Сравнительное изучение штаммов Yersinia Enterocolitica различного происхождения

Актуальность темы

.

Работа посвящена изучению возбудителей кишечного иерсиниоза сельскохозяйствненных животных. Иерсиниоз — инфекционная болезнь человека и животных, вызываемая Y. enterocolitica, передающаяся алиментарным путем и характеризующаяся интоксикацией, преимущественным поражением желудочно-кишечного трактапри генерализованных формах — полиорганным поражением и склонностью к обострениям, рецидивам и хронизации процесса.

Иерсиниоз в соответствии с Международной статистической классификацией болезней (1995) регистрируется под символами: А046 — энтерит, вызванный Y. enterocolitica, или А28.2 — экстраинтестинальный иерсиниоз.

Заболевание широко распространено во многих странах мира. Наиболее часто эта инфекция встречается в странах Западной и Северной Европы, а также Америки: Великобритании, США, Канаде, Японии, России. В настоящее время наблюдается изменение структуры возбудителей ОКИ бактериальной природы, на первый план в некоторых странах (ФРГ, Дания, Финляндия) выдвигаются Campylobacter и Yersinia (Померанцев, Васильев, 1998; Куликовский, 1984).

В России первый случай кишечного иерсиниоза человека был зарегистрирован в 1968 году (Белова, Ющенко, 1968), официальный учет этой инфекции введен Минздравом в 1987 году. В настоящее время заболеваемость в некоторых регионах (Сибирь, Дальний Восток, Северо-Запад) составляет 3−5 случаев на 100 тыс. населения. Тридцатилетний период интенсивного изучения иерсиний позволил детально охарактеризовать свойства возбудителей кишечного иерсиниоза человека.

Y.enterocolitica — вид, представляющий собой разнородную группу микроорганизмов. По биохимическим свойствам различают 5 биовариантов первый биовар разделен на 1А и 1В), по антигенной структуре выделяют более 70 серовариантов. Далеко не все представители вида являются патогенными (Wauters et al., 1991). Эти микроорганизмы широко распространены в природе и часто выделяются из объектов внешней среды. Поэтому остается актуальным вопрос о подтверждении патогенности выделенной культуры." Помимо определения серогруппы и биоварианта рекомендуется исследовать факторы патогенности. Литературные данные свидетельствуют о полидетерминантной природе различных структур микроорганизма, обеспечивающих реализацию инфекционного процесса. Факторы патогенности Y. enterocolitica достаточно хорошо изучены, определены их генетические детерминанты. Описаны хромосомные гены и их продукты, участвующие в развитии инфекционного процесса. По современным данным литературы проявление патогенных свойств связано с присутствием в клетках Y. enterocolitica плазмиды pYV молекулярной массой 45−47 мДа и экспрессией кодируемых ею белков (Gemsky, Lazere, Casey, 1980; Portnoy, Moseley, Falkow, 1981; Ценева, Солодовникова, Воскресенская, 2002; Смирнов, 2004). В Методических рекомендациях Министерства Здравоохранения РФ по диагностике кишечного иерсиниоза (Псевдотуберкулез, иерсиниоз, Санкт-Петербург, 2005) для идентификации вирулентных иерсиний предлагается использовать фенотипические методыопределять маркеры вирулентности, агглютинационные тесты — постановку реакции агглютинации с сывороткой к вирулентным иерсиниям, а также молекулярно-генетические методы — полимеразную цепную реакцию. Имеются сообщения о возможности применения метода генетического зондирования (Кутырев и др., 1989, Попов и др., 1991).

По современным воззрениям, источником инфекции при кишечном иерсиниозе являются больные сельскохозяйственные, домашние, дикие животные и грызуны, а факторами передачи — продукты животноводства и корма. Поэтому роль Y. enterocolitica в патологии сельскохозяйственных животных и свойства возбудителя требуют всестороннего изучения.

Регистрация кишечного иерсиниоза у сельскохозяйственных животных в РФ введена с 1996 году (Иерсиниозы, СП, ВП, 1996). Эпизоотологические исследования свидетельствуют о возрастающей роли Y enterocolitica в желудочно-кишечной патологии сельскохозяйственных животных. Иерсиниоз основных видов животных описан в различных регионах РФ: Дальневосточном регионе, Нижегородской, Ульяновской, Вологодской, Ленинградской и других областях (Кирьянов, Савчук, 1987; Тихонов, 1999; Корчагин, 2002; Псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз, Вологда, 2003). Из сельскохозяйственных животных наиболее важную роль играют свиньи и КРС, меньшую — МРС, лошади. Описаны случаи кишечного иерсиниоза среди собак, кошек и других домашних животных (Platt-Samoraj, Szweda, Siwicki, 2000; Vokoun, 1985; Hayashidani et al., 1995; Корчагин, Васильев, 2002). Имеются наблюдения о заражении от диких животных (кабанов) (Shayegani, Stone, DeForge, 1986; Nattermann, Dedek, Loepelmann, 1986), a также от грызунов, которые часто инфицируют своими экскрементами корма и пищевые продукты (Калошина, Ющенко, Шестопалов, 1989; Singh, Sharma, Singh, 1994; Hayashidani, Kitahara, Ogawa, 1994). Значительное количество работ посвящено изучению кишечного иерсиниоза у свиней (Кирьянов, Савчук, 1989; Родионова, Муравьев, Малофеева, 1999; Тихонов, 1999; Корчагин, 2002, Прунтова и др., 2000; Nattermann, Horsch, Seeger, 1985; Markic, 1986; Mickova, Konecny, 1987; Hugenberg J., 1999, Okoroafor, Adesiyun, Agbonlahor, 1988). Почти на всех территориях от свиней изолируют Y. enterocolitica серогрупп ОЗ, 09, 05,27, 08, 06,30, 05, 07, ОН, 012, 017, 019, 04,32. Доказано, что свиньи являются основным источником иерсиниоза. От крупного рогатого скота выделяют иерсинии серогрупп 012, 013, 018, 07,8, 04, 05,27, ОЗ, 08.

К сожалению, количество отечественных работ по изучению спектра биоваров «ветеринарных» штаммов Y. enterocolitica, а также по исследованию их генетическими методами, невелико. Отсутствует нормативно-техническая документация по кишечному иерсиниозу сельскохозяйственных животных, нет диагностических препаратов, утвержденных Министерством сельского хозяйства РФ. Единственные «Методические указания по лабораторной диагностике иерсиниоза животных и обнаружению возбудителя болезни в мясном сырье, молоке и растительных кормах», выпущенные Министерством сельского хозяйства, официально утверждены лишь в октябре этого года, и только начинают действовать. Все перечисленные обстоятельства делают необходимым глубокое и всестороннее изучение ветеринарного аспекта проблемы кишечного иерсиниоза в нашей стране, особенно генетических особенностей Y. enterocolitica в связи с вопросами эпизоотологии и эпидемиологии. Кишечный иерсиниоз по-прежнему остается инфекцией, мало известной работникам животноводства, данные о заболеваемости среди сельскохозяйственных животных неполны и отрывочны.

В Саратовской области существование кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных было доказано Зыкиным Л. Ф. и сотр. в 1997 году (Зыкин Л.Ф. и др., 1997). С этого времени на кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы Саратовского ГАУ им Н. И. Вавилова ведется планомерная работа по изучению кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных. С 1997 по 2005 год были обследованы животные нескольких районов Саратовской области: Саратовского, Советского, Базарно-Карабулакского, Энгельского, Марксовского, Ново-Бурасского, Красноармейского, Калининского и Петровского. При иммунологическом обследовании свиней и КРС в высоком проценте случаев выявлены антитела, а затем бактериологическим методом были выделены культуры Y. enterocolitica от поросят, КРС, из молока коров, а также из мяса и мясопродуктов (Хапцев, 2000; Гвинджилия, Зыкин, 2002; Гвинджилия, 2002; Осипчук, 2003; Киселева, Зыкин, 2004; Киселева, 2005). Большая часть культур выделена в Петровском районе Саратовской области, что согласуется с данными Областного Центра санэпиднадзора за 2001 год, по которым в этом же районе были выявлены лица (6 человек) с диагностическими титрами антител к Y. enterocolitica 03 серогруппы. Это еще раз подтверждает, что при заболевании людей основным источником инфекции являются сельскохозяйственные животные, а фактором передачипродукты животноводства.

После выявления кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных в Саратовской области и выделения культур Y. enterocolitica, выяснения роли молока и мяса в передаче возбудителя (Зыкин и др., 1997; Хапцев, 2000; Осипчук, 2003; Киселева, 2005), возникла необходимость подробно изучить свойства штаммов Y. enterocolitica, изолированных из разных источников, и определить их генетические особенности.

Цель работы — выяснение генетических особенностей (наличия плазмиды pYV и хромосомного гена inv) штаммов Y. enterocolitica, выделенных от больных и павших поросят, а также из молока КРС, и биотипирование этих штаммов.

Задачи исследования:

1. Определить биоварианты штаммов Y. enterocolitica, изолированных от больных и павших поросят и из молока коров.

2. Провести плазмидный скрининг культур различного происхождения.

3. Исследовать культуры Y. enterocolitica методом ПЦР, применяя две коммерческие тест-системы: для выявления хромосомного гена inv и ДНК плазмиды pYV.

Научная новизна.

1. Впервые определен спектр биовариантов Y. enterocolitica, циркулирующих среди сельскохозяйственных животных Саратовской области. От свиней и крупного рогатого скота выделяются Y. enterocolitica первого (А и В), второго, третьего и четвертого биовариантовпреобладают биовары 4 и 1А. Культуры, изолированные от павших поросят и от поросят с признаками диареи, чаще относятся к четвертому биовару, и лишь некоторые — к биоварам 1А и 3. Среди штаммов Y enterocolitica, выделенных из молока коров, преобладают биовары 1А и 4, реже встречаются второй и третий.

2. Установлено, что хромосомный ген inv одинаково распространен среди Y. enterocolitica, изолированных от больных и павших поросят и из молока коров.

3. Доказано, что плазмида вирулентности pYV присутствует лишь в клетках Y. enterocolitica, изолированных от больных и павших поросят. Культуры, выделенные из молока КРС, являются бесплазмидными.

4. Показано, что для определения плазмидного профиля можно использовать плазмидный скрининг, а для выявления ДНК плазмиды вирулентности pYV ПЦР-анализ с тест-системой «ДиаГенYersinia».

Практическая значимость.

По результатам исследований подготовлены методические рекомендации «Идентификация патогенных штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза генетическими методами для оценки их эпидемиологической и эпизоотологической значимости», утвержденные МК ФВМ ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ» (протокол № 5 от 16 ноября 2005 г).

Материалы диссертации используются в учебном процессе по курсам «Ветеринарная микробиология и иммунология» и «Клиническая микробиология».

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Среди сельскохозяйственных животных Саратовской области. циркулируют Y. enterocolitica первого (А и В), второго, третьего и четвертого биовариантовпреобладают биовары 4 и 1А. Культуры, изолированные от павших поросят и от поросят с признаками диареи, чаще относятся к четвертому биовару, и лишь некоторые — к биоварам 1А и 3. Среди штаммов Y. enterocolitica, выделенных из молока коров, преобладают биовары 1А и 4, реже встречаются второй и третий.

2. Хромосомный ген inv, кодирующий синтез белка инвазина, встречается как у Y. enterocolitica, изолированных от больных и павших поросят, так и у культур кишечно-иерсиниозного микроба, выделенных из молока коров.

3. Культуры Y. enterocolitica, изолированные от больных и павших поросят, являются носителями плазмиды вирулентности pYV, которая была обнаружена у семи из шестнадцати культур. Ни у одного из двадцати девяти «молочных» штаммов эта плазмида не выявлена. Для подтверждения патогенности с целью решения вопроса об эпизоотической и эпидемической значимости выделенной культуры Y. enterocolitica в комплексе с определением принадлежности к биои серогруппе и наличия маркеров вирулентности рекомендуется выявлять присутствие в клетке плазмиды вирулентности pYV.

4. Плазмидный анализ и ПЦР с тест-системой «ДиаГен-Yersinia» для выявления ДНК плазмиды pYV в равной степени могут использоваться для выявления присутствия в клетках плазмиды вирулентности pYV, так как их результаты одинаковы.

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы доложены на Межрегиональной научной конференции молодых ученых и специалистов системы АПК Приволжского Федерального округа «Вавиловские чтения» (Саратов, 2003), на научно-практической конференции РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2004), на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы микробиологии и инфекционной патологии животных» (Омск, 2004), на Научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы за 2004 год (СГАУ им. Н. И. Вавилова, Саратов, 2005).

Материалы диссертации представлены в отчетах НИР кафедры микробиологии и ветсанэкспертизы ИВМиБ за 2003;2005 годы.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем диссертации

.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка использованной литературы, включающего 137 наименований, в том числе 86 иностранных, и приложения. Диссертация изложена на 100 страницах машинописного текста, иллюстрирована 13 таблицами и 9 рисунками.

Выводы.

1. Изучено 45 штаммов Y. enterocolitica, выделенных от павших поросят и поросят с признаками диареи (шестнадцать культур) и из молока коров (двадцать девять штаммов) в 2000;2003 годах в Саратовской области. Все культуры обладали типичными для вида свойствами. Большинство из них (двадцать семь культур) относились к серогруппам ОЗ и 09.

2. Биотипирование позволило отнести Y. enterocolitica к первому (А и В), второму, третьему и четвертому биоварампреобладают биоварианты 4 и 1А. Культуры, изолированные от павших поросят и от поросят с признаками диареи, чаще относятся к четвертому биовару, и лишь некоторые — к биоварам 1А и 3. Среди штаммов Y. enterocolitica, выделенных из молока коров, преобладают биовары 1А и 4, реже встречаются второй и третий.

3. С помощью плазмидного скрининга автономный репликон молекулярной массой 45−47 мДа (плазмида вирулентности pYV) был обнаружен только у возбудителей кишечного иерсиниоза, изолированных от павших и больных поросят — в семи случаях из шестнадцати. Ни у одного из двадцати девяти штаммов Y. enterocolitica, выделенных из молока коров, плазмида вирулентности pYV не найдена. Наличие маркеров вирулентности (кальцийзависимости, пигментсорбции, способности агглютинироваться сывороткой СВИ, температурозависимости колоний и аутоагглютйнации) не всегда совпадает с присутствием в клетках плазмиды pYV.

4. Результаты ПЦР-анализа с тест-системой «ДиаГен-Yersinia» для выявления ДНК плазмиды вирулентности иерсиний совпадают с результатами плазмидного скрининга. Они положительны только у культур, выделенных от поросят (шесть случаев из шестнадцати), и отрицательны у «молочных» штаммов.

5. ПЦР-анализ с тест-системой «АмплиСенс Yersinia enterocolitica-270», предназначенной для выявления специфического участка ДНК гена инвазина inv, показал, что этот ген равномерно распространен среди Y. enterocolitica, выделенных от разных групп животных, и, скорее всего, не связан с проявлением патогенных свойств микроба.

6. Плазмидный скрининг и ПЦР-анализ с тест-системой для выявления ДНК плазмиды pYV можно рекомендовать в качестве дополнительного теста при идентификации патогенных иерсиний.

Заключение

.

Yersinia enterocolitica — возбудитель кишечного иерсиниоза, заболевания, которое широко распространено в мире, в том числе и в России. По данным ВОЗ эта болезнь регистрируется более чем в 30 странах мира, чаще в странах с более прохладным климатом. Так, в Финляндии абсолютное число заболевших в 2001 году составило720 человек, в Швеции — 579, в Дании — 285 человек. В РФ (по данным ЦЬЖИЭ Минздрава России) ежегодно регистрируется 4−5 тысяч случаев иерсиниоза, т. е. 6−7 случаев на 100 тысяч населения. В некоторых регионах этот показатель намного выше: во Владивостоке он достигает 40−50 случаев на 100 тысяч В Саратовской области по данным Областного ЦСЭН наблюдается рост заболеваемости: в 1999 году зарегистрировано 10 случаев, в 2000 году — 26, в 2001 году — 18. Фактическая заболеваемость кишечным иерсиниозом превышает официально регистрируемую, так как не во всех регионах РФ на эту инфекцию обязательно исследуют в случае острых кишечных инфекций.

Болеют кишечным иерсиниозом и сельскохозяйствененые животные. Особенно восприимчив к Y. enterocolitica молодняк свиней. Иерсинии выделены от свиней, коров, мелкого рогатого скота, кроликов, птицы, а также от грызунов и диких животных (Зыкин, Щербаков, Хапцев, 2002). При иммунологическом обследовании животных Саратовской области в РА в высоком проценте случаев выявлены антитела к Y. enterocolitica (Хапцев, 2000).

Источниками инфекции являются сельскохозяйственные животные и грызуны, а факторами передачи — продукты животноводства и корма. С 1996 года введена официальная регистрация кишечного иерсиниоза у сельскохозяйственных животных, но это заболевание по-прежнему остается инфекцией, мало известной ветеринарным работникам, главным образом, в силу отсутсвия нормативно-технической документации, необходимых сред и диагностических препаратов.

В 1997 году профессором Зыкиным Л. Ф. и сотрудниками кафедры микробиологии Саратовского Аграрного Университета эта инфекция была выявлена среди сельскохозяйственных животных области, главным образом, среди свиней и КРС. В 2000;2003 годах к.б.н. 3. Ю. Хапцевым и к.б.н. Е. С. Осипчук от сельскохозяйственных животных были изолированы 45 штаммов Yersinia enterocolitica. Все выделенные культуры обладали характерными для вида фенотипическими свойствами. Доказана роль молока и мяса в передаче возбудителя, кишечного иерсиниоза.

Следующим этапом работы должно было стать всестороннее изучение штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных, в том числе генетическими методами.

Для Yersinia enterocolitica характерен внутривидовой полиморфизм: этот вид включает более 70 серовариантов, 6 биовариантов, встречаются патогенные и непатогенные представители. Для выявления патогенных иерсиний, согласно рекомендациям, определяют маркеры вирулентности: зависимость от ионов Са2+ при выращивании при 37 °C, сорбцию пигмента конго-красного или гемина из среды роста, способность агглютинироваться сывороткой СВИ (сыворотка к вирулентным иерсиниям), аутоагглютинацию на среде Кларка и температурозависимость колоний.

Для максимального проявления патогенных свойств по современным воззрениям, необходимо присутствие в клетках иерсиний плазмиды pYV и экспрессия кодируемых ею белков. Размеры плазмиды составляют около 70 тыс. пар оснований, что соответствует молекулярной массе 45−47 мДа. Штаммы, содержащие эту плазмиду, как правило, являются вирулентными, тогда как штаммы, лишенные ее, авирулентны. Поэтому обнаружение плазмиды pYV является важным признаком, указывающим на возможную эпидемическую и эпизоотологическую опасность исследуемого штамма.

Имеют значение для патогенности и многие факторы, кодируемые хромосомными генами. Например, ген inv кодирует белок инвазин, играющий важную роль в проникновении бактерий внутрь эпителиальных клеток. На основе специфических участков гена inv и плазмиды pYV созданы коммерческие ПЦР-тест-системы, рекомендуемые производителями для идентификации патогенных иерсиний.

Нашей задачей было изучить биохимические свойства Y. enterocolitica, выделенных от сельскохозяйственных животных, для того, чтобы определить биоварианты этого микроба различного происхождения, с помощью генетических методов обнаружить плазмиду вирулентности в клетках и присутствие гена инвазина в хромосоме, а также выяснить, возможно ли применять указанные ПЦР-тест-системы для индикации патогенных иерсиний.

Всего подробно были изучены сорок девять штаммов Y. enterocolitica: шестнадцать из них были выделены в 2000 году З. Ю. Хапцевым от больных поросят и поросят с признаками диареи в хозяйствах Саратовского и Марксовского районов Саратовской области, двадцать девять культур изолированы в 2003 году Е. С. Осипчук из молока коров в хозяйствах Петровского района и четыре штамма — музейные культуры из коллекции кафедры микробиологии СГАУ. Биохимические признаки штаммов возбудителей кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных Саратовской области были типичными и в целом соответствовали описанным в литературе.

Были определены биовары изучаемых культур Большинство культуродиннадцать, изолированных от павших и больных поросят, относились к биовару 4, одна — к биовару 3, и лишь четыре штамма — к непатогенному биовару 1А. Важно отметить, что Y. enterocolitica биоваров 3 и 4 принадлежали к эпидемиологически и эпизоотологически значимой серогруппе ОЗ, тогда как четыре «непатогенных» штамма — к иным сероварам, т. е. установлена корреляция между серогруппами и биоварами Y. enterocolitica.

Результаты наших исследований совпадают с литературными данными о биовариантах иерсиний, циркулирующих среди животных. Различные исследователи указывают на важное значение 2−5 биоваров (Чеснокова, Марамович, Климов, 1997), на выделение от свиней в большинстве случаев четвертого биовара, и реже — третьего и второго (Климов, Чеснокова, Марамович, 1997; Маркик, 1993; Стефанов, 1989). Из молока коров изолируются Y. enterocolitica первого и третьего биоваров (Павлов и др., 1988). В последние годы появились сообщения о выделении иерсиний биовара 1А от больных людей (Grant, Bennet-Wood, Robins-Brown, 1998). Наши исследования показывают возможность выделения биовара 1А и от больных животных.

Биотипирование Y. enterocolitica различного происхождения показало, что определение биоварианта выделенной культуры возбудителя кишечного иерсиниоза — необходимая процедура при исследовании Y. enterocolitica ветеринарного происхождения.

Следующий раздел нашей работы предполагал исследование штаммов возбудителя кишечного иерсиниоза генетическими методами. Работ, посвященных генетическим исследованиям Y. enterocolitica, выделенных от сельскохозяйственных животных, в отечественной литературе мало, поэтому этот раздел важен не только с теоретических, но и с практических позиций.

Плазмидный скрининг культур позволил дифференцировать штаммы, содержащие плазмиду от бесплазмидных. Оказалось, что плазмиду вирулентности pYV удалось обнаружить лишь в клетках культур, выделенных от павших поросят и поросят с признаками диареи. Внехромосомный репликон молекулярной массой 45−47мДа был обнаружен у семи штаммов из шестнадцати. Важно, что наличие плазмиды не всегда совпадало с маркерами вирулентности, кодируемыми плазмидой, например, с кальцийзависимостью. Культуры, изолированные от поросят хозяйства «Трудовое» Марксовского района, имели полный набор маркеров вирулентности, но не имели плазмиду pYV. Штаммы Y. enterocolitica, изолированные из молока коров, не содержали плазмиду вирулентности pYV. Однако пятнадцать из двадцати девяти «молочных» штаммов имели полный набор маркеров вирулентности. Объяснить это можно было бы, предположив, что плазмида интегрирована в хромосому. Такая возможность была показана А. Л. Гинцбургом с соавторами (1989). При этом может сохраняться экспрессия детерминант патогенности. Реальность этой гипотезы может быть проверена экспериментально методом генетического зондирования или полимеразной цепной реакции.

Для этого мы провели ПЦР-анализ штаммов возбудителей кишечного иерсиниоза, изолированных от больных и павших поросят и из молока КРС. Были использованы две тест-системы: «ДиаГен-Yersinia'» для выявления ДНК плазмиды вирулентности pYV Y. enterocolitica и «АмплиСенс Yersinia enterocolitica-210», предназначенной для выявления специфического участка ДНК гена инвазина inv вирулентных штаммов Y.enterocolitica.

Результаты ПЦР-исследования культур тест-системой «ДиаГен-Yersinia» почти полностью совпали с результатами плазмидного скрининга. ДНК плазмиды pYV обнаружена только у Y. enterocolitica, выделенных от павших и больных поросят, в шести случаях из шестнадцати. Плазмидный скрининг определяет присутствие автономного репликона в клетках. ПЦР обнаруживает нуклеотидную последовательность, независимо от того, автономна плазмида или встроена. Положительные результаты ПЦР и плазмидного анализа были получены у одних и тех же штаммов. Совпадение результатов плазмидного скрининга и ПЦР свидетельствует о том, что интеграция плазмиды в хромосому у изученных штаммов маловероятна (хотя и не исключается).

Определив плазмидный профиль культур, мы получили еще один аргумент в пользу того, что основным резервуаром и источником иерсиниозной инфекции являются свиньи. Именно от них выделяются высоковирулентные штаммы Y.enterocolitica. Тот факт, что ни у одной из двадцати девяти культур, изолированных из молока, не обнаружена плазмида вирулентности pYV, свидетельствует, по нашему мнению, о том, что КРС не «имеет большого значения как источник инфекции. К такому же выводу пришли в своей работе немецкие ученые М. Bucher, М. Fredriksson-Ahomaa и A. Stolle (2002).

Проведен ПЦР-анализ другой тест-системой, «АмплиСенс Yersinia enterocolitica-21§ y>. Она направлена на распознавание хромосомного гена inv в клетках Y.enterocolitica. Ген inv обнаружен у двадцати культур из сорока пяти изученных. Оказалось, что этот ген одинаково распространен как среди культур, изолированных от больных и павших поросят (у восьми культур из шестнадцати), так и. среди штаммов, выделенных из молока КРС (у двенадцати из двадцати девяти). Корреляции с патогенными свойствами, принадлежностью к определенным биовариантам и серогруппам не было обнаружено. По литературным данным, ген инвазина обнаруживается как у патогенных, так и у непатогенных штаммов иерсиний (Ценева, Солодовникова, Воскресенская, 2002). Наши исследования этот факт подтверждают.

Мы имели возможность сравнить две иерсиниозные ПЦР-тест-системы. Они не отличались по чувствительности и специфичности. Чувствительность обеих тест-систем составляет <1×103 КОЕ/мл. Обе они оказались достаточно специфичны. Положительные результаты наблюдались только с Y. enterocolitica, но не с культурами испытанных гетерологичных микроорганизмов (E.coli, S. enteritidis, S. faecalis и Y. pseudotuberculosis). Хорошо зарекомендовали себя тест-системы и при исследовании биологических объектов — фекалий свиней, искусственно контаминированных Y. enterocolitica в дозе 1×105 мт/мл. Положительные результаты были получены при использовании и «ДиаГенYersinia» и «АмплиСенс Yersinia enterocolitica-21§ y>.

Все три генетических метода, которые мы применили, могут быть рекомендованы для исследования штаммов Y. enterocolitica. ПЦР с тест-системой «АмплиСенс Yersinia enterocolitica-21 ()» для выявления гена инвазина может использоваться для обнаружения возбудителя кишечного иерсиниоза, а также для дополнительной характеристики штамма. Аналогичные рекомендации даны Корчагиным Г. А. (2002) в связи с высокой распространенностью и сохранностью при пересевах гена inv. Однако для индикации патогенных иерсиний необходимо определить плазмидный профиль выделенной культуры, так как важнейшее значение для реализации патогенных свойств микроба имеет присутствие в клетках плазмиды pYV.

Наши исследования четко показали — хромосомный ген inv распространен равномерно у штаммов, циркулирующих среди разных групп животных, а плазмида вирулентности встречается исключительно у возбудителей кишечного иерсиниоза, изолированных от павших поросят и от поросят с явлениями диареи, т. е. в случаях, когда клинически проявляются патогенные свойств микроба. Нельзя забывать о наличии у половины культур, выделенных из молока, полного набора маркеров вирулентности. Данные литературы свидетельствуют о расширении спектра возможных возбудителей иерсиниоза. Поэтому для решения вопроса о патогенности выделенной культуры необходимо определение комплекса признаков: серогрупповой принадлежности, биоварианта, наличия маркеров вирулентности и присутствия в клетках плазмиды вирулентности pYV. Поскольку результаты ПЦР-анализа с тест-системой «ДиаГенYersinia» практически идентичны результатам плазмидного скрининга, для выявления плазмиды можно выбирать любой метод в зависимости от возможностей исследователя. Плазмидный скрининг даже предпочтительнее, т.к. требует меньше специального оборудования и материальных затрат. Аналогичные рекомендации даны для возбудителей кишечного иерсиниоза человека (Климов и др., 1997) В последних методических рекомендациях по диагностике кишечного иерсиниоза (Псевдотуберкулез и кишечный иерсиниоз, Вологда, 2003; Псевдотуберкулез, иерсиниоз, Санкт-Петербург, 2005) предусматривается возможность использования ПЦР для выявления генетических детерминант, локализованных в плазмиде вирулентности. Мы подтвердили возможность применения на практике ПЦР-тест-системы «ДиаГенYersiniav> и плазмидного скрининга и можем рекомендовать эти методы для диагностики кишечного иерсиниоза.

Генетические исследования штаммов возбудителей кишечного иерсиниоза сельскохозяйственных животных показали необходимость определять наличие плазмиды pYV у «ветеринарных» штаммов Y. enterocolitica с целью выяснения их эпидемиологической и эпизоотологической значимости. Особенно это касается культур, изолированных от свиней.

Наши исследования показывают необходимость комплексного подхода к вопросу о патогенности Y. enterocolitica и дальнейшего изучения особенностей этого микроорганизма.