов, число независимо регулируемых генетических единиц в несколько раз меньше, но тоже огромно. Совершенно очевидно, что еще очень долго мы не сможем узнать детальную картину сложной регуляторной сети, с помощью которой клетка даже такого простого организма, как %.Сой, поддерживает тот сбалансированный порядок метаболических процессов, который отличает жизнь от конгломерата химических реакций.

Признавая первоочередную необходимость детального изучения какихто специальных систем по соображениям практических нужд человека, все-таки более перспективным подходом для фундаментальных исследований концептуального характера в этой области, по-видимому, является поиск и анализ общих регуляторных механизмов, выделена различных типов регуляции среди уже изученных систем и попытка их обобщений с целью обнаружения универсальных принципов. Даже самые несовершенные обобщения и формулирование самых гипотетических универсальных принципов представляется на современном этапе более полезным, чем детальное исследование еще одной конкретной регуляторной системы.

В данной работе предложен и изучен один из общих механизмов регуляции транскрипции у с помощью самого фермента транскрипции РНК-полимеразы. В «чистом виде» этот тип регуляции используется при транскрипции конститутивных генов, которые кодируют большую и функционально наиболее значимую часть клеточных белков /20/.Именно данный механизм обеспечивает сбалансированность и постоянство состава важнейших клеточных белков при достаточно широкой вариации условий. Кроме того, этот механизм составляет основу «строгого контроля» и является составной частью, по существу, почти всех других регуляторных механизмов, действующих на стадии транскрипции.

Обнаруженное впервые в данной работе взаимодействие между удаленными участками ДНК, индуцируемое РНК-полимеразой /эффект дальнодействия/, представляется нам принципиально важным для координации функционирования экспрессируемых генов. В условиях независимой регуляции каждой из функциональных единиц генома существование координирующего механизма требуется, во-первых, для сбалансированного синтеза РНК в пределах общего транскрипционного пула. Кроме того, наложение координирующего контроля на индивидуальные контроли должно обеспечить более тонкую регулировку активности соответствующих метаболических процессов в зависимости от общего метаболического состояния, т. е. гарантировать более адекватную и энергетически выгодную подгонку клеточных функциональных активностей друг к другу. Осуществление такого координирующего контроля через саму молекулу ДНК является идеальным вариантом по двум критериям. Он надежен, поскольку осуществляется без привлечения посредников — это автономный координирующий механизм транскрипции / аутохромосомный координирующий механизм /. И он универсален, поскольку справедлив для всех генов. Функционирование такого координирукхцего механизма экспериментально не показано, он является гипотетическим. Существование у ДНК способности переносить структурно-функциональную информацию на большие расстояния, показанное в этой работе, является необходимым условием для осуществления такого контроля. Преиыгущества, которые он дает клетке, столь огромны и очевидны, что нам представляется это достаточным условием, чтобы его обсуждать.

I. РЕГУЛЯЩЯ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ У ?. сой. / обзор литературы/.

Обсуждение проблемы регуляции активности генов у1. бактерий и 5актериофагов следует начать с фундаментального тезиса о том, что ¡-пецифичность и эффективность синтеза белков у прокариот контроли-уется, главным образом, на уровне транскрипции через изменение матичной активности соответствующих генов. Этот вывод впервые был до-азан в работах, выполненных в 1962;1966гг. под руководством Р.Б.Хе-ина. Более подробно об этом написано в разделе «Результаты и их об-уждение», поскольку с участия в этих исследованиях /21/ начиналась анная работа и сформировалось общее её направление, относящееся к зучению регуляторных механизмов транскрипции у .

Используемый прокариотами способ решения регуляторных задач, в шовном, уже на первой стадии реализации генетической информации яв-тется экономически наиболее выгодным, так как он позволяет с самого 1чала устранить излишние энергетические траты на экспрессию ненужных ¡-нов. Поскольку регуляция на посттранскрипционных стадиях у прокари-' играет лишь вспомогательную роль, очевидно, что регуляторные меха-[змы, функционирующие при синтезе РНК, настолько надежны, что в состо-:ии самостоятельно, без существенной помощи, обеспечить упорядочен :-сть и сбалансированность клеточных процессов у этих организмов.

В основе регуляции транскрипции у прокариот лежит тщательно ганизованная сеть контрольных «старт» и «стоп» — сигналов, кодируе^-х специфическими последовательностями ДНК, с которыми взаимодей-вует РНК-полимераза, дополняемая. сетью контрольных сигналов для эциальных белков-регуляторов, также кодируемых специфическими по-здовательностями ДНК. Взаимодействие РНК-полимеразы с контрольны-последовательностями — промоторами и терминаторами определяет эф-ятивность .инициации и терминации синтеза РНК на соответствующих участках ДНК. J pnori понятно, что белки или любые другие факторы, изменяющие взаимодействие РНК-полимеразы с промоторами и терминаторами, должны иметь регуляторное проявление в транскрипции, причем регуляция может осуществляться, по крайней мере, на двух уровнях транскрипции — на стадиях инициации и терминации синтеза РНК. Обобщённо элементарную единицу транскрипции можно определить как некоторую протяженную последовательность ДНК, ограниченную на одном конце «старт» -последовательностью или промотором, на другом содержащем «стоп» -последовательность или терминатор. Для многих транскрипционных единиц J. coii характерно наличие дополнительных контрольных последовательностей, входящих в состав промотора, частично перекрывающихся с ним или находящихся вблизи от него, которые взаимодействуют со специальными регуляторньши белками, что приводит к изменению эффективности взаимодействия РНК-полимеразы с промотором. В этих случа-: ях приходится говорить о сложной структуре регуляторного участка, контролирующего инициацию синтеза РНК. Во избежание путаницы принята следующая терминология. Промотором называют участок ДНК, необходимый для того, чтобы РНК-полимераза могла начать с него синтез РНК со скоростью, максимально наблюдаемой для данной транскрипционной единицы? w vivo • В состав промотора включают как участки, с которыми взаимодействует РНК-полимераза /основной промотор/, так и участки, с которыми взаимодействуют белки-активаторы, помогающие РНК-по-лимеразе начать синтез РНК. Оператором называют участок ДНК, с которым взаимодействуют белки-репрессоры, мешающие РНК-полимеразе начать синтез РНК. Совокупность всех регуляторных участков, определяющих частоту инициаций синтеза РНК, часто называют промоторной зоной. Из общих соображений можно ожидать, что терминаторы также могут иметь сложную структуру и включать в себя участки, взаимодействующие не только с РНК-полимеразой, но и с белками-регуляторами, действующими на стадии терминации. Однако до сих пор сложно устроенных терминаторов среди изученных не найдено, возможно, из-за относительно малой их изученности. В простейшем случае транскрипционная эдиница содержит один структурный ген. Очень часто два или большее количество генов образуют одну единицу транскрипции, называемую обычно опероном. В этом случае все гены транскрибируются в единую поли-^стронную мРНК и контролируются координирование. Как правило, в еди-шй оперон группируются гены, кодирующие метаболически взаимосвязан-ше белки, например, белки, осуществляющие последовательные этапы ка-сого-либо биосинтетического или катаболитного процессов. В некоторых случаях отдельные единицы транскрипции перекрываются, приводя иногда — разнонаправленной транскрипции в участках перекрывания. Экспрессия >тих перекрывающихся транскрипционных единиц регулируется во времени 'аким образом, чтобы избежать одновременной разнонаправленной транскрипции.

Таким образом, был рассмотрен общий принцип структурно-функци-нальной организации ДНК, согласно которому ДНК кроме структурных енов содержит регуляторные участки, взаимодействие которых с РНК-по-имеразой и регуляторными белками определяет эффективность синтеза НК с соответствующих структурных генов. Именно организация сигналь-ых контрольных участков около структурных генов превращает кодируе-ый ими биохимический потенциал в реальную клеточную биологию. Поэто-у исследование проблемы регуляции транскрипции, в значительной сте-зни, сводится к изучению механизмов функционирования различного ро-а, транскрипционных контрольных последовательностей ДНК — промоторов, 1ераторов, терминаторов и др., а также выяснению принципов их взаим-эй организации в ДНК. В ДНК последовательность оснований является зточником информации, она определяет специфичность участка. Контроль-ю последовательности ДНК, узнаваемые одним и тем же ферментом или згуляторныи белком, должны быть идентичны или, по меньшей мере, анагичны. Поэтому различные виды контрольных транскрипционных последовательностей, по-видимому, можно попытаться определить в терминах прототиповой последовательности. Однако сама по себе последовательность ДНК ещё ничего не может сказать о функционировании контрольного сигнала. Контрольная последовательность должна быть узнана и антерпретирована соответствующим белком, чтобы это имело регуляторное тоследствие. Поэтому задача состоит в том, чтобы определить, как бел> ш могут дискриминировать последовательности ДНК и как узнавание последовательностей сопровождается регуляторным актом.

Ниже будут представлены известные рабочие модели взаимодействия транскрипционных контрольных последовательностей с их белками, возможные механизмы их действия в некоторых конкретных регуляторных системах и возможные общие принципы функционирования их в регуляции? ранскрипции у $. со? ь .