Структурно-функциональная организация района инициации трансляции в мРНК эукариотических генов

Знание сигналов трансляционного контроля необходимо для изучения молекулярных механизмов регуляции экспрессии генов и предсказания паттернов их экспрессии, что определяет фундаментальную значимость этой проблематики. Поскольку в эукариотических системах контроль эффективности трансляции мРНК в большинстве случаев происходит на стадии инициации, особый интерес представляет изучение 5'-нетранслируемого района мРНК (5'-НТП) и сигнала инициации трансляции. В клетках эукариот 40S субъединицы рибосом связываются с кепом на 5'-конце мРНК и движутся вдоль матрицы в поиске стартового кодона (механизм «линейного сканирования», в качестве сенсора используется антикодон метиониновой тРНКнекоторые мРНК могут содержать сайты внутренней инициации трансляции (IRES) и 40S субъединицы рибосомы могут связываться с участками внутри 5'-НТП или в непосредственной близости от стартового кодона) (Jackson et al., 2010). Было известно, что эффективность инициации трансляции эукариотических мРНК варьирует в широких пределах и вероятность распознавания триплета AUG в качестве стартового кодона трансляции может зависеть от его нуклеотидного окружения (контекста) (Kozak, 1986), однако механизмы, лежащие в основе этих феноменов, оставались неясными. Долгое время существовали модели структурно-функциональной организации эукариотических мРНК, согласно которым 5'-НТО представляла собой служебный участок (спейсер для посадки факторов инициации трансляции и рибосомы), а сигнал инициации трансляции состоял собственно из стартового кодона AUG, расположенного в определенном контексте. Эти упрощенные представления использовали в качестве базовых при предсказании границ белок-кодирующих последовательностей мРНК генов эукариот. Однако, существовали экспериментальные данные, которые нельзя было объяснить таким образом. В отдельных работах было показано, что мРНК могут характеризоваться более сложной организацией: в частности, в составе сигнала инициации трансляции может быть несколько стартовых кодонов (в том числе, и отличных от AUG) и элементы вторичной структуры, а вклад альтернативной трансляции в кодирующий потенциал эукариотических генов существенным образом недооценен. Таким образом, исследования в этом направлении были необходимы для выяснения базовых аспектов организации генов эукариот, что определяло их актуальность.

Цель настоящей работы заключалась в изучении структурно-функциональной организации сигнала инициации трансляции в мРНК эукариотических генов.

Задачи работы включали:

1. Выявление характеристик 5'-НТП мРНК, связанных с их функцией в процессе инициации трансляции в клетках эукариотических организмов.

2. Изучение организации сигнала инициации трансляции в эукариотических мРНК, включающее: а) оценку возможности использования нескольких сайтов инициации трансляцииб) анализ роли дополнительных характеристик РНК (элементов вторичной структуры и нуклеотидного контекста стартового кодона) в распознавании сайтов инициации трансляции;

3. Оценка вклада альтернативной трансляции в кодирующий потенциал мРНК и протеом эукариотических клеток.

Научная новизна. Обнаружено, что 5'-НТП эукариотических мРНК обладают район-специфическими характеристиками, приводящими к отсутствию стабильной вторичной структуры и, как следствие, способствующими эффективной инициации трансляции (дисбаланс в содержании комплементарных нуклеотидов G/C и A/U). Впервые показано, что мРНК эукариотических генов, экспрессирующихся на высоком уровне, оптимизированы для поддержания высокого уровня трансляционной активности по многим характеристикам (контекст стартового кодона трансляции, контекст терминатора трансляции, размер и особенности нуклеотидного состава 5'-НТП, отсутствие лидерных рамок считывания). Разработан первый способ предсказания трансляционной активности мРНК в клетках млекопитающих, двудольных и однодольных растений по структуре 5'-нетранслируемого района.

Найдено, что некоторые мРНК дрожжей и млекопитающих могут содержать элементы вторичной структуры, локализованные в определенной позиции белок-кодирующей последовательности и способные увеличивать эффективность распознавания стартовых кодонов трансляции в субоптимальном контексте. Разработан информационный ресурс, позволяющий предсказывать наличие «компенсаторной» вторичной структуры в молекуле мРНК. Показано, что характеристика «размер поверхности молекулы, доступной для взаимодействия» (accessible source area, ASA) для участков молекулы РНК контекстно-зависима, при этом кодоны AUG и UGA характеризуются высокими значениями ASA, что могло служить одной из причин выбора именно этих кодонов в качестве сайтов инициации и терминации трансляции на ранних этапах эволюции жизни.

Уточнена структура контекста стартового ко дона трансляции в мРНК млекопитающих: обнаружено, что аминокислотные остатки во второй позиции полипептидов человека и мыши могут влиять на эффективность инициации трансляции.

Впервые показано, что в структуре эукариотических мРНК с высокой частотой могут содержаться альтернативные стартовые кодоны трансляции. Продемонстрировано, что М-концевые трансляционные изоформы белков млекопитающих, растений и дрожжей часто различаются по предсказанной субклеточной локализации, что может быть связано с их функциональной значимостью. Сделана оценка возможности альтернативной терминации трансляции в клетках арабидопсиса и риса: найдено, что вклад этого механизма в синтез трансляционных изоформ белков в сравнении с альтернативной инициацией трансляции значительно менее выражен.

Положения, выносимые на защиту.

1. Базовые контекстные характеристики нуклеотидных последовательностей 5'-НТП мРНК генов эукариот эволюционно адаптированы для эффективного взаимодействия с аппаратом трансляции.

2. Эффективность распознавания стартового кодона трансляции может модулироваться факультативными сигналами, к которым относятся элементы стабильной вторичной структуры РНК и определенные комбинации нуклеотидов в позициях 5'-контекста сайта инициации трансляции и аминокислотных остатков во второй позиции соответствующих полипептидов.

3. Эукариотический сигнал инициации трансляции с высокой частотой содержит альтернативные стартовые кодоны. Альтернативная инициация трансляции вносит значительный вклад в протеом эукариотических клеток.

Теоретическая значимость работы. Разработана расширенная модель структурно-функциональной организации эукариотического сигнала инициации трансляции, включающего факультативные элементы — модуляторы эффективности распознавания стартовых кодонов. Уточнены представления о значимости контекстной организации 5'-НТП эукариотических мРНК: предложена гипотеза о существовании «распределенных» сигналов — элементов контекста, вклад каждого из которых в функциональную активность 5'-НТП относительно мал и может быть значим для высокоэкспрессирующихся генов.

Научно-практическая значимость работы. В работе получены данные, корректирующие методы предсказания эффективности трансляции и кодирующего потенциала эукариотических мРНК. Разработаны оригинальные методы (Ьеас1ег1ША, А1ГС11а1грт) и база данных (ТЯБЮ), которые могут использоваться для предсказания характеристик мРНК и для дизайна генетических конструкций для проведения экспериментов в областях генетики и биотехнологии растений и животных.

Апробация работы. Результаты работы были доложены или представлены на II Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», (Москва, 2003), III съезде ВОГИС (Москва, 2004), International Conference of Bioinformatics of Genome Regulation & Structure (Новосибирск 1998, 2000, 2002, 2004, 2006, 2008, 2010, 2012), International Moscow Conference on Computational Molecular Biology (Москва 2003, 2005, 2007, 2009, 2011), Genome Informatics Conference (Токио, 2001; Йокогама 2004; 2005), 8th International Engelhardt Conference on Mollecular Biology «RNA-protein interactions» (Москва, 2006), Conference on Translational Control and Non-coding RNA (Nove Hrad, Чехия 2006), German-Russian Forum Biotechnology (Новосибирск, 2009), International Conference on Plant Genetics, Genomics and Biotechnology (Новосибирск, 2010), Joint Russian-French Seminar «Genomics, Proteomics, Bioinformatics» (Новосибирск, 2010), Joint Indo-Russian Workshop «Predictive Biology using Systems and Integrative Analysis and Methods» (Индия, 2010), German/Russian Workshop on Integrative Biological Pathway Analysis and Simulation (Германия, 2009, 2010, 2011,2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 96 научных работ, из них статей — 31, в том числе в зарубежной печати — 18. Основные результаты получены автором самостоятельно. Ряд исследований выполнен с участием М. П. Пономаренко, И. Б. Рогозина, И. И. Титова, Н. А. Колчанова, JI.JI. Киселева, Д. Г. Воробьева, А. Г. Пальянова, О. А. Волковой, Г. А. Базыкина, В. А. Иванисенко, В. Н. Бабенко, A. Sarai, I. Ventoso, S. Ahmad.

выводы.

Выявлены характеристики нуклеотидных последовательностей 5'-НТП мРНК эукариотических генов, способствующие их функциональной активности в процессе инициации трансляции. Показано, что лидерные районы мРНК генов высокого уровня экспрессии адаптированы для поддержания высокой трансляционной активности (небольшой размер, дисбаланс в содержании комплементарных нуклеотидов, оптимальный контекст стартового кодона, отсутствие (или слабый контекст) uAUG и т. п.). Разработан первый метод предсказания трансляционной активности мРНК растений и млекопитающих на основе анализа контекстных характеристик их 5'-НТП (LeaderRNA).

2. Показано, что в некоторых мРНК млекопитающих и дрожжей эффективность распознавания стартового кодона в субоптимальном контексте может усиливаться с помощью элементов вторичной структуры («компенсаторных шпилек»), расположенных в определенном участке белок-кодирующей последовательности. Разработан Интернет-ресурс (AUGhairpin), позволяющий предсказывать такие структуры.

3. Найдено, что в структуре молекул РНК доступность участков молекул для взаимодействия (accessible source area) контекстно-зависима, при этом высокими значениями этого параметра характеризуются триплеты AUG и UGA. Выдвинуто предположение о том, что физико-химические характеристики могли быть одной из причин выбора именно этих комбинаций нуклеотидов в качестве сайтов инициации и терминации трансляции на ранних этапах эволюции жизни.

4. Уточнены характеристики нуклеотидного контекста стартового кодона трансляции в эукариотических мРНК. Показано наличие устойчивых вариантов оптимального контекста (AnnAUGn, GnnAUGG), а также взаимосвязь между некоторыми вариантами нуклеотидного контекста и присутствием определенных аминокислотных остатков во второй позиции полипептида. По-видимому, такие комбинации влияют на эффективность формирования первой пептидной связи, что и определяет их функциональную значимость.

5. Обнаружено, что в структуре эукариотического сигнала инициации трансляции с высокой частотой (20% - 40% транскриптома у разных видов) содержатся альтернативные стартовые кодоны, с которых может начинаться дополнительный синтез N-концевых изоформ аннотированных белков или не связанных с ними пептидов. Согласно полученным данным, вклад этого механизма в кодирующий потенциал эукариотических генов и клеточный протеом в очень существенной степени недооценен. Предсказаны трансляционные изоформы белков дрожжей, растений и млекопитающих.

6. Показано, что контекстная организация некоторых мРНК растений может способствовать терминации на альтернативных стоп-кодонах. Согласно полученным.

184 данным, вклад альтернативной терминации трансляции и дополнительного синтеза С-концевых изоформ белков в протеом намного меньше, чем при использовании сайтов альтернативной инициации трансляции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В рамках диссертационной работы было показано, что характеристики 5'-НТП в ходе эволюции были адаптированы для поддержания определенного уровня трансляционной активности мРНК эукариот. Эта адаптация может происходить на разных уровнях и ее можно также рассматривать в рамках модели «лимитирующего звена» (Ратнер, 1990): повышение эффективности функционирования лидерного района происходит при элиминации параметров, наиболее сильно затрудняющих посадку 40S субъединиц рибосом на 5'-конец матрицы, их движение вдоль РНК в 3'-направлении (линейное сканирование), распознавание стартового кодона и переход к собственно элонгации трансляции. Эти процессы осуществляются последовательно и для увеличения конечной интенсивности инициации трансляции также необходима оптимизация на всех этапах. В рамках работы удалось показать, что для достижения высокой эффективности экспрессии гена важным является не только удаление явно выраженных негативных характеристик 5'-НТП (uORF, стабильная вторичная структура), но и тонкая настройка контекстной организации нуклеотидной последовательности (отклонения в частотах монои динуклеотидов). Кроме этого, было показано, что сигнал инициации трансляции в эукариотических мРНК помимо облигатного элемента (стартового кодона трансляции в подходящем контексте) может включать ряд факультативных элементов, в качестве которых были описаны альтернативные сайты инициации трансляции, специфически позиционированные стебле-петлевые структуры и определенные комбинации нуклеотидов в окружении AUG и аминокислотных остатков во второй позиции полипептида.

В рамках диссертационной работы были получены данные, свидетельствующие о разнообразии молекулярных механизмов, определяющих выбор сайтов инициации трансляции и эффективность их работы в клетках эукариот. Возможность использования факультативных сигналов (элементы вторичной структуры, минорные элементы контекста, а также «запасные» стартовые кодоны, дающие начало изо функциональным вариантам белка) можно рассматривать в качестве механизмов, увеличивающих устойчивость системы к мутациям (т.е., увеличивающие «помехоустойчивость» молекулярно-генетических систем управления (МГСУ, Ратнер, 1975; 1983)). Действительно, эти механизмы расширяют спектр существующих у клетки возможностей: например, мутация в контексте стартового кодона, снижающая эффективность его работы и приводящая к (вредному) снижению уровня наработки белка, может быть компенсирована как в результате обратной мутации в той же позиции, так и при мутациях в некоторых других позициях контекста (раздел 3.4.4), при появлении «компенсаторной» шпильки (раздел 3.4.1) или при использовании близкорасположенного альтернативного стартового кодона (раздел 3.3). Последствия применения этих разных по сути механизмов для компенсации мутаций могут быть функционально равнозначны: восстанавливается нужный уровень синтеза белка. Кроме этого, возможность применения нескольких различных сигналов в структуре мРНК для контроля инициации трансляции существенно расширяет имеющиеся возможности его функциональной оптимизации (тонкой настройки эффективности в ходе эволюции). С другой стороны, тот факт, что в эукариотических мРНК часто встречаются альтернативные сайты инициации трансляции, также может иметь определенную трактовку в рамках концепции МГСУ, согласно которой гены должны быть «динамически стабильны» (Ратнер, 1983, с. 241). Для успешной эволюции у организма должна быть возможность перебора и оценки вариантов (новых паттернов экспрессии генов, новых форм белков и т. п.). Наилучшим образом это может происходить тогда, когда одновременно присутствуют и исходная, и мутантная форма белка, то есть целостность МГСУ не нарушена. Если новые варианты белка имеют преимущество перед исходной формой, в ходе эволюции может произойти ее замещение. Было показано, что альтернативная инициация трансляции может расширять кодирующий потенциал мРНК таким образом, что с одной матрицы могут считываться собственно аннотированный белок, его N-концевые изоформы (с ближайших к 5'-концу AUG за счет механизма «сканирование с подтеканием», с удаленных сайтов — за счет механизма реинициации трансляции), а также небольшие белки и пептиды, кодируемые рамками считывания за пределами белок-кодирующей части или внутри БКП (в других рамках считывания) (раздел 3.3). Таким образом, у клетки есть возможность синтеза большого количества изоформ существующих белков и не связанных с ними новых полипептидов при сохранении трансляции основной рамки считывания, что позволяет оценивать их функциональные свойства и — в ходе эволюции — отбирать новые варианты, повышающие ее приспособленность.

Обобщая представленные в работе данные, можно сделать следующее заключение: организация эукариотических мРНК в 5'-НТП и районе сигнала инициации трансляции важна для контроля паттерна экспрессии гена в целом, а также может использоваться для существенного расширения спектра кодируемых этим геном полипептидов. Вклад таких «альтернативных» рамок считывания в очень значительной степени недооценен и исследования в этом направлении в ближайшем будущем приведут к пересмотру состава протеома эукариотических клеток.