Разработка методов получения и культивирования первичных и перевиваемых культур клеток животных для производства вирусных вакцин

Актуальность проблемы.

Современная биотехнология вышла на новый качественный уровень. На основе достижений молекулярной биологии и генной инженерии разработаны и производятся в промышленных масштабах десятки различных биотерапевтических препаратов [108,134,235,305,317]. Интенсивные исследования проводятся и по разработке противовирусных вакцин нового поколения [59,131,182,202,204,258,275,293,297,299], однако предсказать сроки начала их практического применения не представляется возможным. В связи с этим вирусные вакцины, получаемые на клеточных культурах, по-видимому, будут продолжать играть в обозримом будущем ведущую роль в профилактике вирусных инфекций.

Массовое производство практически всех медицинских вирусных вакцин в настоящее время основано на первичных культурах клеток. Поэтому увеличение биомассы культуры-продуцента, получаемой от одного животного-донора ткани, остается важным этапом производственного процесса. Решение этой задачи может быть осуществлено либо за счет увеличения сборов первично-трипсинизированных клеток, либо за счет использования более эффективных способов культивирования клеток. В силу биологических особенностей первично-трипсинизированных клеток кардинально усовершенствовать или заменить рутинные способы культивирования клеток не представляется возможным. Таким образом, дальнейшее совершенствование способов дезагрегации исходных тканей животных-доноров остается по-прежнему актуальным.

Как известно, определяющими и тесно взаимосвязанными звеньями любой технологии, основанной на использовании культур клеток животных, являются сама культура-продуцент и способ ее культивирования.

Традиционные технологии изготовления культуральных вирусных вакцин на базе первичных культур клеток уже не могут в полной мере обеспечить постоянно растущую потребность практического здравоохранения в эффективных, безопасных и экономичных препаратах.

Очевидно, что для создания новых технологий необходим другой тип клеточного субстрата. Таким субстратом являются перевиваемые линии клеток (ГШК). Несмотря на то, что ПЛК широко применяются в вирусологических исследованиях, использование их для получения медицинских биопрепаратов длительное время сдерживалось. Основное возражение сводилось к возможной онкогенности полученных на их основе биопрепаратов. Однако, тщательный анализ многочисленных данных, проведенный в рамках «Программы биологической стандартизации» ВОЗ, показал, что культуры, полученные из банков перевиваемых линий клеток, предварительно аттестованных в соответствии с международными требованиями к клеточным субстратам, являются наиболее безопасными и перспективными для производства биопрепаратов [153,200, 319].

Разрешение ВОЗ на использование в качестве клеточных субстратов ПЛК позволило внедрить в практику новые эффективные способы культивирования клеток при изготовлении биопрепаратов. Одним из таких способов является культивирование клеток на частицах микроносителей в суспензии (псевдосуспензионное культивирование) [307]. Этот метод обеспечивает резкое (на порядок и выше) увеличение удельной ростовой поверхности по сравнению с другими культуральными системами. Кроме того, он позволяет значительно снизить или полностью исключить ряд существенных недостатков, присущих другим способам культивирования субстрат-зависимых клеток, а именно: 1) сложность масштабирования- 2) невозможность регулирования и поддержания оптимальных параметров культивирования- 3) трудности с обеспечением однородности культуры;

4) трудности с визуальным контролем качества культуры- 5) низкие выходы клеточной биомассы.

Создание новых типов микроносителей (МП) и разработка промышленных биореакторов с улучшенными массообменными и гидродинамическими характеристиками позволили существенно повысить эффективность псевдосуспензионного способа культивирования клеток [93,99,111,113,140,159,215,249,295,306,321]. За рубежом уже освоен выпуск ряда медицинских и ветеринарных вакцин с применением биореакторной технологии на постоянных линиях клеток [141,179,180, 193,206,218,219,247,255,262,263]. В России в силу ряда обстоятельств псевдосуспензионное культивирование клеток и вирусов на микроносителях все еще остается на уровне лабораторных исследований.

Цель и задачи исследования

.

Целью данной работы являлась разработка высокоэффективных и технологичных способов получения и культивирования первичных и перевиваемых культур клеток обезьян, пригодных для использования в качестве клеточных субстратов при изготовлении различных вирусных вакцин.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Разработать способ дезагрегации почек зеленых мартышек, позволяющий увеличить объем производственной партии культуры-продуцента, получаемой от животного-донора ткани;

2. Изучить возможность получения из селезенок зеленых мартышек первичных и перевиваемых культур клеток, пригодных для вирусологических исследований;

3. Провести обследование отечественных культур клеток обезьян и создать криобанки линий, отвечающих требованиям ВОЗ к перевиваемым линиям клеток, разрешенным для использования при изготовлении медицинских иммунобиологических препаратов;

4. Изучить возможность использования для размножения вакцинных штаммов вирусов полиомиелита (штаммы Сэбина типов I, II и III), клещевого энцефалита (штамм Софьин), бешенства (штамм Внуково-32), чумы плотоядных (штамм Рокборн) отечественных линий клеток почек и селезенок обезьян;

5. Установить оптимальные параметры культивирования клеток линии Vero и вакцинных штаммов вируса полиомиелита в условиях псевдосуспензии для отработки модельной технологии изготовления вакцины против полиомиелита в биореакторах;

6. Провести оценку экспериментальных серий моновакцин I, II и III типов против полиомиелита, приготовленных на клетках линии Vero с использованием биореакторной технологии;

7. Изучить закономерности размножения вируса клещевого энцефалита (штамм Софьин) в клетках линии Vero, культивируемых на микроносителях, и разработать экспериментальную систему, обеспечивающую стабильную продукцию культурального антигена.

Научная новизна.

Впервые разработан способ трипсинизации почек обезьян, позволяющий управлять процессом дезагрегации паренхимы органа и получать преимущественно либо взвесь дискретных клеток, либо взвесь фрагментов почечных канальцев и клубочков.

Впервые установлена и аттестована новая перевиваемая линия клеток селезенки взрослой зеленой мартышки 455 — линия 455. Показано, что клетки линии 455 не контаминированы посторонними агентами, не туморогенны, высокочувствительны к различным группам вирусов, сохраняют стабильными свои характеристики на протяжении 40 последовательных пассажей.

Впервые определены спонтанный уровень сестринских хроматидных обменов (СХО), а также локализация и структура ядрышкообразующих районов (ЯОР) хромосом в перевиваемых культурах клеток обезьян Сег-copithecus aethiops. Показано, что выявленные особенности ЯОР хромосом являются генетическим маркером клеток этого вида обезьян.

Разработана технология получения новой вакцины против чумы плотоядных из штамма Рокборн на линии клеток 4647.

Разработана модельная технология изготовления вакцины против полиомиелита на основе псевдосуспензионного метода культивирования штаммов Сэбина и клеток линии Vero в биореакторе.

Установлено, что при псевдосуспензионном культивировании штамма Софьин вируса клещевого энцефалита в клетках линии Vero происходит стабильно высокое накопление вирусного антигена в жидкой фазе культуры. Показана возможность получения нескольких сборов вирусного урожая от одной культуры-продуцента до наступления деструкции клеточного пласта на частицах микроносителя.

Практическая значимость работы.

Перфузионный способ дезагрегации почек обезьян используется с 1982 г в ФГУП «ПИПВЭ им. М. П. Чумакова РАМН» для получения первичных культур клеток при изготовлении вакцины против полиомиелита. За этот период изготовлено и поставлено (в том числе и за рубеж) более 1,2 млрд доз полиовакцины и около 200 млн доз вакцины против чумы плотоядных. Метод защищен авторским свидетельством № 914 624, утверждены методические рекомендации по его применению (М., 1983).

Созданы криобанки клеток линий 455, 4647 и Vero, отвечающие требованиям ВОЗ к клеточным субстратам, разрешенным для использования при производстве медицинских иммунобиологических препаратов. Посевной банк клеток линии 4647 на уровне 90 пассажа и рабочий банк клеток линии Vero на уровне 139 пассажа лицензированы ГИСК им. Л. А. Тарасевича МЗ РФ.

Экспериментально показано, что монослойные культуры, приготовленные из установленных банков клеток линий 455, 4647 и Vero, могут быть использованы в качестве стандартного клеточного субстрата в научных и прикладных вирусологических исследованиях.

На культурах, полученных из клеток посевного банка линии 4647, приготовлены экспериментальные серии вакцин против клещевого энцефалита (штамм Софьин), чумы плотоядных (штамм Рокборн), а также моновакцины против полиомиелита (штаммы Сэбина типов I, II и III). Полученные препараты успешно прошли все необходимые регламентные контроли и по своим характеристикам не отличались от коммерческих препаратов, приготовленных на первичных культурах клеток.

Утверждена Ведомость изменений к существующей нормативно-технической документации, разрашающая применение линии 4647 в качестве альтернативного клеточного субстрата для накопления и титрования вируса чумы плотоядных при изготовлении Вакчум (ТУ 46−12−32 085).

Монослойные культуры, приготовленные из лицензированного банка посевных клеток линии 4647, используют в качестве клеточного субстрата при производстве цельновирионной инактивированной культу-ральной вакцины «Геп-А-ин-Вак» против гепатита, А в ГНЦВБ «Вектор» (г. Новосибирск).

На основании экспериментальных исследований установлены оптимальные параметры и режимы культивирования клеток линии Vero на микроносителях в условиях псевдосуспензии в различных типах спиннеров и биореакторов, Разработана высокоэффективная методика серийного пассирования клеток на частицах микроносителей, обеспечивающая стабильное получение культуры-продуцента в промышленных масштабах в пределах разрешенных ВОЗ уровнях пассажей культуры.

Разработаны модельные технологии культивирования клеток линии Vero и вакцинных штаммов вируса полиомиелита (штаммы Сэбина типов I, II и III) и клещевого энцефалита (штамм Софьин) в биореакторах, обеспечивающие получение высоких урожаев вирусной биомассы. Получен-ны экспериментальные серии полиовакцины, которые по всем показателям, включая и тест на остаточную нейровирулентность in vivo, не отличаются от серий вакцины, приготовленных на первичных культурах клеток почек обезьян в производственных условиях. Установлено, что содержание нейровирулентных мутантов по MAPREC-тесту в экспериментальных сериях вакцины значительно ниже предельно допустимых значений.

Апробация работы.

Материалы работы были представлены на II Всесоюзной конференции по криобиологии и медицине (Харьков, 1984) — на Международной научной конференции по актуальным проблемам медицинской вирусологии (Москва, 1985) — на II, III и IV Всесоюзных совещаниях «Культивирование клеток животных и человека» (Пущино, 1985,1990,1992) — на юбилейной конференции, посвященной 85-летию Томского НИИ вакцин и сывороток (Томск, 1991) — на научно-практической конференции «Природно-очаговые болезни человека» (Омск, 1996) — на 2-ой Международной конференции, посвященной 100-летию Пермского НПО «Биомед» (Пермь, 1998) — на Международной юбилейной конференции, посвященной 90-летию М. ПЛумакова (Москва, 1999).

По теме диссертации опубликовано 29 научных работ, в том числе 2 монографии. Получено 6 авторских свидетельств и 2 патента. Научно-практические разработки вошли составной частью в Фармакопейные статьи и Производственные регламенты вакцин ОПВ и Вакчум, выпускаемых ФГУП «ПИПВЭ им. М. П. Чумакова РАМН» .

Благодарности.

Выражаю искреннюю благодарность директору Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН академику РАМН С. Г. Дроздову и директору ФГУП Института Г. А. Беловой за предоставленную возможность выполнения данной работы.

Особую благодарность выражаю моим научным консультантам д.м.н., профессору Любови Леонидовне Мироновой и д.б.н., профессору Виктору Павловичу Грачеву за постоянную поддержку и искреннюю заинтересованность в результатах моей научной и производственной деятельности.

Я искренне признателен сотрудникам ИПВЭ им. М. П. Чумакова РАМН и ФГУП «ПИПВЭ им. М. П. Чумакова РАМН» д.м.н. Кармышевой В. Я., д.м.н. Тимофееву А. В., к.б.н. Аксеновой Т. А., к.м.н. Алпатовой Г. А., к.м.н. Дзагуровой Т. К., к.б.н. Каргановой Г .Г., к.м.н. Козлову В. Г., к.б.н. Орловой Т. М., к.б.н. Поповой В. Д., к.м.н. Соболеву С. Г, к.м.н. Стобецко-му В.И., Клеблеевой Т. Д., Кондратьевой Я. Ю. за сотрудничество.

Искренне благодарен сотрудникам ГИСК им. Л. А. Тарасевича МЗ РФ д.м.н. Шалуновой Н. В., д.б.н Ломановой Г. А., к.б.н. Бердниковой З. Е., к.м.н. Петручук Е. М., принимавшим участие в проведении совместных экспериментов по аттестации банков клеток линий 4647 и Vero.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Выводы.

1. Впервые разработан перфузионный способ трипсинизации почек обезьян, позволяющий управлять процессом дезагрегации и получать взвеси, состоящие преимущественно из дискретных клеток или фрагментов почечных канальцев и клубочков. Способ позволяет в 4−5 раз увеличить выход производственной партии культуры-продуцента и объем вирусной суспензии, получаемых из 1 пары почек животных, при изготовлении вакцин против полиомиелита и чумы плотоядных по сравнению с трипсинизацией измельченных кусочков ткани.

Перфузионный способ трипсинизации почек обезьян используется более 20 лет в ФГУП «ПИПВЭ им. М. П. Чумакова РАМН» для получения первичных культур клеток почек зеленых мартышек при производстве вакцин против полиомиелита и чумы плотоядных.

2. Созданы и аттестованы криобанки клеток линий 455, 4647 и Vero. Посевной банк клеток линии 4647 и рабочий банк клеток линии Vero сертифицированы ГИСК им. Л. А. Тарасевича МЗ РФ и Комитетом МИБП МЗ РФ и рекомендованы к использованию в качестве субстратов для приготовления диагностических препаратов и производства профилактических медицинских иммунобиологических препаратов.

Сертифицированная линия клеток 4647 используется в качестве клеточного субстрата при производстве первой отечественной цельновири-онной инактивированной вакцины против гепатита, А «Геп-А-ин-ВАК» в ГНЦ ВБ «Вектор».

3. На основе экспериментальных исследований разработана технология получения монослойных культур клеток линии 4647 в промышленных масштабах и определены оптимальные условия накопления вакцинного штамма вируса чумы плотоядных (штамм Рокборн) в них.

Проведенные исследования позволили утвердить линию 4647 в качестве альтернативного клеточного субстрата для накопления и титрования вируса чумы плотоядных при изготовлении вакцины «Вакчум» .

4. Установлено, что в клетках линии 4647 вакцинные вирусы полиомиелита (штаммы Сэбина типов I, II и III), клещевого энцефалита (штамм Софьин) и бешенства (штамм Внуково-32) накапливаются в таких же высоких титрах, как и в первичных культурах клеток. На экспериментальном уровне отработана принципиальная схема накопления в жидкой фазе культуры 4647 антигена вируса клещевого энцефалита и очистки его от балластной клеточной ДНК. Приготовленные по этой схеме экспериментальные серии вакцины по своим характеристикам соответствуют требованиям к вакцине против клещевого энцефалита.

5. Разработана методика культивирования клеток линии Vero в условиях псевдосуспензии с однократной заменой среды роста (среда Игла MEM с 5% сыворотки крупного рогатого скота), обеспечивающая эффективность посева клеток свыше 90% и индекс пролиферации культур на уровне 6,0−8,0.

6. Разработана методика пассирования клеток линии Vero на частицах микроносителей, обеспечивающая наработку клеточной биомассы в промышленных масштабах. Экспериментально показано, что доля жизнеспособных клеток, собранных при отделении их от частиц микроносителей, составляет более 80% от количества клеток, выросших в исходных псевдосуспензиях.

7. Разработана методика культивирования клеток линии Vero и вакцинных штаммов Сэбина типов I, II и III вируса полиомиелита в условиях псевдосуспензии в биореакторах. Установлены оптимальные параметры и режимы культивирования, обеспечивающие накопление вакцинных штаммов вируса полиомиелита в титрах, превышающих показатель 8,0 lg.

БОЕ/мл. Показано, что экспериментальные серии препарата, полученные на сертифицированной линии клеток Vero с использованием биореакторной технологии, по всем своим показателям соответствуют требованиям к оральной полиомиелитной вакцине.

8. Разработана методика культивирования клеток линии Vero и штамма Софьин вируса клещевого энцефалита в условиях псевдосуспензии, обеспечивающая стабильно высокое накопление вирусного антигена в жидкой фазе культуры. Оптимизированы условия выращивания вируса в этой клеточной системе, показана возможность получения не менее 4-х сборов вирусного урожая с высоким содержанием специфического антигена от одной культуры-продуцента.

9. Разработана система получения и выращивания первичных и перевиваемых культур клеток обезьян, обеспечивающая возможность накопления в них вакцинных штаммов вирусов полиомиелита, клещевого энцефалита, бешенства и чумы плотоядных с сохранением аттенуирован-ных свойств.