Совершенствование иммунодиагностики кишечного иерсиниоза на основе моноклональных антител

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Кишечный иерсиниоз принадлежит к числу трудно диагностируемых острых инфекций и часто регистрируется под видом других заболеваний, таких как аппендицит, инфекционный гепатит, острая респираторная вирусная инфекция, скарлатина, холецистит и др. [28, 123]. Большой научный и практический интерес к кишечному иерсиниозу обусловлен широким распространением возбудителя в природе, резистентностью его к низким температурам, появлением не только спорадических заболеваний, но и крупных вспышек в организованных коллективах [21]. Трудности в постановке клинического диагноза, длительность бактериологического выделения возбудителя, перекрестная иммунореактивность с рядом других микроорганизмов являются основанием для совершенствования методов и приемов диагностики этой инфекционной болезни.

Существующие в настоящее время кишечноиерсиниозные иммунодиагностические тест-системы преимущественно сконструированы на основе кроличьих антисывороток, содержащих поликлональные антитела, или антигенов Yersinia enter ocolitica. Разработаны препараты для реакции агглютинации (РА) [16, 19, 23, 24, 109−111], эритроцитарные [34, 55, 56, 127−130], коагглютинирующие [29, 53, 95] и латексные [5, 34, 121] диагностикумы. Однако указанные препараты не всегда удовлетворяют требованиям, предъявляемым к их информативности, чувствительности и специфичности. Ввиду тесного антигенного родства возбудителя кишечного иерсиниоза с представителями родов Yersinia, Brucella, семейства Enterobacteriaceae и др. при получении специфических сывороток приходится использовать весьма трудоемкие и длительные методы адсорбции, приводящие к снижению титра антител. Источники получения сывороток, как правило, ограничены, и они трудно поддаются стандартизации. Эти недостатки можно устранить с помощью моноклональных антител (МКА) с использованием гибридомной биотехнологии.

МКА имеют ряд существенных преимуществ: они обладают строгой специфичностьюимеют одинаковую структуру, идиотип, аллотип, аффинность и авидность, что позволяет их легко стандартизировать [1, 47−49, 91]- доступны в достаточно больших количествах при культивировании продуцентов МКАгибридомных клеток — in vitro и in vivoтитры МКА в биологическом сырье (асцитической жидкости) обычно выше, чем в поливалентных гипериммунных сыворотках.

В 80−90 годах прошлого столетия за рубежом [145, 183, 230, 235, 236] получены МКА к отдельным антигенам Y. enterocolitica, в том числе к видои серовароспецифическим, которые, в основном, используются для проведения научно-исследовательских работ, связанных с изучением антигенной структуры возбудителя. Лишь в последние 5 лет отечественным ученым удалось создать гибридомы, синтезирующие МКА к 09 серовару Y. enterocolitica [2, 70]. На основе МКА к 09 серовару разработан и испытан в лабораторных условиях иммунофлуоресцентный диагностический препарат [2]. Вместе с тем в распоряжении российских специалистов отсутствуют диагностические тест-системы на основе МКА к не менее важному с эпидемиологической точки зрения 03 серовару, а также к некоторым другим серовариантам кишечноиерсиниозных бактерий, циркулирующих в природе. В связи с этим получение отечественного набора МКА, имеющих научно-прикладное значение, особенно в перспективе создания на их основе диагностических тест-систем для обнаружения, идентификации и серотипирования кишечноиерсиниозных бактерий, имеет весьма актуальное значение.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ — получение гибридом-продуцентов моноклональных антител к антигенам возбудителя кишечного иерсиниоза, изучение их свойств и разработка на основе набора МКА экспериментальных диагностических иммуноферментных тест-систем для выявления, идентификации и серотипирования Y. enterocolitica.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Подобрать оптимальную схему иммунизации мышей растворимым и корпускулярными кишечноиерсиниозными антигенами для получения максимального количества специфически стимулированных спленоцитов.

2. Модифицировать условия культивирования гибридом с целью повышения эффективности гибридизации.

3. Получить клеточные линии гибридом, стабильно продуцирующих МКА к Y. enterocolitica in vitro и in vivo.

4. Изучить иммунохимические свойства моноклональных антител.

5. Определить с помощью MICA антигенные детерминанты, отвечающие за специфичность отдельных сероваров Y. enterocolitica, установить их природу.

6. Сконструировать и апробировать в лабораторных условиях экспериментальные моноклональные иммуноферментные тест-системы для обнаружения, идентификации и серотипирования Y. enterocolitica.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Разработаны оптимальные схемы иммунизации мышей BALB/c — источники иммунных спленоцитов для гибридизации с сингенными клетками мышиной миеломы и усовершенствованы отдельные этапы гибридомной технологии, повышающие эффективность получения стабильных антителопродуцирующих гибридом.

Получен оригинальный набор MICA, обладающих избирательной специфичностью в отношении бактерий Y. enterocolitica и его отдельных серовариантов, в том числе, имеющих эпидемиологическое значение.

Впервые установлено, что сероваропринадлежность штаммов Y. enterocolitica может определяться не только углеводами О-специфических боковых цепей бактериального липополисахарида или его коровой части, но и антигенными детерминантами белковой природы, экспрессия которых не зависит от наличия или отсутствия плазмиды pCad.

Новыми являются сведения о том, что общий для патогенных иерсиний термостабильный белок с м.м. (38 (40) ± 2) кДа содержит как видо-, так и серовароспецифические эпитопы возбудителя кишечного иерсиниоза.

Впервые выделена стабильная линия гибридных клеток, секретирующих моноклональные антитела, специфически взаимодействующие одновременно с двумя наиболее распространенными в России 03 и 09 серовариантами кишечноиерсиниозных бактерий.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

— Создана клонотека стабильных гибридных клеточных линий, синтезирующих МКА к антигенам Y. enterocolitica 03- 04,32- 05- 05,27- 06,30- 09 сероваров, которые могут быть использованы для изучения антигенной структуры возбудителя и конструирования иммунодиагностических препаратов с целью лабораторной диагностики кишечного иерсиниоза. Три линии гибридом, продуцирующих МКА к Y. enterocolitica 03 серовара (1G7.2), к Y. enterocolitica 09 серовара (1Вюл) и одновременно к обоим указанным сероварам (1C10.i), депонированы в Специализированной коллекции культур клеток позвоночных Российской коллекции клеточных культур (г. С.-Петербург) под номерами РККК (П) 680Д, РККК (П) 678Д, РККК (П) 679Д.

— Образцы МКА к видои серовароспецифическим эпитопам возбудителя кишечного иерсиниоза успешно прошли лабораторные комиссионные испытания в соответствии с программой, утвержденной директором РосНИПЧИ «Микроб» 8 января 2003 г.

— Экспериментальные иммуноферментные тест-системы для обнаружения, идентификации и серотипирования Y. enterocolitica в ТИФА и ДИА, сконструированные на основе набора МКА, апробированы на коллекционных и свежевыделенных штаммах Y. enterocolitica от больных людей и из объектов, А внешней среды.

— Подана заявка на изобретение «Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. РККК (П) 679Д — продуцент моноклональных антител, специфичных к белково-полисахаридному антигену Yersinia enterocolitica 03 и 09 сероваров» в Федеральную службу по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам.

— По материалам диссертации составлены методические рекомендации «Идентификация возбудителя кишечного иерсиниоза 03 и 09 сероваров в иммуноферментном анализе с помощью моноклональных антител», одобренные Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» (Протокол № 7 от 23 сентября 2003 г.) и утвержденные директором института 23.09.2003 г.

— Материалы диссертации используются при чтении лекций по иммунологии и лабораторной диагностике инфекционных заболеваний на курсах специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей по бактериологии, иммунологии и эпидемиологии при РосНИПЧИ «Микроб» .

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Белково-полисахаридный комплекс (БПК) Y enterocolitica 03 серовара, выделенный методом уксуснокислого гидролиза, содержит родо-, видои серовароспецифические антигенные детерминаты.

2. Оптимизация схем иммунизации линейных мышей BALB/c кишечноиерсиниозными антигенами и условий селективного отбора гибридных клеток повышает эффективность слияния лимфоцитов в 10−100 раз и число гибридом, продуцирующих моноклональные антитела разной специфичности, в среднем в 10−20 раз.

3. Использование спленоцитов линейных мышей, иммунизированных корпускулярным антигеном Y. enterocolitica 03 серовара, при слиянии с сингенными мышиными миеломными клетками приводит к образованию гибридом, секретирующих моноклональные антитела не только к выше указанному, но и к ряду других серовариантов кишечноиерсиниозных бактерий.

4. Серовароспецифические кишечноиерсиниозные моноклональные антитела направлены к антигенным детерминантам не только углеводной, но и белковой или гликопептидной природы.

5. Видоспецифические эпитопы Y. enterocolitica локализованы на термостабильном полипептиде, молекулярная масса которого определяется сероваром бактерий. Его синтез не зависит от температуры культивирования и плазмидного состава штаммов.

6. Сконструированные на основе МКА экспериментальные иммуноферментные тест-системы позволяют проводить индикацию, идентификацию и серотипирование штаммов Y. enterocolitica с чувствительностью 3,1 • 104- 2,3 • 105 м.к./мл в ТИФА и 7,8 • 103- 2,5 ¦ 105 м.к./мл в ДИА в зависимости от сероваропринадлежности микробов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены на:

— Российской научно-практической конференции, посвященной 100-летию Астраханской противочумной станции МЗ РФ, Астрахань, 2001 г.

— Международной научно-практической конференции, посвященной 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летию Талдыкорганской противочумной станции, Алматы, 2001 г.

— Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 50-летию Дагестанской ПЧС, Махачкала, 2002 г.

— 69-й итоговой научной конференции сотрудников КГМУ и научной сессии отделения медико-биологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН, Курск, 2004 г.

— итоговых научных конференциях РосНИПЧИ «Микроб», Саратов, 2000, 2001, 2003 гг.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (1 главы), собственных исследований (4 глав), заключения, выводов и списка литературы, включающего 242 источника, в том числе 114 зарубежных. Материалы диссертации изложены на 131 странице машинописного текста и включают в себя 27 таблиц, 10 рисунков.

выводы.

1. Создана коллекция гибридом, стабильных продуцентов моноклональных антител к антигенам Y. enterocolitica 03- 09- 04,32- 05- 05,27 и 06,30 сероваров, которые могут быть использованы для иммунохимической характеристики бактерий и разработки иммунобиологических препаратов в целях лабораторной диагностики кишечноиерсиниозной инфекции.

2. На основе набора вид ои серовароспецифических моноклональных антител разработаны и успешно испытаны в лабораторных условиях экспериментальные иммуноферментные тест-системы (для ТИФА и ДИА) для обнаружения, идентификации и серотипирования от 7,8 • 103 до 2,3 • 105 бактерий Y. enterocolitica^.

3. С помощью полии моноклональных антител установлено, что белково-полисахаридный комплекс, выделенный из бактериальной массы Y. enterocolitica 03 серовара методом уксуснокислого гидролиза, обладает высокой перекрестной иммунореактивностью и содержит родо-, видои серовароспецифические антигенные детерминанты.

4. Экспериментально определены оптимальные схемы иммунизации линейных мышей кишечноиерсиниозным растворимым и корпускулярными антигенами, а также условия селективного отбора гибридных клеток, существенно увеличивающий эффективность слияния лимфоцитов и количество специфических антителопродуцирующих гибридом.

5. Установлено, что при слиянии сингенных миеломных клеток с иммунными спленоцитами линейных мышей, примированных корпускулярным антигеном определенного серовара кишечноиерсиниозных бактерий, образуются клоны гибридом, секретирующие моноклональные антитела как к гомологичному, так и к некоторым другим серовариантам Y. enterocolitica, значительно упрощая тем самым процедуру получения набора серовароспецифических моноклональных антител.

6. С помощью моноклональных антител в иммуноферментном анализе и иммуноблотгинге получены новые данные, свидетельствующие о том, что серовароспецифичность может определяться не только углеводными компонентами микробной клетки, но и антигенными детерминантами белковой и гликопептидной природы.

7. Показано, что кишечноиерсиниозные видоспецифические моноклональные антитела взаимодействуют с термостабильным полипептидом Y. enterocolitica, молекулярная масса которого определяется сероваром бактерий, а его экспрессия не зависит от температуры культивирования и наличия плазмиды pCad.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Кишечный иерсиниоз характеризуется сложным и разнообразным симптомокомплексом, в результате чего затруднена его дифференциация от других инфекций и постановка точного клинического диагноза [123, 163, 193, 220, 231]. Из-за длительности выделения возбудителя снижена также эффективность бактериологических методов исследования [19, 69, 92, 121, 128]. Наряду с бактериологическими применяются серологические методы диагностики с использованием адсорбированных сывороток [16, 19, 27, 28, 58, 110, 111]. Последние гетерогенны по своему составу и их трудно стандартизировать. Ввиду тесного антигенного родства Y. enterocolitica с другими микроорганизмами [58, 101, 122, 123] результаты серологических исследований не всегда отличаются строгой специфичностью. Все это является основанием для совершенствования имеющихся средств и методов диагностики кишечноиерсиниозной инфекции, в том числе, разработки новых специфичных иммунодиагностических препаратов.

Одним из эффективных научных направлений, связанных с разработкой моноспецифических иммуноглобулиновых тест-систем для диагностики инфекционных болезней, является целенаправленное создание гибридом, продуцирующих МКА со специфичностью к конкретным структурным компонентам патогенных микроорганизмов [181, 182]. Комплексные препараты МКА в высоких титрах используются для изготовления высокочувствительных, точных, простых в применении и скоростных в осуществлении диагностических наборов [2, 70, 71, 80, ИЗ, 149, 165, 214, 215]. Кроме того, МКА в настоящее время становятся незаменимым инструментом для тонкой характеристики антигенной структуры микроорганизмов и количественного анализа антигенов [94, 112, 145, 155−157, 183, 235, 236]. Использование МКА для идентификации специфических иммунодоминантных структур микроорганизмов является одним из перспективных направлений в микробиологии и иммунохимии.

В этой связи основной задачей исследования было получение гибридом-продуцентов МКА к возбудителю кишечного иерсиниоза, изучение их свойств и разработка на их основе экспериментальных моноклональных диагностических иммуноферментных тест-систем.

Для получения гибридом, синтезирующих специфические антитела, были использованы сингенные плазмоцитомы Sp2/0-Ag.8, Sp2/0-Ag.l4 и В-лимфоциты (спленоциты) мышей инбредной линии BALB/c, иммунизированных как убитыми цельными клетками Y. enterocolitica 03 и 09 сероваров (корпускулярными антигенами), так и водорастворимым БПК, выделенным из биомассы Y. enterocolitica 03 серовара Н. В. Сладковой [97] методом уксуснокислого гидролиза по Р.В. White [238] в модификации Е. Э. Бахрах с соавт. [7].

БПК был взят для работы в связи с тем, что он обладал видовой специфичностью [97−99] при постановке внутрикожных аллергических проб на морских свинках, зараженных патогенными иерсиниями. При проверке специфической иммунореактивности данного антигенного комплекса в ТИФА нами было установлено, что в сыворотке крови мышей, иммунизированных БПК и микробными клетками Y. enterocolitica 03 серовара содержатся антитела к БПК в одинаковом титре — 1/25 000- в сыворотке крови мышей, иммунизированных клетками других сероваров Y. enterocolitica — в титрах от 1/1600 до 1/6400- в коммерческих некишечноиерсиниозных сыворотках — в титрах до 1/512, в сыворотках людей больных ОКЗ — в титрах от 1/800 до 1/25 600 в зависимости от нозологической формы. Полученные результаты свидетельствовали о присутствии в БПК Y. enterocolitica неспецифичеких эпитопов, реагирующих в ТИФА с гетерогенными антителами, несмотря на отсутствие пререкрестных реакций в аллерготестах [97−99]. Тем не менее, разная степень сероконверсии гомои гетерологичных сывороток указывала также на наличие в составе БПК специфических антигенных детерминант, получение антител к которым возможно с помощью гибридомной технологии.

Для стимуляции пролиферативной активности иммунокомпетентных клеток, выступающих в качестве партнеров при гибридизации, варьировали различные иммунизирующие дозы, способы введения антигенов, схемы прививок. В результате установлено, что небольшие дозы БПК (2,5−5 мкг) и цельноклеточных антигенов (2 • 104 — 3,2 • 105 м.к.) приводили к выработке антител в титрах 1/800.

1/1600 и 1/200 — 1/12 800 соответственно. Большие дозы (100−300 мкг) также способствовали выработке антител в относительно невысоких титрах (1/1600 -1/3200), что можно объяснить известным по литературным данным феноменом иммунологической толерантности [91, 106]. Наиболее высокие титры антител зарегистрированы при в/б иммунизации мышей 25−40 мкг БПК с последующей 5-ти — 6-ти кратной прививкой в дозах 40−50 мкг (1/20 480 — 1/25 600) и при иммунизации п микробными клетками в дозах (1 • 10° - 5 • 10') м.к. (1/5120 — 1/25 600). При в/в инъекции титры антител колебались в пределах от 1/1600 до 1/4525. Применение ПАФ не играло существенной роли в стимуляции антительного ответа. Возможно, это связано с тем, что использованный для иммунизации антиген обладал собственной адъювантной активностью за счет присутствия в нем углеводного компонента. При введении животным штаммов кишечноиерсиниозных бактерий, выращенных при температуре 37 °C, титры антител в сыворотке крови оказались выше, чем при иммунизации штаммами, выращенными при 28 °C.

Была также изучена сравнительная эффективность использования для гибридизации в качестве партнеров двух линий миеломных клеток Sp2/0-Ag.l4 и Sp2/0-Ag.8. Однако, выбор клеточной линии не влиял, существенным образом на интенсивность образования гибридом.

Известно, что эффективность гибридизации зависит от состава среды, используемой для селекции гибридных клеток сразу после слияния и, в частности, от концентрации селективного агента, подавляющего рост неслившихся миеломных клеток [112]. Нами установлено, что внесение ингибирующего агентаHAT в рекомендуемой для селекции концентрации 2% подавляет рост не только миеломных, но и гибридных клеток. Это согласуется со сведениями о цитотоксичности аминоптерина, входящего в состав HAT, на гибридные клетки [49, 94, 112]. По данным В. А. Федоровой [112] добавление HAT на 2−3 сут после слияния повышает эффективность гибридизации. Нам также удалось добиться 100% эффективности гибридизации при добавлении HAT на 2−3 сут после слияния, при этом количество гибридом, продуцирующих специфические антитела составило (5 ± 2) %. При культивировании гибридом на среде с 1% HAT число гибридных клеток — продуцентов специфических МКА повысилось до (23 ± 0,3) %.

При иммунизации мышей клетками Y. enterocolitica 09 серовара и последующей гибридизации мышиных В-лимфоцитов получены гибридные клетки, продуцирующие МКА к Y. enterocolitica 09 серовара. Прививка мышам БПК Y. enterocolitica 03 серовара приводила к образованию гибридом, синтезирующих МКА к общим для 03 и 09 сероваров детерминантам (1C10.i), а также видо- (7C7.i) и родоспецифические МКА (8G7.i). При гибридизации спленоцитов мышей, иммунизированных клетками Y. enterocolitica 03 серовара, с миеломными клетками получены клоны гибридом, продуцирующие МКА к Y. enterocolitica 03- 04,32- 05,27- 06,30 сероваров. В последнем случае иммунные спленоциты, использованные в качестве партнеров для гибридизации, должны были синтезировать антитела к эпитопам, специфическим только для 03 серовара кишечноиерсиниозных бактерий. По результатам же скрининга гибридом и определения специфической активности МКА были получены гибридные клерки, синтезирующие антитела к другим сероварам Y. enterocolitica. На основании полученных данных, а также с учетом результатов исследований JI.M. Михайлова [70], Ж. Г. Самелия [94] и В. А. Федоровой с соавт. [113, 157] можно предположить, что понятие «серовароспецифические» антигены или антигенные детерминанты, широко распространенное в микробиологии, не совсем правомерно. Скорее следует вести речь о большей или меньшей степени экспрессии отдельных эпитопов, которые определяют серовароспецифичность конкретных микроорганизмов, в частности, Y. enterocolitica и Y. pseudotuberculosis при использовании поливалентных (в том числе адсорбированных) сывороток. Отсутствие перекрестной реактивности в низких титрах МКА с кишечноиерсиниозными бактериями 07,8- 08- 013,7- 019,8 сероваров, которые отнесены к так называемой «американской группе» [190], не противоречит изложенному выше предположению, свидетельствуя об очень незначительной экспрессии характерных для них детерминант, а не об их отсутствии у Y. enterocolitica 03, что закономерно, если учесть, что они генетически и эволюционно отдалены от сероваров «европейской группы» [148]. Вполне вероятно, что расширение набора антителопродуцирующих гибридом позволит выделить МКА, обладающих высокой специфической активностью, и к представителям кишечноиерсиниозных бактерий «американской группы». Предположение о большей или меньшей степени выраженности «серовароспецифических» антигенных детерминант, а не об их наличии или отсутствии у соответствующих штаммов микроорганизмов стало возможным только при использовании гибридомной биотехнологии моноклональных антител, принципиально отличающейся от традиционного способа получения гипериммунных поликлональных диагностических сывороток.

В общей сложности в результате гибридизации, клонирования и реклонирования было отобрано 12 гибридом, продуцирующих специфические МКА к различным серовариантам возбудителя кишечного иерсиниоза: 1 клон к 03 и 09 сероварам, 3 клона — к 03 серовару, по 2 клона — к 09- 04,32- 06,30 сероварам, по 1 клону — к 05 и 05,27 сероварам и 1 клон, синтезирующий видоспецифйческие МКА (7С 7.]). Установлено, что отобранные клоны гибридом сохраняли антителопродуцируюшую активность при культивировании in vitro на протяжении 6-ти месяцев (срок наблюдения), при этом титр антител в культуральной жидкости составил от 1/160 до 1/320. При пассировании гибридом in vivo на протяжении 6-ти — 7-ми пассажей (срок наблюдения) снижались сроки асцитообразования с 13−16 до 8−9 дней, увеличивался объем асцитической жидкости с 2−3 до 5−9 мл (максимально f 7.

12 мл). Концентрация клеток в асците составила (8−10 — 1,6 • 10) кл./мл. Увеличение количества асцитической жидкости, вероятно, связано с адаптацией гибридных клеток к условиям пролиферации в организме мыши. Повышалась также активность асцитической жидкости. Если после I пассажа титр антител был равен 1/12 800 — 1/102 400, то после VI пассажа — 1/51 200 — 1/204 800.

Для выделения из культуральной и асцитической жидкостей моноклональных иммуноглобулинов использовали наиболее распространенный и простой способ осаждения сульфатом аммония. В культуральной жидкости при выращивании гибридом in vitro содержание Ig составило (0,24 — 0,6) мг/мл. В иммуноасцитической жидкости концентрация Ig была от 3,18 мг/мл до 17,48 мг/мл.

Специфичность выделенных Ig была изучена на 35 штаммах Y. enterocolitica 31-го серовара, 6 штаммах Y. pseudotuberculosis 6-ти сероваров, 5 штаммах Y. pestis и 15 штаммах энтеробактерий (Е. coli, Salmonella sp., Shigella sp.). Титр специфической активности МКА в ТИФА с гомологичными сероварами составил от 1/256 000 до 1/1 024 000, с другими сероварами — 1/125 — 1/500. При разведении МКА 1/1000 они взаимодействовали только с бактериями гомологичного серовара.

Y. enterocolitica. Специфическое взаимодействие МКА наблюдалось при минимальной концентрации Ig от 0,01 мкг/мл до 0,1 мкг/мл.

В связи с тем, что МКА ряда клонов гибридом имели одинаковую специфичность был проведен эпитопный анализ. В результате установлено, что МКА 3 клонов к 03 серовару, 2 клонов — к 09, 2 клонов — к 04,32 были направлены к разным эпитопам, МКА 2 клонов к 05 и 05,27 сероварам выявляли 2 разных эпитопа у 05 и 05,27 сероваров соответственно, а МКА 2 клонов к 06,30 серовару взаимодействовали с одним эпитопом.

Как известно, сероваропринадлежность штаммов Y. enterocolitica устанавливается по реакции с типовыми О-специфическими сыворотками, полученными к соответствующим кипяченым О-антигенам и структурно обусловлена О-специфическими цепями ЛПС (О-антигена) углеводной природы [46, 51, 106, 113, 114]. Однако в последние годы получены специфические кишечноиерсиниозные МКА, взаимодействующие как с углеводными компонентами ЛПС [2, 30, 145, 169, 170, 221, 227, 230, 236], так и с белками Y. enterocolitica [163, 164, 176, 183, 192, 219, 228, 230, 235, 242]. Для установления природы специфических антигенов, к которым направлены МКА, клеточные лизаты бактерий подвергали протеолитической обработке протеиназой К в течение 3 ч при 60 °C. При этом разрушались белковые молекулы бактериальной клетки и сохранялись углеводные компоненты. Установлено, что до протеолиза все МКА реагировали с лизатами штаммов Y. enterocolitica в титрах 1/51 200 — 1/102 400. После протеолитической обработки образцов большинство МКА не взаимодействовали с ними, что указывало на паратопную специфичность к белковым молекулам.

Иммунохимические свойства МКА изучались методом иммуноблотгинга. Установлено, что МКА 1Сюл выявляли общий антиген гликопептидной природы с м.м. (17 ± 2) кДа у 03 и 09 сероваров. Это согласуется с данными Е. Wachter et al. [230] о направленности МКА 03+09 к полисахариду кора ЛПС. Действительно, по данным И .Я. Захаровой с соавт. [45] в препаратах, полученных уксуснокислым гидролизом по Р.В. White [238], к которым относится и БПК, содержатся О-специфические боковые цепи деградированного полисахарида и базисный полисахарид (кор).

МКА 1G4 j выявляли белок с м.м. (86 + 2) кДа Y. enterocolitica 03 и углеводный компонент м.м. 18−30 кДа того же серовараМКА Ю72 — белки с м.м. (38 + 2) и (14 ± 2) кДа Y. enterocolitica 03, МКА 6Е7.3 — белок с м.м. (62 + 2) кДа Y. enterocolitica 03 серовара. МКА 1Вю.1 реагировали с белками м.м. (40 + 2) и (16 + 2) кДа Y. enterocolitica 09- МКА 5Gg.2 взаимодействовали как с белковой молекулой м.м. (88 ± 2) кДа, так и с углеводным компонентом м.м. 18−25 кДа Y. enterocolitica 09 серовара. МКА 2F4.1 были направлены к эпитопам белковой природы м. м (80 + 2) и (14 + 2) кДа Y. enterocolitica 04,32 и к углеводному компоненту м.м. 25−30 кДа того же серовараМКА 6D52 — к белкам с м.м. (40 ± 2) и (80 ± 2) кДа Y. enterocolitica 04,32 и углеводному компоненту м.м. 14−20 кДа того же серовара. МКА 1C2. i взаимодействовали с белками м.м. (40 ± 2) и (18 ± 2) кДа Y. enterocolitica 05 серовараМКА 2С9.2 — с белком м.м. (96 ± 2) кДа Y. enterocolitica 05,27 серовара. МКА ЗСцЛ и ЗСц.2 выявляли один белок с м.м. (40 + 2) кДа у Y. enterocolitica 06,30 серовара.

Данные ПААГ-ДСН показали, что представители рода Yersinia (штаммы Y. pseudotuberculosis II, IV, V, VI сероваров, Y. pestis EV НИИЭГ) имеют белок с м.м. (40 ± 2) кДа, который близок по показателю электрофоретической подвижности белкам с м.м. (38−40 + 2) кДа Y. enterocolitica. Однако ни один из указанных штаммов не взаимодействовал в ТИФА с полученными МКА. МКА 7С7Л, обладающие эпитоп-паратопной специфичностью по отношению к белкам с м.м. (38 ± 2) кДа — (40 + 2) кДа, выявляли белковые полосы у штаммов Y. enterocolitica (включая 07,8- 08- 013,7- 019,8 серовары) и не обнаруживали их у штаммов Y. pseudotuberculosis, Y. pestis EV НИИЭГ, что указывает на наличие у этого белка специфических для Y. enterocolitica эпитопов. Причем детерминанты, узнаваемые МКА 7С7л, присутствовали у большинства сероваров и на белке с м.м. (80 ± 2) кДа. Из проведенных нами исследований следует также, что белок с м.м. (40 ± 2) кДа является сложной в антигенном отношении структурой и содержит как видоспецифические для Y. enterocolitica, так и специфические для отдельных его сероваров эпитопы. Данный белок является термостабильным, его синтез не зависит от температуры культивирования бактерий (22 °С, 37 °С), а также плазмидного состава штаммов.

Для выявления и серотипирования возбудителя кишечного иерсиниоза обычно используются агглютинирующие сыворотки [16, 19, 23, 24, 27, 28, 58, 110, 111], или эритроцитарные [13, 21, 34, 54−56, 68, 76−78, 90, 97, 127, 128, 130], латексные [34, 121], коагглютинирующие [12, 29, 50, 53, 79, 95] диагностикумы, полученные к отдельным его сероварам. Иммуноферментные тест-системы на основе видои серовароспецифических кишечноиерсиниозных моноклональных антител в настоящее время отсутствуют, хотя являются наиболее перспективными современными иммунодиагностическими препаратами благодаря сочетанию высокой чувствительности иммуноферментного анализа и специфичности моноклональных иммуноглобулинов. В связи с этим нами были разработаны два варианта экспериментальных моноклональных тест-систем для обнаружения, идентификации и серотипирования кишечноиерсиниозных бактерий в ТИФА и ДИА.

При разработке экспериментальных иммуноферментных тест-систем были использованы МКА к К enterocolitica ОЗ (6Е7.3), 04,32 (2F4 I), 05,27 (2С92) сероваров, МКА к двум сероварам Y. enterocolitica (03+09) и видоспецифические МКА (7С71). Серовароспецифические МКА конъюгировали с пероксидазой хрена методом периодатного окисления по К.Р. Nakane and A. Kawaoi [200]. Активностьi fc меченных МКА в «сэндвич"-варианте ТИФА составила 1/6400 — 1/25 600 со штаммами гомологичных сероваров. Специфическая активность видоспецифических МКА составила 1/1600 — 1/12 800 со штаммами Y. enterocolitica и 1/50 — 1/100 с другими патогенными иерсиниями. С гетерогенными микроорганизмами указанные МКА не взаимодействовали. Специфичность разработанных на основе МКА экспериментальных иммуноферментных тест-систем для идентификации и серотипирования штаммов Y. enterocolitica изучали на наборе из 61 штаммов микроорганизмов ГКПБ «Микроб», бруцеллезной и туляремийной вакцин. В результате исследований было установлено, что иммуноферментные тест-системы обладали строгой специфичностью. Чувствительность экспериментальных тест-систем в ТИФА с чистыми культурами Y. enterocolitica составила (3,1 • 104 — 2,3 • 105) м.к./мл. Экспериментальные тест-системы оказались достаточно эффективными при определении Y. enterocolitica в материале, искусственно контаминированном посторонней микрофлорой. При этом бактериальные клетки Y. enterocolitica выявлялись в концентрации (6,2 • 104 -1,2 • 105) м.к./мл. Полученные результаты позволили сделать заключение о возможности их использования не только для идентификации чистых культур, но и индикации в образцах, содержащих примеси других микроорганизмов.

Были также разработаны экспериментальные иммуноферментные тест-системы для ДИА, который имеет ряд преимуществ перед ТИФА, заключающихся в простоте технического исполнения, экономичном расходовании ингредиентов реакции и исследуемого материала, экспрессности и документированное&tradeанализа. При определении активности МКА в ДИА с гомологичными сероварами она оказалась ниже, чем в ТИФА и соответствовала титрам 1/250 — 1/1000. Специфичность указанных тест-систем была изучена на наборе из 61 штаммов гомои гетерогенных микроорганизмов, бруцеллезной и туляремийной вакцин. Результаты в ДИА полностью совпали с полученными ранее данными о специфичности экспериментальных тест-систем в ТИФА, подтвердив, таким образом, соответствие разработанного дот-варианта требованиям, предъявляемым по этому показателю к диагностическим препаратам. Особое внимание было уделено способу фиксации бактерий на нитроцеллюлозной мембране, которую проводили при 110 °C в течение 10 мин или 96° этанолом 20 мин. Отмечено, что при фиксации образцов при 110 °C чувствительность тест-систем несколько выше и составила (7,8 • 103 — 1,2 • 105) м.к./мл, чем при фиксации спиртом ((1,6 • 10 -2,5 ¦ 105) мгк./мл). Однако, применение способа фиксации бактериальных взвесей на мембране 96° спиртом в течение 20 мин более предпочтительно, так как не требует специального оборудования и сочетает процессы фиксации и обеззараживания. Последнее особенно важно, поскольку позволяет использовать ДИА для исследования условно-заразного или заразного материала с соблюдением правил биологической безопасности в соответствии с требованиями СП 1.3.1285−03 [8]. Это же преимущество свидетельствует в пользу применения в практике ДИА в сравнении с ТИФА.

Заключительным этапом явилась апробация разработанных нами экспериментальных иммуноферментных моноклональных тест-систем, предназначенных для идентификации и серотипирования кишечноиерсиниозных бактерий, на 20-ти штаммах Y. enterocolitica, выделенных в период 1999;2001 гг. на территории России и Франции от больных людей и из объектов внешней среды и 14-ти штаммах Y. pseudotuberculosis, любезно предоставленных проф. Г. Я. Ценевой. Серотипирование кишечноиерсиниозных бактерий проводилось с помощью диагностической тест-системы сконструированной на основе полученных нами серовароспецифических МКА. Была подтверждена принадлежность штаммов к 03- 09- 04,32- 05,27- 06,30 сероварам. Лабораторные испытания показали, что плашечная и точечная иммуноферментные тест-системы выявляют серовары Y. enterocolitica строго соответствующие паспортным данным независимо от плазмидного состава, места, времени и источника их выделения и не обнаруживают штаммы Y. pseudotuberculosis.

Таким образом, в результате проведенных исследований получен набор стабильных линий гибридом, продуцирующих видои серовароспецифические кишечноиерсиниозные МКА. Полученная нами панель МКА может быть использована для конструирования не только иммуноферментных тест-систем, но и других диагностических иммуноглобулиновых препаратовиммунофлуоресцентных, коагглютинирующих, латексных, эритроцитарных и т. д. Кроме этого, МКА весьма перспективны при разработке конкурентных методов ТИФА для обнаружения в сыворотке крови больных и пререболевших кишечным иерсиниозом людей специфических антител с целью ретроспективной диагностики этой инфекции.