Цитолитические и антимикробные пептиды из яда паука Lachesana tarabaevi

Полипептидные соединения, функция которых связана с взаимодействием с биологическими мембранами или структура которых обеспечивает эффективность этих взаимодействий, называют мембрано-активными полипептидами (МАП). МАП представляют обширный и гетерогенный класс соединений, используемых живыми организмами от бактерий до человека в различных целях. В основе такой универсальности МАП лежит способность взаимодействовать не со специфическим белковым рецептором, а с липидным бислоем, неотъемлемым компонентом клеточных форм жизни. Благодаря этому свойству МАП являются вездесущими компонентами внутрии межвидовых отношений, эффекторными соединениями в конкурентной борьбе [1−14].

Характерная черта большого числа МАП — способность к дестабилизации мембраны-мишени, приводящей к клеточной гибели. МАП, функция которых состоит в разрушении мембраны и убийстве клетки, называют цитолитическими пептидами (ЦП). Природные ЦП представляют собой одно из наиболее простых по механизму действия и структурной организации, а также наиболее древних по происхождению и универсальных по сфере применения орудий в борьбе организмов друг с другом. Действительно, ЦП чрезвычайно распространены в природе, их находят практически у всех форм живых существ [7, 9, 10, 12, 15].

Организмы различного систематического положения (как эу-, так и прокариоты) продуцируют разнообразные пептиды с выраженным антимикробным действием, т.н. антимикробные пептиды (АМП), большая часть которых проявляют цитолитические свойства [9, 12, 15]. Многие из этих соединений являются неотъемлемой частью системы врожденного иммунитета высших организмов (животных и растений), характерного, в отличие от приобретенного, практически для всех многоклеточных, а не только для высших позвоночных [16−18]. Таким образом, для многих ЦП (АМП) характерна защитная функция, и эти пептиды называют защитными (ЗП). В литературе введен также термин «host defense peptides» в качестве синонима защитных АМП или как уточнение, указывающее на вовлеченность данных пептидов во врожденный иммунитет [10].

Не менее эффективно ЦП могут быть использованы и в целях нападения. ЦПраспространенные эффекторные молекулы-участники в конкурентной борьбе микроорганизмов [7]. Однако наиболее ярким примером служат ЦП, содержащиеся в природных ядах [4, 11]. Некоторые из этих молекул служат главным универсальным оружием ядовитых животных и являются наиболее значимым компонентом их яда, выполняющим центральную функцию убийства/парализации жертвы и/или отпугивания агрессора.

МАП являются удобной моделью для изучения белок-мембранных взаимодействий и, таким образом, представляют фундаментальный интерес. Практический интерес к ЦП основан на их антимикробной активности. Стремительный рост числа структурно новых антибиотиков, вводимых в клиническую практику, наблюдавшийся в 40−50-х годах прошлого столетия, сменился длительным инновационным кризисом, который продолжается и сегодня [19]. Широкое применение антибиотиков в качестве лечебных препаратов вызывает быстрое накопление устойчивых форм микроорганизмов, у которых клинически существенная резистентность возникает за период от нескольких месяцев до нескольких лет. Распространены случаи устойчивости целого ряда патогенов человека (Enterococcus faecalis, Mycobacterium tuberculosis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae и многих других) практически к любому из применяемых препаратов [20−22].

По-видимому, принципиально новым классом природных антибиотиков, которые будут введены в клиническую практику, являются АМП [23]. Несмотря на существование более сильных антибиотиков, действующих при меньших концентрациях, АМП обладают рядом преимуществ. Способность быстро убивать клетки-мишени, широкий спектр действия, активность в отношении штаммов, резистентных к другим антибиотикам, а также относительная трудность в селекции устойчивых мутантов in vitro, позволяют рассматривать эти вещества в качестве основы для создания эффективных лекарств, особенно на фоне снижения потенциала обычных антибиотиков [24]. Учитывая широкое разнообразие ЦП из яда членистоногих, проявляющих различные спектры действия, предполагается возможным их использование как лекарственных прототипов.

Ущерб, наносимый мировому сельскому хозяйству со стороны патогенов культурных растений (грибов, бактерий, вирусов и вироидов) и насекомых-вредителей (две главные причины ущерба), оценивается трлн. рублей ежегодно. Потери нередко достигают 45% урожая. Современные методы, применяемые с целью снижения убытков, в основном сводятся к использованию синтетических пестицидов, многие из которых являются экологически агрессивными веществами. Использование химических средств защиты растений представляет значительную опасность для окружающей среды, биологические средства защиты растений являются более безопасными. Внедрение инсектицидов нового поколения позволило улучшить ситуацию лишь на 5−10% [25].

Применение методов генной инженерии для трансформации растений открывает новые возможности создания культур, обладающих широкой устойчивостью к патогенам, вредителям, а также абиотическому стрессу (засухе, засоленности почвы и др.). Пионерские работы по получению резистентных сортов сельскохозяйственных культур с использованием технологий рекомбинантных ДНК были выполнены около 20 лет назад [26, 27]. С использованием гена инсектицидного белка бактерии Bacillus thuringiensis были получены трансгенные растения табака, устойчивые по отношению к паразитическим личинкам бабочки Manducta sexta. С тех пор, по крайней мере, 10 генов энтомотоксинов из В. thuringiensis были перенесены и экспрессированы как минимум в 26 видах растений, приобретших устойчивость к некоторым вредителям [28]. Значительная часть мирового урожая приходится сегодня на долю ^/-трансформированных продуктов (информация взята с официального сайта Департамента сельского хозяйства США: www.aphis.usda.gov). Тем не менее, до сих пор не решен вопрос о безопасности ^/-содержащих продуктов для человека, не совсем ясны экологические последствия глобального распространения трансгенных растений, содержащих гены энтомотоксинов В. thuringiensis [29]. Кроме того, видимое нарушение межвидового барьера получает отрицательный отклик в современном обществе. На рынке практически не представлены другие ген-модифицированные сорта с повышенной устойчивостью. Более того, инженерия устойчивости к заболеваниям оказалась более сложной задачей, нежели повышение сопротивляемости насекомым. Согласно современным представлениям, ЦП и АМП представляют собой перспективный инструмент инженерии устойчивости растений к патогенам и могут быть использованы в «зеленой» биотехнологии.

Объект исследований.

В качестве объекта исследования был выбран яд среднеазиатского паука Lachesana tarabaevi Zonstein et Ovtchinnikov, 1999 из семейства Zodariidae («пауки-муравьеды»). Яд этого паука обладает наиболее выраженным цитолитическим действием в отношении различных клеток среди ядов около ста различных видов членистоногих из 25 семейств, имеющихся в коллекции лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ РАН. Цельный яд обладает также высокой антимикробной активностью в отношении Escherichia coli со значением минимальной ингибирующей концентрации (МИК) 10 мкг/мл и высокой инсектицидной активностью против личинок серой мясной мухи Sarcophaga carnaria со значением средней летальной дозы (ЛД50) при инъекции 3 мкг/гхарактер симптомов, вызываемых введением яда (некроз близлежащих тканей, обильное выделение жидкости), указывал на наличие в его составе цитолитических агентов [11]. Мы предположили, что яд L. tarabaevi является богатым источником новых ЦП и АМП.

Цель и задачи работы.

Цель настоящей работы состояла в изучении цитолитических и антимикробных пептидов (ЦП и АМП) из яда среднеазиатского паука Ьаскезапа ШгаЪаелп. В соответствии с целью были поставлены следующие конкретные задачи: а) Провести идентификацию и выделение ЦП и АМП из цельного ядаб) Установить первичную структуру активных пептидовв) Осуществить функциональную характеристику новых веществг) Изучить аминокислотную последовательность предшественников ЦП и АМПд) Разработать систему гетерологичной экспрессии генов новых пептидов.

Стратегия исследований.

Для изучения ЦП и АМП из яда Ь. tarabaevi мы использовали комплексный подход, объединивший в себе две независимых стратегии. Первая и более традиционная заключалась в выделении из яда индивидуальных активных соединений и установлении их аминокислотной последовательности. Вторая предусматривала анализ т зШсо транслированных нуклеотидных последовательностей из библиотеки кДНК ядовитых желез паука, имеющейся в лаборатории, и выявление потенциальных МАП. Сравнение двух групп данных позволило получить наиболее полную информацию о МАП яда.

Обзор литературы.

Выводы.

1. Яд паука Ьаскезапа (агаЬаеуг является уникальным по молекулярному составу с преобладанием цитолитических пептидов. Установлены полные аминокислотные последовательности 41 новых пептидов, образующих 13 семейств. Для восьми семейств пептидов показана цитолитическая, антимикробная и мембранотропная активность.

2. Идентифицированы полные аминокислотные последовательности предшественников зрелых пептидов из яда Ь. ?агаЪаеп. Предложена схема биосинтеза активных молекул в результате созревания предшественников различного типа. Показана роль кислой пропоследовательности в нейтрализации активности зрелой цепи.

3. Открыт новый класс цито-инсектотоксинов, представляющих собой длинные (свыше 60 остатков), линейные, катионные и амфифильные пептиды с выраженной цитолитической, антимикробной и инсектицидной активностью. Предположена эволюция некоторых цито-инсектотоксинов из предшественников модульной организации.

4. В бактериальной системе экспрессии получен рекомбинантный антимикробный пептид латарцин 2а, идентичный природному.

2.10.

Заключение

.

Подводя итог, следует отметить высокий научный и практический интерес к ЦП из яда членистоногих. С точки зрения синтеза эффекторных молекул, используемых в межорганизменных отношениях, ядовитые членистоногие по праву считаются «экспертами», а их яды — уникальными источниками таких молекул. ЦП представляют собой важный компонент яда, функции которого разнообразны. Эти соединения используются как модельные объекты для изучения белоки пептид-мембранных взаимодействий, формирования биомолекулярного разнообразия яда, биосинтеза секретируемых молекул, структурно-функциональных отношений в полипептидах и т. д.

Материалы и методы исследования.

3.1. Материалы.

Реактивы: В работе использовались реактивы и материалы Clontech, ICN, Merck, Novabiochem, Novagen, Promega, Sigma-Aldrich (США), Fluka Chemie GmbH, (Германия), Криохром и Химмед.

Вода: Все растворы были приготовлены с использованием деионизованной воды (сопротивление 18,2 МОм), полученной на установке Millipore (США). Для биологических испытаний использовалась стерилизованная с помощью автоклавирования вода.

Биологический материал: Цельный яд паука Lachesana tarabaevi в виде лиофилизированного порошка приобретен у Fauna Laboratories (Казахстан). Бактериальные культуры для анализа антимикробной активности были получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов.

Бактериальные штаммы для молекулярного клонирования Escherichia coli XLl-Blue, а также для проведения экспрессии Е. coli BL21(DE3) приобретены у компании Novagen (США).

3.2. Разделение яда. Очистка пептидов.

Для разделения яда с целью получения индивидуальных активных компонентов проводили последовательно 2−3 стадии хроматографии. На первом этапе яд подвергался эксклюзионной хроматографии (гель-фильтрации), а далее фракция, содержащая пептидные компоненты, разделялась по методу обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ).

3.2.1. Гель-фильтрация.

10 мкл цельного яда L. tarabaevi предварительно высушивали лиофильно и получали ~2 мг сухого веса. Сухой яд растворяли в 150 мкл элюирующего раствора для эксклюзионной хроматографии (10% CH3CN, 0,1% трифторуксусная кислота (ТФУ), v/v) и наносили на колонку с высокой разрешающей способностью TSK 2000SW (7,5×600 мм, размер пор 12,5 нм, диаметр частиц 10 мкмBeckman, Япония), на которой, по заявлению производителя, эффективно разделяются вещества с молекулярными массами в диапазоне 5−100 кДа. С помощью хроматографа System Gold (Beckman, США) элюирующий раствор подавали на колонку со скоростью 0,5 мл/мин, предварительно пропуская через дегазер. Детекцию осуществляли по оптической плотности элюата при 210 нм с регистрацией на компьютере, снабженном программой МультиХром (Амперсенд). Фракции отбирали с помощью автоматического коллектора. Промывку колонки осуществляли этиловым спиртом.

3.2.2. Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография.

Полученную фракцию, содержащую активные компоненты, разделяли на аналитической колонке Vydac 218ТР54 Qg (4,6×250 мм, размер пор 30 нм, диаметр частиц 5 мкмSeparations Group, США) с использованием градиентного хроматографа (Kontron Instruments, Великобритания), снабженного насосами System 525 и детектором 535, а также дегазером 3415а (ERC, Япония). Раствор, А — 0,1%-ная (v/v) ТФУ в воде, раствор Б — 0,1%-ная ТФУ в ацетонитриле. Перед поступлением на колонку растворы дегазировали. Пробы наносились на колонку, переведенную в стартовый раствор А. Разделение проводили в линейном градиенте ацетонитрила: от 0 до 60% раствора Б, т. е. от 0 до 60% по ацетонитрилу, в течение 90 мин при комнатной температуре (23°С) и скорости потока 0,7 мл/мин. Детекцию осуществляли по оптической плотности элюата при 210 и 280 нм с регистрацией на компьютере, снабженном программой Kroma System 2000 (BioTek Instruments, США). Колонку промывали 80%-ным раствором Б.

С целью окончательной очистки выделенных соединений использовали дополнительное разделение с помощью ОФ-ВЭЖХ в измененных условиях: (а) на той же колонке Vydac Cis с иным режимом разделения или (б) с использованием иного элюирующего раствора- (в) на колонке Ascentis RP-Amide (2,1×100 мм, размер пор 10 нм, диаметр частиц 3 мкмSupelco, США) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила со скоростью элюции 0,3 мл/мин.

Содержание примесей в очищенных фракциях оценивали с помощью аналитической ВЭЖХ на колонке Luna Cis (1×150 мм, размер пор 10 нм, диаметр частиц 3 мкмPhenomenex, США) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 10 до 60% (v/v) в течение 100 минут со скоростью элюции 50 мкл/мин.

3.3. Масс-спектрометрия.

Оценку молекулярных масс, а также индивидуальности очищенных веществ проводили с помощью масс-спектрометрического (МС) анализа. Использовали метод времяпролетной (time-of-flight, TOF) матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (МАЛДИ) (matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI) масс-спектрометрии (MC) (MALDI-TOF MS), т. е. десорбционный метод «мягкой» ионизации МАЛДИ, тип масс-анализатора времяпролетный.

В ходе подготовки проб для анализа были учтены методические указания в руководствах по эксплуатации масс-спектрометров соответствующих фирм-производителей. Использовали наиболее распространенный метод «высушенной капли» («dried-droplet»). От фракций, полученных методами ОФ-ВЭЖХ или гель-фильтрации, отбирали аликвоты по 250 мкл и при необходимости доводили до конечных концентраций содержащихся в них веществ порядка 2−10 мкМ на вакуумном концентраторе. На мишени смешивали равные объемы (по 0,5 мкл) образцов и раствора матрицы — 2,5-дигидроксибензойной кислоты (10 мг/мл в 70%-ном CH3CN, 0,1%-ной ТФУ, v/v) или а-циано-4-гидроксикоричной кислоты (10 мг/мл в 50%-ном CH3CN, 0,1%-ной ТФУ, v/v), — высушивали на воздухе.

Масс-спектры получали на МАЛДИ-времяпролетных масс-спектрометрах M@LDI-LR (Micromass, Великобритания) и Ultraflex TOF-TOF (Bruker Daltonik GmbH, Германия), оснащенных УФ-лазером (337 нм), с идентификацией положительных ионов в линейном режиме (измерение средних значений молекулярных масс) или с использованием рефлектрона (измерение моноизотопных молекулярных масс). Калибровку приборов проводили с использованием наборов стандартов ProteoMass peptide and protein MALDI-MS calibration kit (диапазон молекулярных масс 700−66 000 Да) или ProteoMass peptide MALDI-MS calibration kit (700−3500 Да) (Sigma-Aldrich, США). Заявленная производителями точность измерения масс составляла 50 и 5 миллионных долей для M@LDI-LR и Ultraflex, соответственно. Масс-спектры записывались в память компьютера и анализировались с помощью программ Bruker DataAnalysis for TOF.

Секвенирование пептидов с помощью тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) проводили на масс-спектрометре Ultraflex TOF-TOF согласно указаниям производителя с использованием ячейки, где происходит фрагментация «родительских» ионов и второго времяпролетного масс-анализатора для измерения масс полученных фрагментов.

3.4. Восстановление дисульфидных связей и алкилирование тиольных групп.

Реакции восстановления дисульфидов 1,4-дитиотреитолом (ДТТ) и алкилирования тиолов 4-винилпиридином (ВП) с образованием остатков пиридилэтилцистеина вели согласно модифицированной методике [245, 246]. Учитывались практические советы и теоретические соображения, приведенные в работе [247].

Высушенные на вакуумном концентраторе аликвоты фракций, соответствующие порядка 1 нмоль веществ, растворяли в 40 мкл раствора, содержащего 6 М гуанидингидрохлорид, 3 мМ ЭДТА, 0,5 М Трис-HCl, рН 8,5. Затем к пробам добавляли 2 мкл.

1,4 M ДТТ в воде, т. е. заведомо 100-кратный избыток, перемешивали и инкубировали их в течение 4 ч при 40 °C в атмосфере азота.

К восстановленным образцам добавляли 4 мкл 50%-ного (v/v) ВП в изопропаноле, т. е. более чем 10-кратный избыток по отношению к ДТТ, перемешивали. Невосстановленные образцы высушивали на вакуумном концентраторе и растворяли в 40 мкл раствора, использовавшегося для реакции с ДТТ, после чего сразу добавляли ВП. Пробы инкубировали 15−20 мин в темноте при комнатной температуре в атмосфере азота, после чего проводили разделение продуктов методом ОФ-ВЭЖХ на аналитической колонке Jupiter С5 (2×150 мм, размер пор 30 нм, диаметр частиц 5 мкмPhenomenex, США) со скоростью элюции 0,3 мл/мин. При этом сначала изократически элюировали побочные продукты реакции и остатки реагентов, поглощающие в УФ-области, 5%-ным CH3CN до установления ровной базовой линии, затем проводили элюцию целевых продуктов реакции в градиентном режиме.

3.5. Определение TV-концевой аминокислотной последовательности.

3.5.1. Автоматическое секвенирование по Эдману.

Определение Л'-когщевой последовательности очищенных пептидных компонентов проводили методом ступенчатой деградации по Эдману на автоматическом секвенаторе Procise 492 (Applied Biosystems, США) по методике фирмы-изготовителя. Остатки цистеина определялись в виде пиридилэтилированного производного (см. выше).

3.5.2. Отщепление А'-концевого остатка пироглутаминовой кислоты.

В случае «блокированных» /V-концевым остатком пироглутамата пептидов проводили предварительно процедуру «деблокирования» — отщепления этого остатка пироглутамат-аминопептидазой (пироглутамил-пептидазой I) — цистеиновой пептидазой из археи Pyrococcus furiosus (ЕС: 3.4.19.3- Sigma-Aldrich, США). Реакцию вели согласно процедуре, описанной в методических указаниях, распространяемых фирмой-производителем.

Порядка 1 нмоль очищенного пептида с блокированным iV-концевым аминокислотным остатком высушивали на вакуумном концентраторе и растворяли в 40 мкл 50 мМ фосфатного буфера, рН 7, содержащего 10 мМ ДТТ и 1 мМ ЭДТА. В пробирку добавляли 10 мкл того же раствора, содержащие 1 миллиединицу фермента (1 единица гидролизует 1 мкмоль пироглутамат-я-нитроанилида за 1 мин при рН 7 и 37°С). Пробу инкубировали в течение 2 ч при 75 °C, после чего деблокированный пептид выделяли методом ОФ-ВЭЖХ на аналитической колонке Jupiter С5 (2×150 мм).

3.6. Селективный гидролиз полипептидов.

С целью установления полной аминокислотной последовательности, выделенные индивидуальные полипептидные соединения подвергали селективному расщеплению: химическому — по остаткам метионина с использованием бромцианаферментативному — по остаткам глутаминовой кислоты с помощью эндопротеиназы Glu-C (протеазы V8- глутамиловой эндопептидазы) — сериновой протеазы, продуцируемой бактерией Staphylococcus aureus штамма V8 (ЕС: 3.4.21.19- Boehringer Mannheim GmbH, Германия), аргинина с помощью эндопротеиназы Arg-C (тканевого калликреина) — сериновой протеазы, выделенной из подчелюстной слюнной железы мыши (ЕС: 3.4.21.35- Sigma-Aldrich, США) и аспарагиновой кислоты с помощью эндопротеиназы Asp-N (пептидил-Asp металлоэндопептидазы) — металлопротеазы, продуцируемой бактерией Pseudomonas fragi (ЕС: 3.4.24.33- Boehringer Mannheim GmbH, Германия).

3.6.1. Расщепление полипептидов бромцианом.

В работе использовали методику профессора Егорова Ц. А. [246] с модификациями.

В реакцию брали около 1−3 нмоль очищенных веществ — для последующего секвенирования фрагментов по Эдману — и меньшие количества — для МС/МС. Высушенные на вакуумном концентраторе аликвоты полипептидов растворяли в 80%-ной водной (v/v) ТФУ, доводили до концентрации 0,1−1 мкг/мкл. Раствор 5 М бромциана в ацетонитриле (Sigma-Aldrich, США) прибавляли с заведомо 100-кратным избытком по отношению к остаткам метионина, пробы перемешивали, продували азотом и оставляли на 18 ч при комнатной температуре в темноте. Реакцию останавливали разбавлением смеси 10-ю объемами воды, пробы высушивали на вакуумном концентраторе, растворяли в 0,1% ТФУ. Продукты реакции разделяли по методу ОФ-ВЭЖХ на аналитической колонке Luna Cis (1×150 мм) или же анализировали с помощью МС/МС (в этом случае, как правило, пробы высушивали не полностью, а до объема ~10 мкл).

3.6.2. Ферментативный гидролиз полипептидов.

Использовали методические указания компаний-производителей ферментов (см. выше).

Во всех случаях ~1 нмоль очищенного компонента высушивали на вакуумном концентраторе и растворяли в соответствующем буферном растворе, доводили до концентрации 0,1−1 мкг/мкл. В образцы вносили нужное количество фермента и инкубировали в нужных условиях, после чего отбирали аликвоты (как правило, 1/10 часть) для МС анализа, продукты реакции разделяли с помощью ОФ-ВЭЖХ на аналитической колонке Luna Cis (1×150 мм). Отобранные аликвоты обессоливали с помощью ZipTip (Millipore, США) и наносили на мишень для МС.

Ниже приводится таблица с указанием конкретных условий гидролиза полипептидов с использованием того или иного фермента.