Получение и молекулярно-генетическое исследование летальных мутаций гена leg-arista-wing complex у Drosophila melanogaster

Актуальность работы. Проблема получения достаточного количества мутаций при изучении функционирования генома дрозофилы много лет не теряет своей актуальности. Активное секвенирование генома дрозофилы и компьютерный анализ показывают наличие множества открытых рамок считывания, выявляют гомологии последовательностей. Но эти методы в настоящий момент позволяют лишь строить предположения, какие процессы затрагиваются ими in vivo. Мутагенез с одной стороны и молекулярные данные о структуре ДНК, синтезе белков и регуляции экспрессии позволяют соединить молекулярный и организменный уровни изучения работы генов.

Ранее был открыт новый гарсшс-регуляторный ген дрозофилы — leg-arista-wing complex (lawc), мутации которого нарушают правильную экспрессию многих локусов, в частности, пронейральных achaete и scute генов и гомеобокссодержащего локуса cut. Ряд фактов указывает на непосредственную роль нового локуса как в органогенезе, так и в раннем эмбриогенезе дрозофилы: одним из многочисленных фенотипических признаков его мутаций явилась гомеозисная трансформация аристы в элементы тарзусанебольшая делеция в области экзона вызывает нарушение финальных этапов пролиферации клеток крылового имагинального диска, приводя к сильным аномалиям развития торакса дрозофилы.

Район локализации гена lawc (7Е район цитологической карты X-хромосомы дрозофилы) содержит блок нескольких леталей, порядок и функциональная значимость которых до сих пор не установлена. Все они являются точечными, что сильно осложняет клонирование соответствующих генов. Поэтому открытие видимых, инсерционных мутаций в «летальных зонах» генома дает возможность молекулярно и генетически исследовать структуры и функции подобных областей.

По предварительным молекулярным данным, основной транскрипт гена lawc имеет большие размеры (более 9 т.н.). В настоящий момент у дрозофилы известно мало локусов, имеющих транскрипты подобного размера, и все они имеют очень сложную структуру. Поэтому новый локус является уникальной моделью для изучения функциональных особенностей сложно организованных локусов.

Цель и задачи исследования

С учётом изложенного целью настоящей работы явилось получение и молекулярно-генетическое исследование летальных мутаций гена leg-arista-wing complex у drosophila melanogaster.

Достижение указанной цели основывалось на решении следующих задач:

• Создание генетической системы скрещиваний, позволяющей эффективно получать мутации в различных районах Х-хромосомы.

• Получение коллекции мутантов в исследуемом районе и её молекулярно-генетический скрининг.

• Выявление генетических взаимодействий lawc с другими генами и районами генома дрозофилы.

• Подавление экспрессии lawc при помощи химерного белка P-Ph.

• Детализация фенотипического проявления /awe-мутаций.

Научная новизна и практическая ценность. В данной работе помимо сугубо прикладной задачи — создания коллекции мутаций, была решена более глобальная проблема — увеличение эффективности мутагенеза у дрозофилы. Разработанная генетическая система позволяет с высокой частотой проводить мутагенез у Drosophila melanogaster в X-хромосоме. Она была с успехом опробована для получения мутаций в гене leg-arista-wing complex, в то время как стандартными методами добиться успеха не удавалось. С помощью Саузерн-блот анализа мы установили молекулярную природу полученных мутаций. Впервые выявлены межгенные взаимодействия lawc с рядом генов и делециями, для чего применялась коллекция линий Deficiency Kit. Также с успехом применена пионерская методика инактивации генов при помощи химерного белка Р-Ph, разработанная в лаборатории П. Г. Георгиева (ИБГ РАН), и проведено снижение транскрипции в исследуемом нами районе, подтверждающее эффективность метода.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на 40-й, 41-й, 42-й, 44-й, 46-й Ежегодных исследовательских конференциях по дрозофиле (Сиэтл, 1999 г., Питтсбург, 2000 г., Вашингтон, 2001, Чикаго, 2003 г., Сан-Диего, 2005 г.), на I и II Международных симпозиумах (Новосибирск, 1999, 2000 гг.), на 16th Европейской исследовательской конференции по дрозофиле (Цюрих, 1999 г.), VI и VII Всероссийских школах молодых учёных «Актуальные проблемы нейробиологии» (Казань, 1999, 2000 гг.), Международном симпозиуме памяти академика Павлова «Механизмы адаптивного поведения» (Санкт-Петербург, 1999г), Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология», (Москва-Минск, 2001) и международной конференции «Молекулярная генетика эукариот» (Москва, 2003).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ (3 статьи и 13 тезисов).

Структура диссертации. Диссертация содержит 123 страницы машинописного текста и состоит из «Введения», «Обзора литературы», «Материалов и методов», «Результатов и обсуждения», «Выводов», «Заключения» и «Списка цитируемой литературы» (69 ссылок). Диссертация содержит 25 рисунков, 6 таблиц и 1 приложение.

ВЫВОДЫ.

1. Разработана генетическая система скрещиваний, позволяющая эффективно получать мутации в различных районах Х-хромосомы.

2. Получена коллекция летальных мутаций (33 линии) в районе гена leg-arista-wing complex, а также осуществлен молекулярно-генетический скрининг делеций и инверсий.

3. Выявлены 15 цитологических зон генома дрозофилы, содержащих локусы, взаимодействующие с геном lawc.

4. Обнаружены генетические взаимодействия lawc с базовыми и специфическими факторами транскрипции TFIIH (Ssll, МАТ1, Tfb4, Tfb2, hay), e (y)2, e (y)3, Ta/60, Tafl50, Tafl 10, Tq/ЗОа, e (y)l/Taf40).

5. Проведено подавление экспрессии lawc при помощи химерного белка Р-Ph.

6. Показано, что стерильность самок, мутантных по гену lawc, вызвана нарушением структуры яйцевых камер и созреванием ограниченного числа овоцитов без их воспроизводства.

7. Установлено, что стерильность самцов law.

4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Припступая к циклу работ по организации и функционированию гена lawc, мы предполагали: изучить нарушения транскрипции в различных линиях со слабыми мутациями, в модельной системе на основе сайтспецифической рекомбинации дрожжей (система FLP-FRT) получить мозаичных особей, исследовать материнский эффект гена lawc и в заключение получить несколько сильных и летальных мутаций для дальнейших исследований.

Результаты первых экспериментов показали, что ранее полученные мутации фенотипически близки к дикому типу, и их проявление наблюдается лишь во взаимодействии с мутациями в других генах. Использованная при получении гомозиготных соматических клонов деталь l (l)EF520 оказалась комплексом никем не картированных мутаций, поэтому мы не могли объяснить наблюдавшиеся аномалии каким-либо одним фактором. Таким образом, проведение мутагенеза стало для нас жизненной необходимостью.

В основу работы легли рутинные и довольно объемные эксперименты по получению мутаций. Но совершенно неожиданно они выявили несколько новых и очень интересных направлений возможных исследований. Во-первых, примененная нами схема скрещиваний имеет самодостаточную ценность. Она оказалась настолько эффективной, что мы планируем опробовать её еще на нескольких генах, по которым в мировой коллекции нет удобных мутаций.

Во-вторых, в линиях с мутациями по гену lawc была крайне высока частота нерасхождения хромосом. С одной стороны, это создавало проблемы при синтезе линий, потому что, не имея маркеров в каждой хромосоме, мы не могли даже заменить одну балансерную хромосому другой, испытывали затруднения в корректном дупликационном картировании. С другой стороны, эти генетические данные служат прекрасным подтверждением наблюдавшихся на клеточном уровне аномалий: да, процесс деления нарушен, и нерасхождение хромосом типично для разных мутаций гена lawc. В «летальных» зонах генома дрозофилы, гетерозиготные делеции которых при совмещении со слабой /mvc-мутацией вызывают гибель особей, расположено много генов, контролирующих деление клеток. Получение из мировой коллекции мутантов по этим генам и детализация межгенных взаимодействий будет следующим этапом исследований в этом направлении.

В-третьих, летальные мутации из полученной коллекции мутантов исследуются фенотипически, для них установлены стадии летальности (как правило, эмбриональная), у погибших эмбрионов изучаются возникающие морфологические нарушения. Полученные данные позволяют нам предположить нарушение полярности эмбриона, недостаток белков, создающих передне-задний и дорзо-вентральный градиенты. Мы предполагаем продолжить исследования в этом направлении. На основе изучения фенотипов летальных эмбрионов уже написаны 1 курсовая и 2 дипломные работы.

В-четвертых, летальные мутации из полученной коллекции мутантов сейчас активно изучаются в rescue-тестах с применением трансгенных конструкций (совместная работа с группой С.Г. Георгиевой). Обнаружено несколько линий, в которых мутантные особи становятся жизнеспособными при введении трансгенных конструкций с последовательностью, кодирующей транскрипционный фактор TRF2. Но крайне низкая выживаемость особей во всех rescue-тестах, как с трансгенными конструктами, так и с протяженными дупликациями, указывают на выраженный материнский эффект. В пользу этого предположения свидетельствуют такие косвенные данные, как различия в транскрипции между самцами и самками, нарушения оогенеза у мутантов.

Мы планируем провести получение мозаиков в системе FLP-FRT по несколько видоизмененнной схеме с применением полученных летальных мутаций и трансгенных конструкций.

В целом настоящая диссертационная работа, решая ряд задач, ставит множество вопросов, одновременно давая средства к их разрешению и открывает широкие перспективы для дальнейших исследований.