Исследование роли глутатиона в ответе Escherichia coli на действие различных оксидантов

Актуальность проблемы. Образование активных форм кислорода (АФК) в процессе нормального аэробного метаболизма клеток всех типов и широкий спектр физиологических эффектов АФК объясняют неослабевающий интерес к всестороннему изучению их действия на живые организмы. Источниками АФК могут быть также химические вещества. Встреча внутри организма хозяина с макрофагами — еще одна ситуация, в которой бактерии подвергаются воздействию активных форм кислорода. Установлено, что АФК оказывают на клетки всех типов токсическое и мутагенное действие, вызывая окислительные повреждения ДНК, белков и мембранных липидов (Farr, Kogoma, 1991).

Бактерии Escherichia coli, как и другие энтеробактерии, обладают несколькими системами защиты от окислительного повреждения, вызываемого действием АФК. Так, в ответ на обработку перекисью водорода у Е. coli индуцируется синтез около 30 белков, включая каталазу-гидропероксидазу HPI, которая является активным деструктором Н2О2 (Christman et al., 1985).

Среди нерешенных вопросов, связанных с ответом бактерий на окислительный стресс, и в частности, на действие Н2О2, остается неясной роль глу-татиона. Глутатион является главным низкомолекулярным тиолом у многих грамотрицательных бактерий, включая Е. coli (Fahey et al., 19/ 6). По сравнению с другими бактериями клетки Е. coli примечательны тем, что имеют уровень общего глутатиона (GSH + GSSG) (около 10 мМ), близкий к тому, который наблюдается в клетках животных (Kosower, Kosower, 1978). Известно, что в клетках животных глутатион является важным компонентом клеточной защиты от окислительного повреждения, вызываемого Н202, и обработка клеток этим оксидантом сопровождается снижением уровня восстановленного глутатиона (GSH) и его окислением (Meister, Anderson, 1983). Для бактерий данные о роли глутатиона в защите от действия АФК менее определенны. Были опубликованы данные о том, что мутанты Е. coli, дефицитные по синтезу глутатиона, проявляют такую же устойчивость к действию Н2О2 и некоторым другим оксидантам, как и клетки родительского типа (Apontoweil, Berends, 1975bOwens, Hartman, 1986). Более того, в некоторых ситуациях такие мутанты проявляли даже большую устойчивость к действию Н202, чем клетки дикого типа (Greenberg, Demple, 1986; Imlay, Linn, 1987; Romero, Canada, 1991). Было обнаружено также, что обработка перекисью водорода не влияет на уровень общего глутатиона у Е. coli (Greenberg, Demple, 1986) или даже приводит к увеличению его уровня (Smirnova, Oktyabrsky, 1994).

В то же время в некоторых случаях было обнаружено, что клетки Е. coli, лишенные каталазы HPI, имеют такую же чувствительность к обработке Н2О2, как и клетки дикого типа (Greenberg, Demple, 1986). Таким образом, сложилась парадоксальная ситуация, при которой для защиты Е. coli от действия Н202 оказывается не нужной ни одна из главных антиоксидантных систем клетки. В то же время было установлено, что двойные мутанты Е. coli, дефицитные по глутатиону и каталазе, оказываются сверхчувствительными к обработке Н2О2 (Alonso-Moraga et al., 1987). В совокупности анализ научной литературы показывает, что данные о роли глутатиона в ответе бактерий Е. coli на окислительный стресс (О.С.) немногочисленны и носят противоречивый характер. Также немногочисленны данные о взаимодействии в клетках двух антиоксидантных систем, каталазы и глутатиона. В этой связи выяснение роли глутатиона во время окислительного стресса и механизмов взаимодействия антиоксидантных систем является актуальной задачей. Определение роли глутатиона в защите бактерий от окислительного стресса способствует более полному пониманию его значения для жизнедеятельности бактерий и позволяет продвинуться в понимании механизмов клеточной защиты от окислительного стресса.

Основная цель настоящего исследования — изучение роли глутатиона в отклике бактерий Е. coli на окислительный стресс, вызванный обработкой растущих клеток различными оксидантами.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие основные задачи:

1. Изучить действие перекиси водорода и генератора 02~ менадиона на такие параметры растущих клеток Е. coli, как удельная скорость роста, внутриклеточные уровни тиолов и калия, а также редокс-статус глутатиона.

2. Сравнить уровень устойчивости клеток Е. coli, дефицитных по синтезу глутатиона и клеток с нормальным уровнем глутатиона к окислительному стрессу, вызванному обработкой бактерий Н202, менадионом, кумен гидро-пероксидом, а также сульфгидрильным реагентом N-этилмалеимидом (NEM).

3. Исследовать влияние каталазы HPI на внутриклеточные уровни тиолов и калия при действии на Н202 и менадиона на клетки Е. coli.

4. Провести сравнительное исследование действия проникающего (Н2О2) и непроникающего (K4[Fe (CN)6]) оксидантов на растущие клетки Е. coli.

Научная новизна и практическое значение. В результате исследований получены данные об изменении удельной скорости роста, уровней калия, белковых и небелковых тиолов в клетках Е. coli при действии Н202. Показано, что обработка растущих клеток Е. coli дикого типа низкими и умеренными дозами Н202 не вызывает значительного снижения уровня непротеиновых тиолов. Обнаружена обратная связь между количеством SH-групп в белках и уровнями низкомолекулярных тиолов (НМТ) и калия при действии низкими и умеренными дозами Н2О2.

Исследовано действие Н202 и менадиона на уровень и редокс-статус глутатиона у Е. coli. Обработка Н202 не влияет на уровень общего глутатиона, в то время как уровень окисленного глутатиона значительно снижается. Обработка клеток Е. coli менадионом вызывает истощение пула общего глутатиона и увеличение содержания окисленного глутатиона. Внутриклеточный ре-докс-статус глутатиона при действии Н2О2 и менадионом изменяется в противоположных направлениях: обработка Н2О2 приводит к повышению редокс-статуса глутатиона, а обработка менадионом к его понижению.

Выявлена взаимосвязь между каталазной активностью и уровнем непротеиновых тиолов. Показано, что в клетках Е. coli, дефицитных по каталазе HPI, обработка Н2О2 приводит к снижению уровней небелковых тиолов и калия.

Показано, что обработка Е. coli феррицианидом калия приводит к снижению уровня внутриклеточных НМТэти изменения уровня НМТ были противоположны тем, которые наблюдали при обработке клеток перекисью водорода.

Выявленные закономерности между изменениями уровней белковых и небелковых тиолов и калия дополняют накопленные к настоящему времени данные о механизме адаптации клеток Е. coli к О. С. Установление редокс-статуса глутатиона во время О.С. не только определяет роль глутатиона как антиоксиданта, но и способствуют более полному пониманию его значения для жизнедеятельности бактерий. Полученные данные о взаимосвязи между активностью каталазы и уровнем НМТ расширяют представления о механизме защиты Е. coli от ОС. и могут быть использованы при создании лекарственных препаратов против патогенных микроорганизмов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Обработка растущих клеток Е. coli дикого типа Н2Ог не влияет на уровень НМТклетки Е. coli, имеющие низкий уровень глутатиона, обладают такой же чувствительностью к действию Н2О2, как и клетки с нормальным уровнем глутатиона.

2. Существует взаимосвязь между каталазной и глутатионовой антиок-сидантными системами: действие Н2О2 на клетки Е. coli, дефицитные по каталазе-гидропероксидазе I (HPI), приводит к падению уровня общего глутатиона, повышению количества GSSG и снижению соотношения GSH: GSSGу штаммов, дефицитных по синтезу глутатиона, заметно возрастает активность каталазы HPI.

3. Каталаза HPI играет доминирующую роль в разложении экзогенной перекиси водорода растущими клетками Е. coli.

4. Роль глутатиона в ответе на обработку растущих клеток Е. coli непроникающим оксидантом феррицианидом отлична от той, которую он играет в ответе на действие проникающего оксиданта Н2О2. Полученные данные свидетельствуют в пользу участия глутатиона в восстановлении феррицианида клетками Е. coli.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на молодежной конференции Уро РАН «Проблемы общей и прикладной экологии» (Екатеринбург, 1996) — Международной конференции «Микробное биоразнообразие: состояние, стратегия сохранения, экологические проблемы» (Пермь, 1996) — II съезде Биохимического общества РАН (Пу-щино, 1997) — Конференции молодых ученых-экологов Уральского региона ¦ «Современные проблемы популяционной, исторической и прикладной экологии» (Екатеринбург, 1998) — Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды ICEP' 98» (Москва, 1998) — Региональной конференции молодых ученых ИЭГМ-ПГУ (Пермь, 1999). По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах печатного текста, иллюстрирована 28 рисунками и 6 таблицамисостоит из введения, обзора литературы, четырех глав экспериментальной части, заключения и выводов.

Список литературы

включает 195 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

выводы.

1. Растущие клетки Е. coli JTG10 с мутацией в гене gshA, приводящей к дефициту по глутатиону, проявляют такую же устойчивость к перекиси водорода, менадиону, кумен гидропероксиду и N-этилмалеимиду, как и клетки родительского типа ABl 157.

2. При действии Н202 на бактерии Е. coli дикого типа в концентрациях, замедляющих рост клеток, не отмечено снижения внутриклеточных уровней низкомолекулярных тиолов и глутатиона. Обработка растущих клеток менадионом приводит к падению уровня общего глутатиона, повышению количества окисленного глутатиона (GSSG) и снижению соотношения GSH: GSSG.

3. Обнаружена взаимосвязь между каталазной и глутатионовой антиоксидантными системами: действие Н202 на клетки Е. coli, дефицитные по каталазе-гидропероксидазе I (HPI), приводит к падению уровня общего глутатиона, повышению количества GSSG и снижению соотношения GSH: GSSGу штаммов, дефицитных по синтезу глутатиона, заметно возрастает активность каталазы HPI. Катал аза HPI играет1 доминирующую роль в защите растущих клеток Е. coli от окислительного стресса, вызванного действием перекиси водорода.

4. Во время первой фазы отклика Е. coli на действие Н202 прослеживается прямая связь между изменениями уровней белковых тиолов и калия и обратная связь между изменениями уровней низкомолекулярных тиолов и калия.

5. Обнаружено повышение устойчивости к менадиону у растущих клеток Е. coli 821, что связано с пониженной активностью НАДФН: менади-он-диафоразы.

6. Роль глутатиона в ответе на обработку растущих клеток Е. coli непроникающим оксидантом (K4[Fe (CN)6] отлична от той, которую он играет в ответе на действие проникающего оксиданта Н202. Полученные данные.

117 свидетельствуют в пользу участия глутатиона в восстановлении ферри-цианида клетками Е. coli.

7. Обработка Е. coli теллуритом калия приводит к снижению уровня внутриклеточного глутатиона, что указывает на возможное участие глутатиона в восстановлении теллурита.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Данные, представленные в этой работе, показывают, что обработка растущих клеток Е. coli Kl 2 2 — 25 мМ Н202, ингибирующей рост бактерий, не снижала внутриклеточный уровень низкомолекулярных тиолов (рис. 9 — 12). Обработка клеток 2 мМ Н202 даже вызывала увеличение уровня низкомолекулярных тиолов в 1.4 раза (рис. 12). Более того, как только весь или большая часть оксиданта была разрушена и клетки возобновляли рост, уровень НМТ повышался. Незначительное снижение уровня НМТ наблюдались только при действии очень высоких доз Н202 (25 мМ) (рис. 12). Эти данные согласуются с более ранними сообщениями, в которых также наблюдали увеличение уровня НМТ в ответ на обработку Е. coli низкой дозой Н202 (Smirnova, Oktyabrsky, 1994).

Результаты, полученные в опытах с katG мутантами, свидетельствуют о том, что ген oxyR может принимать участие в регуляции внутриклеточных уровней НМТ в растущих клетках Е. coli, обработанных перекисью водорода. Эта регуляция может осуществляться не только путем прямого контроля экспрессии генов, чьи продукты участвуют в метаболизме GSH (например, глутатионредуктазы), но и косвенно через регуляцию активности каталазы HPI, находящейся под контролем oxyR. Дефицит каталазы HPо растущих клетках oxyR' и katG' должен приводить к повышению концентрации оксиданта в цитоплазме и, соответственно к окислению GSH.

Как и у S. typhimurium, в клетках Е. coli активность глутатионредуктазы, участвующей в восстановлении окисленного глутатиона, контролируется геном oxyR. Однако в настоящей работе показано, что активность глутатионредуктазы в ответ на обработку Е. coli Н202 возрастает незначительно, и только в узком диапазоне концентраций оксиданта, так как этот фермент не активируется при действии перекиси водорода в концентрациях выше 5 мМ. Возможно, что в растущих клетках Е. coli активность глутатионредуктазы играет второстепенную роль в поддержании уровня восстановленного глутатиона. Это согласуется с более ранними сообщениями, в которых было показано, что основную роль в поддержании внутриклеточного пула восстановленного глутатиона в нерастущих Е. coli играет биосинтез GSH de novo (Alonso-Moraga et al., 1987).

Полученные в нашей работе данные свидетельствуют о том, что в растущих клетках Е. coli основная роль в деструкции экзогенной Н2О2 принадлежит каталазе-гидропероксидазе I (HPI). Отсутствие снижения GSH в клетках дикого типа и незначительное возрастание активности глутатион-редуктазы при обработке клеток Н202 указывают на второстепенную роль глутатиона в разрушении перекиси водорода. Эти данные свидетельствуют в пользу ранее высказанного предположения о том, что глутатион, представляющий у Е. coli основную часть НМТ, не участвует в разрушении экзогенной Н2О2 (Greenberg, Demple, 1986).

Это подтверждается и результатами, полученными в экспериментах с gsh' мутантами, чувствительность которых к обработке Н202 не отличалась от чувствительности клеток gsh+ (рис. 20). Клетки Е. coli, дефицитные по синтезу глутатиона, имели также нормальную чувствительность к действию других оксидантов, менадиона и кумен гидропероксида (рис. 24).

В клетках животных глутатион играет важную роль в защите от токсического действия Н202 и органических перекисей в реакциях, катализируемых глутатионпероксидазой (Reed, Beatty, 1990). У бактерий Е. coli не обнаружено глутатионпероксидазной активности, возможно, поэтому глутатион в этих клетках не играет роли классического антиоксиданта (Greenberg, Demple, 1986).

В совокупности эти данные указывают на какую-то другую роль глутатиона в защите Е. coli против действия этими агентами, не связанную прямо с участием в деструкции перекиси водорода.

Одна из возможных ролей глутатиона при окислительном стрессе, вызванном действием Н2О2, может быть связана с его влиянием на активность ферментов и экспрессию генов, которые имеют редокс-чувствительные SH-группы. Было сообщено, что обработка клеток Е. coli тиоглицерином активирует большую группу генов, которые были определены как тиол-чувствительные гены (Javor, 1989). Многие из этих тиол-чувствительных генов включены в отклик Е. coli на различные стрессы. Учитывая данные, полученные в этой работе, представляется возможным, что увеличение уровня НМТ, индуцированное перекисью водорода, может влиять на экспрессию стрессовых генов, чья активность зависит от редокс-состояния цитоплазмы.

Другой возможной функций глутатиона у бактерий Е. coli может быть защита против окисления белков посредством реакций тиол-дисульфидного обмена между GSH и белковыми SH-группами (Javor, 1989). Одним из результатов этой работы было обнаружение положительной связи между уровнями низкомолекулярных и белковых тиолов при ответе на окислительный стресс растущих клеток Е. coli (рис. 13). Возможно, это может иметь какое-то отношение к роли глутатиона, как протектора белковых SH-rpynn.

У клеток Е. coli регуляторный белок OxyR, участвующий в контроле отклика на Н202-стресс, имеет редокс-чувствительные SH-группы, существенные для его функций (Demple, 1991). При изменении редокс-состояния одной из этих SH-групп в сторонуS-S-, белок OxyR активирует гены, находящиеся под его контролем (Storz et al., 1990). Можно ожидать, что изменения уровня общего глутатиона и соотношения GSH: GSSG будут влиять на активность белка OxyR и активность регулируемых им генов. Действительно, было сообщено, что инактивирование окисленного OxyR происходит при участии глутаредоксина и восстановленного глутатиона (Zheng ei al., 1998). В наших опытах предобработка клеток Е. coli непроникающим оксидантом гексацианоферратом калия, снижающим уровень общего глутатиона, способствовала повышению экспрессии гена katG (рис. 27), активность которого регулируется белком OxyR. Кроме того, каталазная активность в клетках gsh~, обработанных Н2О2, была в 2.2 раза выше, чем в gsh+ (табл. 6).

Вместе эти данные могут свидетельствовать о непрямой роли глутатиона в окислительном стрессе, вызванном действием экзогенной перекиси водорода на растущие клетки Е. coli. В этой ситуации глутатион может действовать как один из компонентов регуляторных систем, а не как классический анти-оксидант.

Полученные результаты позволяют объяснить один из парадоксов в поведении Е. coli при окислительном стрессе. Было показано ранее (Green-berg, Demple, 1986) и подтверждено в нашей работе, что выживаемость клеток gsh', обработанных Н202, не отличается от выживаемости gsh+. Из этих данных был сделан вывод о том, что глутатион не участвует в защите клеток Ё. coli от токсического действия Н2О2. С другой стороны, было сообщено, что выживаемость клеток katG', обработанных высокими дозами Н2О2, не отличается от выживаемости katG+ (Imlay, Linn, 1986). Создалась парадоксальная ситуация: при отклике Е. coli на действие перекиси водорода ни одна из двух основных систем, участвующих в разрушении Н2О2, не нужна.

Предложенная сотрудниками лаборатории физиологии и генетики микроорганизмов ИЭГМ УрО РАН гипотеза исходит из того, что в растущих клетках Е. coli дикого типа основной вклад в разрушение Н202 вносит ката-лаза HPI. В то же время, глутатион выполняет некоторую важную функцию, не связанную прямо с участием в разрушении Н2О2. Из-за высокой концентрации внутриклеточного глутатиона активность каталазы HPI устанавливается на уровне более низком, чем максимальный уровень, но достаточном для эффективной деструкции перекиси водорода. В итоге достигается компромисс, когда обе системы функционируют на уровне, достаточном для успешной защиты клеток от оксиданта.

В условиях, когда уровень GSH по тем или иным причинам понижен, активность каталазы HPI повышается и, соответственно, снижается количество молекул Н2О2, достигающих внутриклеточных мишеней. В обратной ситуации, когда в растущих клетках понижена активность каталазы, можно ожидать, что в цитоплазме повысится концентрация Н202. «Увеличение концентрации внутриклеточной Н202 будет способствовать снижению уровня общего глутатиона и окислению GSH. В свою очередь, это приведет к повышению активности биосинтеза глутатиона для того, чтобы компенсировать убыль GSH, расходуемого на восстановление Н202. Снижению уровня восстановленного глутатиона может способствовать также то, что в ответ на обработку Н202 значительного повышения активности глутатионредуктазы в клетках katG' не происходит и убыль восстановленного глутатиона не компенсируется за счет увеличения скорости восстановления GSSG. В пользу выдвигаемого нами предположения свидетельствуют следующие факты. Во-первых, было сообщено, что во время аэробного метаболизма в активно растущих клетках Е. coli katG' концентрация эндогенной Н202 выше, чем в клетках katG* (Gonzalez-Flecha, Demple, 1997). Во-вторых, в настоящей работе во время аэробного роста клеток Е. coli katG' наблюдали снижение уровня общего глутатиона и повышение уровня окисленного глутатиона. Обработка Н2О2 клеток katG' вызывала еще большее снижение уровня общего глутатиона и увеличение уровня окисленного глутатиона. В-третьих, было установлено, что в клетках katG' скорость биосинтеза GSH заметно выше, чем в клетках katG+ (Alonso-Moraga et al., 1987). В-четвертых, уровень индуцируемой Н2Ог каталазной активности в ^/г-дефицитных клетках был в 2.2 раза ниже, чем в клетках gsh+ (эта работа). Кроме того, было показано, что двойные мутанты Е. coli, katG' gsh', имели повышенную чувствительность к обработке Н2О2 (Alonso-Moraga et al., 1987). Отсутствие снижения уровня глутатиона в клетках дикого типа Е. coli при обработке клеток Н2О2 показывает, что благодаря наличию высокоактивной периплазматической каталазы HPI внутриклеточный глутатион защищен от воздействия Н2Ог.

Одним из важных последствий изменения внутриклеточного редокс-состояния НМТ при обработке Е. coli Н2О2 является изменение в клетках концентрации ионов калия. Обнаружена положительная связь между изменениями уровней К+ и белковых тиолов и обратная связь между уровнями К+ и НМТ.

Концентрация калия в клетках Е. coli регулируется К±входными и К±выходными системами. В поглощении калия у Е. coli участвуют системы Kdp, TrkA, TrkF, из которых наиболее полно изучена система Kdp. Многокомпонентная система Kdp включает в себя белки, которые функционируют как сенсоры, улавливающие концентрацию К+ в среде, и белки, которые транспортируют К+ через мембрану. Отток К+ из клеток регулируется системой, кодируемой генами kef A, kefB (Epstein, 1986). Было сообщено, что на активность К±выходных каналов влияет редокс-статус клеточного содержимого (Meury, Robin, 1990). Важную роль в регуляции этих каналов играет внутриклеточный GSH (Meury, Kepes, 1982; Elmore et al., 1990).

Наблюдаемое снижение концентрации К+ у Е. coli может быть вызвано изменением активности К±выходных каналов во время обработки Н2О2. Перекись водорода может вызывать отток К+ из клеток или посредством прямого активирования тиол-чувствительных центров калиевых выходных каналов или опосредованно, через изменения соотношения GSH: GSSG. Другой причиной снижения концентрации внутриклеточного К+.может быть ингибирование калиевых входных систем. Так, снижение активности К±входных систем наблюдали при инкубирования клеток Е. coli на среде без глюкозы (Meury, Kepes, 1982). Для установления причины снижения уровня внутриклеточного К+ во время окислительного стресса требуется более подробное исследование. Полученные данные можно обобщить в виде схемы действия Н202 на внутриклеточные уровни калия и низкомолекулярных ти-олов (рис. 28).

Обзор литературных данных показывает, что при стрессах, вызываемых различными факторами, в частности, гиперосмотическом шоке, стрессе голода, изменении pH среды в поведении клеток обнаруживаются некоторые одинаковые реакции. К числу таких реакций относятся изменения уровней внутриклеточных тиолов и калия у Е. coli (Oktyabrsky, Smirnova, 1993; Smir-nova, Oktyabrsky, 1995). Концентрация внутриклеточного K+ играет важную роль в регуляции внутриклеточного pH (Booth, 1985). В нашей работе были представлены данные, указывающие на корреляцию между уровнями НМТ и калия на первой стадии отклика Е. coli на окислительный стресс, вызванный обработкой клеток Н202. Полученные данные позволяют дополнить список стрессов, при которых такая связь наблюдается.

Учитывая, что у Е. coli трансмембранные потоки ионов калия и протонов взаимосвязаны (Booth, 1985), следует ожидать, что движение калия при обработке клеток перекисью водорода будет сопровождаться и изменениями трансмембранного градиента протонов (AjiH). Действительно, было доложено, что обработка перекисью водорода приводит к ингибированию мембранного транспорта, зависящего от (ДрН) (Farr et al, 1988).

Другая часть исследований была связана с изучением влияния генератора супероксидого аниона менадиона на уровень и редокс-состояние глутатиона. В то время как обработка Н202 клеток Е. coli не снижала уровень общего глутатиона и даже приводила к повышению соотношения GSH: GSSG, обработка бактерий менадионом вызывала заметное снижение аула общего глутатиона и снижение соотношения GSH: GSSG. Снижение внутриклеточной концентрации GSH может быть вызвано несколькими причинами. Было показано, что в бесклеточной системе продуктами взаимодействия GSH и менадиона являются GSSG, конъюгат GSH и менадиона, Н2О2 и 02~ (Ross et al., 1985). Одной из причин падения уровня общего глутатиона может.

К — выходные.

-> К каналы А.

GSH: GSSG н2о2 Л.

HPI, А V.

Глутатион-редуктаза gor г oxyR.

-> katG.

Рис. 28. Предполагаемая схема влияния Н202 на уровни глутатиона и калия в растущих клетках Е. coli. Повышение концентрации внутриклеточной Н202 вызывает активирование белка OxyR, что приводит к увеличению экспрессии генов katG и gor и соответственно, повышению активности ферментов каталазы HPI и глутатионредуктазы. Активация каталазы HPI приводит к увеличению скорости деструкции Н202. Активность глутатиона повышается хотя и незначительно, но достаточно для того, чтобы предотвратить снижение уровня GSH. При действии Н202 на Е. coli katG' активность каталазы HPI отсутствует, поэтому повышение концентрации Н202 в цитоплазме приводит к снижению уровня восстановленного глутатиона. Перекись водорода может влиять на уровень внутриклеточного калия прямо через воздействие на редокс-чувствительные калий-выходные кана-лы или опосредованно, через изменение соотношения GSH: GSSG. быть прямое окисление GSH менадионом (Di Monte et al, 1984) с последующим выбросом GSSG наружу клетки. В клетках эукариот выброс окисленного глутатиона в среду является одним из важных механизмов избавления клеток от окисленного глутатиона (Kosower, Kosower, 1978). Следует отметить, что окисленный глутатион способен взаимодействовать с SH-группами в белках, изменять их свойства, и тем самым оказывать вредное воздействие на клетки. Вероятно, поэтому клетки эукариот не накапливают значительной концентрации внутриклеточного GSSG и избавляются от его избытка, выбрасывая в среду (Kosower, Kosower, 1978). В нашей работе в ответ на обработку Е. coli менадионом происходило увеличение концентрации внутриклеточного GSSG, однако, концентрация окисленного глутатиона все же была слишком мала, чтобы можно было объяснить убыль GSH его переходом в GSSG. Для того, чтобы выяснить происходит ли у Е. coli удаление окисленного глутатиона в среду требуются дополнительные исследования.

Известно, что внутриклеточный метаболизм менадиона наряду с образованием 02″ приводит также к формированию Н202 (Hassan, Fridovich, 1979). Поэтому еще один путь, ведущий к повышению уровня GSSG в клетках Е. coli, обработанных менадионом, может быть связан с прямым окислением GSH перекисью водорода, образованной при дисмутации 02″. В пользу этого свидетельствует увеличение каталазной активности при обработке менадионом клеток Е. coli дикого типа (табл. 3).

Другой причиной снижения пула GSH может быть образование конъюгата GSH-менадион (Dimonte et al., 1984; Ross et al., 1985). Образование этого продукта может происходить как при участии глутатион-S-трансфераз (менадион является субстратом для этого фермента), так и прямо, без участия фермента (Meister, Anderson, 1983; Ross et al., 1985). Однако, в ответ на обработку клеток Е. coli менадионом наблюдали снижение активности глутатион-^-трансферазы (табл. 3). И все же, по нашему мнению, GST может принимать участие в снижении уровня общего глутатиона вследствие образования конъюгата GSH и менадиона, поскольку менадион не полностью ингибирует активность GST. Менадион может ингибировать активность глутатион-^-трансферазы как прямо, так и опосредованно. Было сообщено, что О2″, образуемый при восстановлении менадиона, способен высвобождать из железосодержащих кластеров некоторых белков ионы Fe (Flint et al., 1993). У E. coli ионы восстановленного железа оказывают ингибирующее действие на активность глутати-он-Я-трансферазы (Iizuka et al., 1989).

Еще одна из возможных причин снижения уровня общего глутатиона может быть связана с изменением баланса между его синтезом и деградацией. Так, у Е. coli активность у-глутатионсинтетазы ингибируется окисленным глутатионом (Apontoweil, Berends, 1975а). В этой работе показано, что обработка Е. coli менадионом приводит к заметному возрастанию уровня внутриклеточного GSSG, который, в свою очередь, действуя на у-глутатионсинтетазу, может ингибировать синтез GSH.

Другим результатом представленной работы является обнаружение повышенной устойчивости клеток Е. coli 821, дефицитных по биосинтезу глутатиона, к действию некоторых оксидантов (рис. 24). Поскольку клетки другого штамма Е. coli JTG10, также дефицитные по синтезу глутатиона, имели такую же чувствительность к действию этих агентов, как и клетки родительского типа, можно заключить, что более высокая устойчивость Е. coli 821 не связана с дефицитом глутатиона. Различие в устойчивости Е. coli 821 и JTG10 к оксидантам может быть связано с тем, что в клетках первого штамма, кроме мутации в локусе gshA могут быть мутации в других локусах. Штамм 821 был выделен в результате селекции клеток ABl 157, обработанных И-метил-К'-нитро-М-нитрозогуанидином (Apontoweil, Berends, 1975b). Штамм Е. coli JTG10 был получен совершенно другим способом, а именно, в результате трансдукции мутации gshA: TnlOkm в ABl 157 с помощью бактериофага PI (Greenberg, Demple, 1986). В последнем случае вероятность появления других мутаций резко снижается.

Причина повышенной устойчивости Е. coli 821 к менадиону может быть связана с низким уровнем активности НАДФН: менадион-диафоразы, которая катализирует перенос электронов от менадиона на 02 с образованием 02″ (Fridovich, 1983). Пониженный уровень НАДФН: менадион-диафоразы может способствовать более медленному восстановлению менадиона и соответственно, понижению стационарных концентраций реактивных форм кислорода до более низких уровней, при которых антиоксидантные системы клетки успешно нейтрализуют их. В пользу этого предположения свидетельствует то, что базовый уровень активности каталазы в клетках 821 был в 1.5 раза ниже, чем в клетках родительского типа ABl 157. Пониженная каталазная активность в клетках 821 может быть следствием более низкого уровня Н202, образующейся в результате дисмутации супероксид аниона, что в свою очередь может быть следствием более низкой скорости метаболизма менадиона. Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что штамм Е. coli 821 может быть полезным для изучения метаболизма менадиона у Е. coli и механизмов, определяющих устойчивость клеток к этому оксиданту. С другой стороны, при изучении роли глутатиона в окислительном стрессе использование штамма JTG10 является более предпочтительным.

Одно из объяснений противоположных изменений уровня НМТ при действии на Е. coli Н202 и K4[Fe (CN)6] может быть связано с различной ролью глутатиона в отклике на действие этих оксидантов. Выше было представлено, что в растущих клетках Е. coli прямое участие GSH в разложении Н202 незначительно и основная роль принадлежит каталазе HPI, активность которой значительно возрастает после обработки клеток Н202. Об этом свидетельствуют отсутствие существенной разницы в ингиби-ровании скорости роста перекисью водорода у gsh+ и gsh" клеток и повышение внутриклеточного уровня небелковых тиолов у клеток дикого типа в ответ на обработку перекисью водорода.

В клетках растений причиной снижения уровня GSH при обработке K4[Fe (CN)6] может быть его прямое или косвенное участие в восстановлении феррицианида при выходе GSH из клеток (Patison et al., 1987). Это предположение может быть справедливо и для Е. coli. Известно, что скорость восстановления K4[Fe (CN)6] у эукариот зависит от концентрации НАДФН (Crane et al., 1985). Возможной причиной снижения уровня GSH при восстановлении Е. coli феррицианида может быть снижение пула НАДФН, способного поддерживать феррицианидредуктазную реакцию и в то же время участвовать в восстановлении окисленного глутатиона, катализируемом глутатионредуктазой (Asnis, 1955). Накапливающийся в аэробных условиях окисленный глутатион может экскретироваться наружу клетки или подвергаться разложению при участии у-глутамилтранспептидазы, имеющей более высокую гидролазную активность по отношению к окисленному глу-татиону (GSSG), чем к восстановленному (GSH) (Suzuki et al., 1986а).

В пользу участия глутатиона в восстановлении феррицианида клетками Е. coli свидетельствуют следующие данные. Во-первых, низкий окислительно-восстановительный потенциал GSH (Ео' = - 0.23 В) является достаточным для того, чтобы глутатион мог выступать донором электронов в реакции восстановления феррицианида. Восстановленный глутатион может реагировать с феррицианидом без участия ферментов. Во-вторых, в ответ на обработку клеток Е. coli K4[Fe (CN)6] происходило снижение пула внутриклеточного глутатиона. В-третьих, скорость восстановления феррицианида gsh-дефицитными клетками была заметно ниже, чем скорость его восстановления клетками gsh+. Кроме того, ранее было показано, что добавление в среду реагентов, связывающих свободные SH-группы, приводит к ингиби-рованию восстановления K4[Fe (CN)6] у Е. coli (Oktyabrsky et al., 1993). Таким образом, роль глутатиона во время окислительного стресса, вызванного обработкой Е. coli K4[Fe (CN)6], существенно отличается от той, которую глутатион играет при действии Н202.

Действие на клетки Е. coli теллурита калия вызывало снижение концентрации общего глутатиона, аналогичное тому, которое наблюдали при действии K4[Fe (CN)6]. В отличие от последнего, анионы теллурита проникают внутрь клетки, где восстанавливаются в менее токсичный элементарный теллур (Turner et al, 1994). Токсичное действие теллурита для клеток связывают с его способностью окислять внутриклеточное содержимое (Turner et al, 1995). В настоящее время нет полной ясности в механизме восстановления анионов теллурита у Е. coli. Полученные в данной работе данные свидетельствуют о том, что глутатион может прямо или косвенно принимать участие в восстановлении теллурита. На эту возможность указывает: 1) Окислительно-восстановительный потенциал восстановленного глутатиона позволяет ему выступать в роли восстановителя теллурита. Взаимодействие GSH с теллуритом in vitro приводит к восстановлению последнего и может происходить неферментативно. 2) Восстановление клетками Е. coli теллурита сопровождалось снижением пула внутриклеточного глутатиона (эта работа). Кроме того, было сообщено, что обработка клеток Е. coli теллуритом вызывает окисление внутриклеточных тиолов (Turner et al, 1999). 3) Клетки Е. coli, дефицитные по синтезу глутатиона, имели повышенную чувствительность к обработке теллуритом калия (Turner et al, 1995). Добавление в среду диэтилмалеата, понижающего уровень внутриклеточных тиолов, увеличивала чувствительность к теллуриту клеток Е. coli дикого типа (Turner et al, 1995). Кроме того, было показано, чээ скорость восстановления теллурита у бактерий A. calcoaceticus прямо зависит от концентрации внутриклеточных тиолов (Соломенный, 1998).

Помимо участия в восстановлении теллурита, глутатион может также принимать участие в защите клеток против К2ТеОз опосредованно. Было сообщено, что у Е. coli белки, имеющие высокую специфичность по отно.

115 шению к теллуриту, имеют редокс-чувствительные SH-группы, существенные для их активности (Turner et al., 1994). Восстановленный глутатион может принимать участие в защите SH-групп в этих белках.