Интеграза ВИЧ-1: ингибирование каталитической активности модифицированными олигонуклеотидами

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) поражает иммунную систему и вызывает одно из опаснейших заболеваний — синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). По оценкам всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), на начало 2006 года число людей, зараженных ВИЧ, во всем мире составляло 38,6 миллиона человек (рис.1) [1]. Число людей, заразившихся ВИЧ в 2005 году, составило 4,1 миллиона человек, и 2,8 миллиона человек умерли от СПИДа. В Российской Федерации с момента начала эпидемии и до начала 2006 года официально было зарегистрировано около 350 000 случаев ВИЧ-инфекции. Однако фактическое число людей, живущих в России с ВИЧ-инфекцией намного выше. По различным оценкам, их количество на начало 2006 года составляет от 560 000 до 1,6 миллиона человек.

15.04−34,0%? 1.0%-<5.0%? 0,1%-<�Я.5Ч.

5,0%-<15,0Ч? 0,5%-<1,0%? <0,1%.

Рис. 1. Глобальная картина ВИЧ-инфекции по данным ВОЗ (на начало 2006 года) [1].

До начала применения первых коммерчески доступных лекарственных препаратов против СПИДа продолжительность жизни больных составляла не более одного года. Используемая в настоящее время комплексная терапия HAART (highly active antiretroviral therapy) позволяет продлить время жизни больных СПИДом до 8 лет [2]. Данный вид терапии включает лекарственные препараты, направленные на подавление трех стадий репликативного цикла ВИЧ: обратной транскрипции, протеолитического созревания и слияния вирусной частицы с клеткой. Необходимость использования комплексной терапии обусловлена быстрой эволюцией ВИЧ, которая приводит к появлению устойчивых к препаратам форм вируса. Несмотря на то, что.

HAART-терапия рассматривается как наиболее действенная и доступная на сегодняшний день, ее применение приводит к желаемому снижению уровня инфекции только у 50−90% наблюдаемых больных. Она так же не позволяет полностью остановить репликацию ВИЧ. Кроме того, часто возникают проблемы с доступностью препаратов, применяемых в HAART-терапии, их токсичностью и восприимчивостью организмом инфицированного человека. По этим причинам в настоящее время продолжается активный поиск как новых ингибиторов указанных выше стадий репликативного цикла ВИЧ, так и соединений, нарушающих другие стадии цикла вируса и способных дополнить существующую противовирусную терапию.

Большое внимание уделяется разработке ингибиторов стадии интеграции. В ходе собственного воспроизводства вирус использует ресурсы клетки, для чего ему необходимо встроить (интегрировать) ДНК-копию своего генома в геном зараженной клетки. Этот процесс осуществляет вирусный фермент интеграза. Показано, что вирус, содержащий дефектную интегразу, не способную осуществлять интеграцию вирусной ДНК, не размножается в культуре клеток [3]. Это говорит о ключевой роли стадии интеграции в репликативном цикле ВИЧ. Кроме того, остановка репликации вируса при нарушении функций интегразы свидетельствует также о том, что клетка не содержит каких-либо собственных ферментов, способных катализировать интеграцию. В связи с этим, ингибиторы, специфично подавляющие каталитическую активность интегразы, не должны влиять на другие клеточные процессы и, как следствие, должны быть менее токсичны для клетки и всего организма в целом по сравнению с ингибиторами других стадий репликативного цикла ВИЧ. Но, несмотря на всю привлекательность интегразы в качестве мишени для противовирусных препаратов, на сегодняшний день нет ни одного соединения — ингибитора интегразы, которое бы успешно прошло все клинические испытания и было бы предложено как лекарственное средство против СПИДа. Большинство известных на сегодняшний день ингибиторов интегразы, в том числе и ингибиторы, находящиеся на стадии клинических испытаний, взаимодействуют с ионом магния, связанным в активном центре фермента. Однако уже показано, что применение этих ингибиторов приводит к быстрому появлению устойчивых к их действию форм фермента, содержащих мутации в активном центре. Кроме того, такие ингибиторы способны влиять на активность клеточных ферментов, относящихся к тому же семейству, что и интеграза, и использующих при катализе ионы магния, например, V (D)J RAG рекомбиназы, которые необходимы для нормального синтеза антител в организме. В этой связи крайне актуальным является поиск новых соединений, способных подавлять каталитическую активность интегразы, и в том числе ингибиторов с новым механизмом действия.

Целью настоящей работы стала разработка эффективных, специфичных и нецитотоксичных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 на основе модифицированных олигонуклеотидов. В ходе работы был осуществлен синтез серии конъюгатов коротких одноцепочечных олигонуклеотидов с гидрофобными соединениями различной структуры и исследовано их действие на активность интегразы ВИЧ-1. Показано, что наиболее эффективными ингибиторами являются конъюгаты 11-звенных олигонуклеотидов с эозином и олеиновой кислотой. Эти соединения подавляют обе стадии интеграции: З'-процессинг и перенос цепи. Кроме того, было исследовано влияние длины олигонуклеотида и структуры его углеводо-фосфатного остова на ингибирующую активность конъюгатов. По результатам исследований, для ингибирования интегразы ВИЧ-1 in vivo предложены конъюгаты 2'-0-метилированного олигонуклеотида с эозином или олеиновой кислотой.

Для того чтобы понять механизм действия предложенных нами ингибиторов, мы изучили их действие на комплекс интегразы с ДНК-субстратом — U5 фрагментом ДНК ВИЧ. Установлено, что действие ингибиторов на основе модифицированных олигонуклеотидов направленно на разрушение комплекса интегразы с вирусной ДНК. Ковалентное присоединение олигонуклеотидного ингибитора к интегразе с последующим масс-спектрометрическим анализом продуктов триптического гидролиза ковалентно связанного комплекса позволило идентифицировать участок фермента, с которым взаимодействует ингибитор. Показано, что он локализован в С-концевом домене интегразы. Высокая активность олигонуклеотидных конъюгатов как ингибиторов интегразы ВИЧ-1 свидетельствует о важности данного участка в функционировании фермента. Полученная информация может быть использована для дизайна новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1.

Для тестирования противовирусной активности предлагаемых нами ингибиторов на ВИЧ-инфицированных клетках мы подобрали носители, обеспечивающие эффективную доставку олигонуклеотидных конъюгатов в ядра клеток. В сотрудничестве с университетом г. Левен (Бельгия) показано, что конъюгаты 2'-0-метилированного олигонуклеотида с эозином и олеиновой кислотой ингибируют репликацию ВИЧ-1 в инфицированных клетках.

Работа включает обзор литературы, посвященный основным классам ингибиторов интегразы ВИЧ-1 и механизмам их действия.

выводы.

1. Синтезирована серия конъюгатов олигодезоксинуклеотида GGTTTTTGTGT с различными гидрофобными молекулами, исследована их способность ингибировать каталитическую активность интегразы ВИЧ-1 и показано, что наиболее эффективными ингибиторами являются конъюгаты с эозином и олеиновой кислотой. Исследовано влияние длины олигонуклеотида и структуры его углеводо-фосфатного остова на ингибирующую активность. Установлено, что конъюгаты 11-звенного 2'-0-метилированного олигонуклеотида с эозином и олеиновой кислотой специфично подавляют активность в реакциях З'-процессинга и переноса цепи.

2. Показано, что конъюгаты подавляют активность интегразы, разрушая ее комплекс с субстратной ДНК.

3. Установлено, что конъюгаты взаимодействуют с С-концевым доменом интегразы в районе Lys236. Предложена гипотеза, согласно которой взаимодействие ингибитора с ферментом в данном участке приводит к нарушению гидрофобных контактов, формирующих p-баррельную структуру С-концевого домена, что в результате вызывает нарушение его ДНК-связывающей функции.

4. Изучено проникновение олигонуклеотидного ингибитора в клетки в присутствии носителей различной природы и подобраны оптимальные условия трансфекции. Обнаружено, что конъюгат 2'-0-метилированного олигонуклеотида с эозином 11-ОМ-Е в комплексе с пептидным носителем (Пептид 1) эффективно ингибирует репликацию ВИЧ-1 в инфицированных клетках.