Совершенствование схем специфической профилактики бруцеллёза маралов с использованием живой слабоагглютиногенной вакцины из штамма Brucella abortus 75/79-AB

Актуальность темы

Пантовое оленеводство — динамично развивающая отрасль сельского хозяйства, дающая два вида продукции: основную (панты) и побочную (мясо, кровь, хвосты, пенисы, жилы, зародыши), которые, в свою очередь, служат ценным лекарственным сырьем, применяемым в восточной и отечественной медицине для лечения различных заболеваний. Существенным сдерживающим фактором её развития являются инфекционные заболевания, одно из которых — бруцеллёз.

Бруцеллёз сельскохозяйственных животных является распространённой инфекционной болезнью, поражающей животных всех видов и представляющей серьёзную угрозу здоровью людей.

Уже давно стало очевидным, что успешная борьба с этой зооантропоноз-ной инфекцией в широких масштабах практически невозможна без использования средств специфической профилактики (Косилов И.А., 1985, 1992; Шумилов К. В., 1987; Салмаков К. М., 1975, 1987; Димов С. К., 1993 и др.). Необходимость их применения особо возрастает в связи с изменениями, происходящими в агропромышленном комплексе нашей страны: расформирование колхозов, совхозов, создание акционерных обществ, фермерских хозяйств, расширение и увеличение крестьянских подворий.

Существуют различные типы противобруцеллёзных вакцин, но наибольший интерес вызвали живые вакцины из штаммов В. abortus 19 и 82. В настоящее время как на крупном рогатом скоте, так и на маралах используется вакцина из слабоагглютиногенного штамма В. abortus 82. Указанная вакцина обладает достаточно высоким уровнем иммуногенности и противоэпизоотической эффективности, однако имеет и ряд недостатков, связанных, прежде всего, с нестабильностью её биологических свойств, а также абортогенностью (Димов С.К., 1993; Климанов А. И. с соавт., 1983; Новицкий А. А., 1988; Ощепков В. Г., 1998). Результаты применения этой вакцины на маралах свидетельствуют о ещё одной негативной стороне — длительном сохранении поствакцинальных реакций (от 12−18 месяцев и до 5 лет после иммунизации).

Таким образом, очевидна необходимость поиска новых, современных противобруцеллёзных вакцин. Одной из таких вакцин является вакцина из штамма В. abortus 75/79-АВ, которая была селекционирована и комплексно изучена И. П. Никифоровым (1996) на крупном рогатом скоте.

Апробация данной вакцины в производственных условиях показала, что её применение в общем комплексе противобруцеллёзных мероприятий позволяет резко ослабить напряженность эпизоотического процесса в течение 6−8 месяцев и добиться ликвидации очагов бруцеллёза крупного рогатого скота в более короткие сроки. Кроме того, вакцина не абортогенна, популяция микробных клеток однородна, угасание серологических реакций наступает через 2−3 месяца после иммунизации.

Все это позволяет считать работу с этой вакциной весьма перспективной, а её испытание на маралах — актуальным.

Цель исследований — изучить основные свойства вакцины из штамма Brucella abortus 75/79-АВ на маралах.

Для выполнения указанной цели в задачи исследования входило:

1. Изучение эпизоотической ситуации по бруцеллёзу маралов в Алтайском крае и противоэпизоотической эффективности вакцины из штамма В. abortus 82.

2. Изучение приживаемости и возможности миграции вакцинного штамма 75/79-АВ в организме маралов.

3. Изучение иммуногенных свойств вакцины из штамма В. abortus 75/79-АВ на маралах, отработка оптимальной иммунизирующей дозы.

4. Изучение сравнительной иммунологической эффективности и антигенных свойств вакцин из штаммов В. abortus 82 и В. abortus 75/79-АВ в опыте на маралах.

Научная новизна. Впервые на маралах изучены приживаемость, возможность миграций, а также иммуногенные свойства вакцины из штамма 75/79-АВ, при этом определена оптимальная иммунизирующая доза. Проведена сравнительная оценка иммуногенных и антигенных свойств вакцин из штаммов В. abortus 82 и В. abortus 75/79-АВ на маралахотработана методика эутоназии маралов миорелаксантом «Адилин-супер».

Практическая значимость. В ходе проведённых исследований разработаны рекомендации «Диагностика, профилактика и меры борьбы с бруцеллёзом маралов» (2005), утвержденные учёным советом ВНИИПО (протокол № 1 от 11 февраля 2005 г.), и рекомендованы к внедрению научно-техническим советом управления ветеринарии администрации Алтайского края (протокол № 2 от 18 марта 2005 г.).

Апробация работы. Результаты исследований доложены, обсуждены и одобрены на научно-практической конференции молодых учёных «Вопросы пантового оленеводства и болезней сельскохозяйственных животных» (г. Барнаул, 2003) — региональной научной студенческой конференции «Достижения и перспективы студенческой науки в АПК» (г. Барнаул, 2003) — Международной научно-практической конференции молодых учёных СО РАСХН «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых учёных» (Новосибирская область, п. Краснообск, 2004) — Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Новосибирская область, ГНЦ ВБ «Вектор», 2004), учёных советах ВНИИ пантового оленеводства (2001;2004) и научно-техническом совете управления ветеринарии администрации Алтайского края (2005).

Публикация результатов исследований. Основные положения диссертации отражены в 7 научных работах. Научные исследования, изложенные в диссертации, являются составной частью научных проблем Всероссийского научно-исследовательского института пантового оленеводства, тема № 02.01.01.

Выносятся на защиту:

1. Анализ эпизоотической ситуации по бруцеллёзу маралов в Алтайском крае и противоэпизоотической эффективности вакцины из штамма Brucella abortus 82.

2. Приживаемость и возможность миграции вакцинного штамма Brucella abortus 75/79-АВ в организме маралов.

3. Определение иммуногенных свойств вакцины из штамма Brucella abortus 75/79-АВ, изыскание оптимальной иммунизирующей дозы для маралов.

4. Определение сравнительной иммунологической эффективности и антигенных свойств вакцин из штаммов Brucella abortus 82 и Brucella abortus 75/79-АВ на маралах.

1. Обзор литературы.

119 Выводы.

1. Оздоровление маралоферм от бруцеллеза с применением противобру-целлёзной вакцины из штамма 82 вполне приемлемо, однако длительно сохраняющиеся серологические реакции существенно затрудняют диагностику болезни.

2. Слабоагглютиногенный вакцинный штамм В. abortus 75/79-АВ введённый в дозе 50 млрд м.к., в объёме 5 мл физиологического раствора, в область средней трети шеи, подкожно, приживается в организме маралух 4−5 летнего возраста в течение 55 дней. По результатам серологического и бактериологического исследований явления миграции штамма не установлено.

3. При иммунизации маралят вакцинным штаммом В. abortus 75/79-АВ в возрасте 6 месяце в дозах 50 и 100 млрд м.к. серологические реакции появляются независимо от дозы на 15-й день (РСК), выпадают на 33-и сутки. Защитный эффект при искусственном конъюнктивальном инфицировании животных референтным штаммом В. abortus 544 через 6 месяцев после вакцинации составил 100 и 80% соответственно. Иммунизирующей дозой для вакцинации маралов против бруцеллёза является 50 млрд м.к.

4. Из шести испытанных доз миорелаксанта «Адилин-супер» (0,09- 0,135- 0,18- 0,27, 0,36 и 0,45 г действующего вещества) доза равная 0,18 г сухого вещества в 2 мл 3,5%-ного раствора при внутримышечном введении обеспечила эутаназию подопытных животных.

5. Сравнительное изучение иммуногенных и антигенных свойств вакцин из штаммов В. abortus 82 и 75/79-АВ показало, что при одинаковой иммунизирующей дозе 50 млрд м.к. получен равный защитный эффект при искусственном конъюнктивальном инфицировании животных через 6 месяцев после иммунизации. Поствакцинальные серологические реакции у животных привитых штаммом 82, сохраняются в РА и РСК с R (bovis)-aHTHreHOM вплоть до заражения (в течение 6 месяцев), а у вакцинированных штаммом 75/79-АВ в течение 4 месяцев и только в РСК с R (bovis)-aHTHreHOM.

6. У контрольных маралят после искусственного заражения в крови повышается в 1,5−2 раза уровень содержания лейкоцитов на протяжении всего срока исследования, чаще понижается количество общего белка и альбуминов. Соответственно у вакцинированных лейкоциты не имеют чёткой динамикиколичество их то возрастает, то убывает, содержание общего белка и альбуминов также неоднозначны, но чаще повышается. При понижении или повышении альбуминов у животных всех групп гамма-глобулиновая фракция имеет противоположные значения.

7. Спустя 50 дней после искусственного заражения контрольных саюшек наблюдали увеличение в 1,5−4 раза лимфоузлов (подчелюстных, заглоточных, предлопаточных и надвыменных). Видимых изменений паренхиматозных органов (печень, селезёнка) не обнаружено. При гистологическом исследовании в лимфатических узлах контрольной группы выявлены изменения свойственные серозному лимфадениту.

Практические предложения.

1. При диагностике и ликвидации бруцеллёза маралов руководствоваться методическими рекомендациями «Диагностика, профилактика и меры борьбы с бруцеллёзом маралов» утверждённые учёным советом ГНУ ВНИИПО СО РАСХН (протокол № 1 от 11 февраля 2005 г.) и научно-техническим советом управления ветеринарии администрации Алтайского края (протокол № 2 от 18 марта 2005 г.).

2. В «Наставление по применению вакцины живой сухой из штамма Brucella abortus 75/79-АВ при бруцеллёзе крупного рогатого скота», утверждённого Департаментом ветеринарии Минсельхоза России (2003 г.), в п. 3.1.4 внести дополнения дозы для маралов 50 млрд м.к. Выделить отдельный пункт по иммунизации маралов согласно данным, изложенным в рекомендациях.

3. При серологической диагностике маралов на бруцеллёз наряду с РА и РСК рекомендуем применять РБП.

4. При проведении экспериментальных исследований на маралах с последующим их убоем и утилизацией применять миорелаксант «Адилин-супер» в дозе 0,18 г сухого вещества в 2 мл 3,5%-ного раствора, при внутримышечном введении.

Заключение

.

Во многих странах, в том числе в России, проблема искоренения бруцеллёза животных не теряет своей актуальности.

Инфекция представляет угрозу не только животным, но и человеку, так как является типичным зооантропонозом. В связи с этим борьба с бруцеллёзом имеет не только экономическое, но и социальное значение.

Заболевание регистрируется как среди мелкого и крупного рогатого скота, так и маралов.

В маралохозяйствах вакцина из штамма 82 является приемлемой для иммунизации маралов. Однако результаты практического применения вакцины свидетельствуют, что отдельные животные, иммунизированные будучи молодняком (телята), реагируют в РСК спустя 2 и более лет, а в некоторых случаях маралы могут быть серопозитивны как в РСК, так и в РА спустя 12−18 месяцев, 5 и более лет, что затрудняет диагностику болезни.

Обобщая материалы литературных данных по проблеме специфической профилактики бруцеллеза животных, можно констатировать ее ведущую роль в системе противобруцеллезных мероприятий. При этом важно иметь такую вакцину, которая бы при обеспечении длительного иммунного состояния в стадах давала возможность беспрепятственной поствакцинальной диагностики в самые короткие сроки после введения, учитывая закономерности вторичного иммунного ответа и была бы максимально экологически безопасна.

У инагглютиногенных вакцинных штаммов низок уровень иммуногенно-сти, но его можно повышать как за счёт увеличения дозы, кратности и интервалов, а также при помощи иммуномодуляторов различной природы. Однако материалов для окончательного решения данного вопроса пока недостаточно.

Живые агглютиногенные и слабоагглютиногенные вакцины обладают, по сравнению с убитыми культурами, достаточно высоким уровнем иммуногенно-сти и эпизоотически безопасны. Однако это весьма относительно в связи с высокой степенью аглютиногенности первых и нестабильностью антигенных свойств-вторых.

Определенные надежды в решении проблем, существующих при проведении специфической профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота, связывают с вакциной из слабоагглютиногенного штамма В. abortus 75/79-АВ, успешно зарекомендовавшего себя при оздоровлении неблагополучных пунктов в Алтайском крае.

2. Собственные исследования 2.1. Материалы и методы исследования.

Работа выполнялась с 2001 по 2005 гг. во Всероссийском научно-исследовательском институте пантового оленеводства, на кафедре эпизоотологии и ВСЭ ИВМ АГАУ, а также в мараловодческих хозяйствах Алтайского края.

Биологические особенности маралов и систему ведения отрасли мы описывали, руководствуясь работами B.C. Галкина, В. Н. Егеря, И. И. Миронова, П. В. Митюшова, а также основываясь на собственных наблюдениях.

Материалом для изучения и анализа эпизоотической ситуации по бруцеллёзу маралов послужили архивные данные годовой ветеринарной отчётности Алтайского края за период с 1969 по 2003 гг. При этом выясняли количество неблагополучных по данной инфекции пунктов, число исследованных и реагирующих в серологических тестах (РА, РСК) животных, вынужденно убитых и иммунизированных противобруцеллёзными вакцинами маралов.

Для изучения приживаемости и возможности миграции вакцинного штамма В. abortus 75/79-АВ в ОПХ «Новоталицкое» было взято 20 маралух 4−5-летнего возраста, раннее не вакцинированных никакими противобруцеллёзными вакцинами. Всех животных забирковали индивидуальными новозеландскими бирками и сформировали 2 группы: в I группе — 15 животных (опытные), во II группе — 5 (контрольные).

Перед закладкой опыта всех животных исследовали в реакции агглютинации (РА) и реакции связывания комплемента (РСК). Их постановка и учёт регламентированы действующим «Наставлением по диагностике бруцеллёза животных» (2000).

Взятие крови и получение сыворотки для серологических исследований (РА, РСК) проводили следующим образом: животных фиксировали в панторезном станке (при содержании в виварии ВНИИПО в специальном расколе) и с правой стороны шеи в области яремной вены выстригали шерсть, накладывали жгут, место укола дезинфицировали 70°-ным раствором спирта (фото 1). Взятие крови осуществляли кровобрательной иглой Боброва А-26×4017И52. Пробы крови отбирали в бактериологические пробирки по 10−15 мл. Для получения сыворотки их помещали в термостат на 3 часа при температуре 37 °C, после ретракции сгусток осаждали центрифугированием (1000−1500 об/мин). Сыворотку сливали и исследовали в течение 10 дней свежую либо замораживали, сохраняя в таком виде непосредственно до проведения серодиагностики.

Фото i. Взятие крови у опытных животных.

Животных опытной и контрольной групп содержали совместно на протяжении всего опыта (4 месяца). Кормление маралух осуществлялось по типовым рационам, в который входило (из расчета на 1 голову) — сена — 6−7 кг, силоса -5−6 кг, концентратов — 0,5 кг, соли — 15−18 г. Общая питательность суточного рациона составила 3,9−4,2 к, ед., что удовлетворяет потребностям для данной возрастной группы. Источником питьевой воды в зимнике служил ручей.

Иммунизацию маралух опытной группы проводили комиссионно, в панторезном станке. Вакцину из штамма В. abortus 75/79-АВ вводили подкожно, в область средней трети шеи, в дозе 50 млрд м.к., в объёме 5 мл. Разводили данный препарат в стерильном остуженном физиологическом растворе (0,85%-ный) из расчета одна доза для крупного рогатого скота в 10 мл растворителя. Шерсть на месте инъекции предварительно выстригали ножницами, а кожу обрабатывали 70° спиртом.

Динамику появления и угасания серологических реакций изучали, исследуя сыворотку крови в РА и РСК с единым бруцеллёзным биофабричным Sи R (ovis)-aHrareHOM (изготовленный 15.01.2003 г. НПФ «Биоцентр», г. Омск, серия 1, контроль 1, срок годности 12 месяцев).

Сыворотку крови исследовали на 15, 33, 55, 89 и 122 день после иммунизации. В каждый срок, после забора крови, проводили убой 4 маралух (3 из опытной и 1 из контрольной групп) с последующим отбором биоматериала и бактериологическим исследованием. От каждого животного были взяты следующие органы: парные лимфатические узлы (подчелюстные, заглоточные, околоушные, предлопаточные, паховые, надвыменные, бронхиальные, тазовые, мезентериальные, парааортальные), непарные (средостенный и портальный), а также печень и селезёнка.

Высевы из каждой пробы проводили на питательные среды, предварительно проверенные на ростовые качества: мясопептонный печёночный глюко-зо-глицериновый бульон (Ml 11Ш Б) и агар (МППГГА). Приготовление указанных питательных сред и методика посева регламентировано действующим «Наставлением по диагностике бруцеллёза животных» (2000).

Посевы инкубировали в термостате в течение 30 суток при температуре 37−38°С. Первичный осмотр проводили через сутки. В дальнейшем посевы просматривали каждые 3−4 суток визуально, при необходимости через лупу. На 7-й и 14-й день инкубирования их орошали посевным материалом и трижды учитывали результаты.

Выделенные культуры идентифицировали по тинкториальным (окраска мазков по Козловскому), морфологическим, культуральным свойствам и в реакции агглютинации на стекле с использованием набора компонентов для серологической дифференциации бруцелл. Методика окраски, а также постановка и учёт реакции регламентированы действующим «Наставлением по диагностике бруцеллёза животных» (2000).

Для изучения иммуногенных свойств вакцины из штамма В. abortus 75/79-АВ и определения оптимальной иммунизирующей дозы в ОПХ «Новота-лицкое» были сформированы 3 группы телят (6-месячного возраста) по 5 в каждой: I и II группы — опытные, III — контрольная. Всех животных забирковали индивидуальными новозеландскими бирками с последующим взятием крови для серологического исследования в РА и РСК. После получения отрицательных результатов нами была проведена закладка эксперимента.

Содержание телят маралов всех групп было совместное на протяжении всего опыта: в течение 6 месяцев в отдельном зимнике на маралоферме «Покровка», а по истечении данного срока в виварии ВНИИПО. Кормление животных в зимний период осуществлялось по типовым рационам, в который входило (из расчета на 1 голову): сена — 2,5−3 кг, силоса — 2−3 кг, концентратов — 1 кг, соли — 15−18 г. Общая питательность суточного рациона составила 2,2−2,5 к.ед., что удовлетворяет потребностям для данной возрастной группы. Источником питьевой воды служил ручей, текущий через зимник.

В виварии ВНИИПО телят кормили луговой травой (фото 2).

Корм задавали три раза в день по 10 кг, что составило по питательности 2,0−2,5 к.ед. (из расчёта на 1 голову). Воду для питья наливали при помощи шланга в специальную поилку. Источником соли служил «лизунец», расположенный в углу вивария.

Фото 2. Кормление опытных саюшек в виварии ВНИИПО.

Кормление и поение животных после инфицирования проводили в специальной одежде, которую по завершении опыта автоклавировали. Перед виварием был устроен дезбарьер с раствором едкого натра (3−5%-ный). При взятии крови использовали халаты и одноразовые перчатки. Кровобрательные иглы после очередного забора крови обеззараживали кипячением. Руки исследователей обрабатывали раствором хлорамина (1%-ный) или спиртом (70°).

Иммунизацию телят опытных групп проводили комиссионно, в панторезном станке. Вакцину из штамма В. abortus 75/79-АВ вводили подкожно, в область средней трети шеи, в объёме 5 мл, в дозе 50 млрд м.к. (животным первой группы) и 100 млрд м.к. (телятам второй группы). Разводили данный препарат в стерильном остуженном физиологическом растворе (0,85%-ный) из расчета одна доза для крупного рогатого скота (100 млрд м.к.) в 10 и 5 мл растворителя соответственно. Предварительно шерсть на месте инъекции выстригали ножницами, а кожу обрабатывали 70и спиртом.

Динамику появления и угасания серологических реакций изучали, исследуя сыворотку крови в РА и РСК с единым бруцеллёзным биофабричным Sи R (ovis)-aHTHreHOM на 15, 33, 55, 89, 122, 143 день после иммунизации, а также перед заражением и через 16, 22, 28, 35, 41 день после него.

Кроме того, для определения естественной резистентности телят были проведены исследования морфобиохимического состава крови по общепринятым методикам. Пробы крови отбирали в пробирки Флоринского в количестве 3−4 мл с добавлением антикоагулянта трилона-Б (3−4 капли). В цельной крови определяли общее количество лейкоцитов и эритроцитов (в камере Горяева в 1 мкл крови) — в сыворотке крови: содержание общего белка — рефрактометрическим методом (ИФР-22), фракции белка — нефелометрическим методом по И. П. Кондрахину (1985).

Технология взятия крови и приготовление образцов сыворотки подробно описана в предыдущем опыте.

Заражение животных патогенным штаммом В. abortus 544 (музейный штамм, ГНУ ВНИИБТЖ СО РАСХН) с целью проверки иммунитета проводили через 6 месяце после иммунизации, комиссионно, с соблюдением правил работы как с маралами, так микроорганизмами. Для этого всех телят перевезли из ОПХ «Новоталицкое» в виварий ВНИИПОкаждое животное фиксировали в специальном расколе силой 3 человек, 4-й наносил суспензию в объёме 0,1 мл на конъюнктиву каждого глаза с последующим растиранием (фото 3). Инфицирующая доза была равна 15 млн м.к., что составило 7,5 млн м.к. бруцелл в 0,1 мл.

Суспензию из патогенного штамма готовили путём последовательных разведений взвеси бруцелл в физиологическом растворе (по стандарту мутности).

Фото 3. Заражение телят патогенным штаммом бруцелл.

Убой животных проводили по истечении 41 дня после заражения при помощи миорелаксанта «Адилин-супер» (изготовленный ООО «Ветбиосервис», г. Казань, партия № 1, дата выпуска 26.05.2002 г., срок годности — 18 мес.). Раствор в концентрации 3,5% вводили внутримышечно, в среднюю треть шеи в объеме 1, 1,5, 2, 3, 4 и 5 мл на животное, что составило, соответственно, дозу 0,09- 0,135- 0,18- 0,27- 0,36 и 0,45 г сухого вещества. Во время эксперимента вели учет: температуры тела, частоты дыхания, сердечных сокращений, акта ру-менации, глазного и болевого рефлекса, тактильной чувствительности, а также времени начала действия препарата и наступления летального исхода.

Указанные клинические методы исследования проводили по общепринятым в ветеринарии методам.

Патологическую картину бруцеллёза у вынужденно убитых телят маралов изучали методом полного патологоанатом и чес кого вскрытия по методике МС. Жакова (1977).

Вскрытие с последующим отбором биоматериала и бактериологическим исследованием, а также утилизацию животных проводили на скотомогильнике учхоза «Пригородное». От каждого животного были взяты следующие органы: парные лимфатические узлы (подчелюстные, заглоточные, околоушные, пред-лопаточные, паховые, надвыменные, бронхиальные, тазовые, мезентериальные, парааортальные), непарные (средостенный и портальный), а также печень и селезёнка.

Высевы из каждой пробы проводили на питательные среды, предварительно проверенные на ростовые качества: мясопептонный печёночный глюко-зо-глицериновый бульон (МППГГБ) и агар (МППГГА) — фото 4. Методика посева регламентирована действующим «Наставлением по диагностике бруцеллёза животных"(2000).

Фото 4. Лабораторные исследования.

Посевы инкубировали в термостате в течение 30 суток при температуре 37−38°С. РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННА. ¦

41 *.

Первичный осмотр проводили через сутки. В дальнейшем посевы просматривали каждые 3−4 сутки визуально, при необходимости через лупу. На 7-й и 14-й день инкубирования их орошали посевным материалом и трижды учитывали результаты.

Выделенные культуры идентифицировали по тинкториальным (окраска мазков по Козловскому), морфологическим, культуральным свойствам и в РА на стекле. Пластинчатую РА на стекле изучали Sи R-бруцеллёзными сыворотками и трипофлавином.

Методика окраски, а также постановка и учёт реакции регламентирован действующим «Наставлением по диагностике бруцеллёза животных» (2000).

Для изучения иммунологической эффективности и антигенных свойств вакцин из штаммов В. abortus 82 и В. abortus 75/79-АВ в ОПХ «Новоталицкое» были сформированы 3 группы телят (6-месячного возраста) по 5 в каждой: I и II группы — опытные, III — контрольная. Всех животных пометили индивидуальными новозеландскими бирками и произвели взятие крови с последующим серологическим исследованием сыворотки в РА и РСК. После получения отрицательных результатов в тест-системах была проведена закладка опыта.

Содержание телят маралов всех групп, на протяжении всего опыта, было совместное: в течение 6 месяцев в отдельном зимнике на маралоферме «Покровка», а по истечении — в виварии ВНИИПО. Кормление животных в зимний период осуществлялось по типовым рационам, в который входило (из расчета на 1 голову): сена — 2,5−3 кг, силоса — 2−3 кг, концентратов — 1 кг, соли — 15−18 г, что по питательности составило 2,2−2,5 к.ед. Источником питьевой воды служил ручей, текущий через зимник.

В виварии ВНИИПО телят кормили луговой травой. Корм задавали три раза в день по 10 кг, что составило по питательности 2,0−2,5 к.ед. (из расчёта на 1 голову). Воду для питья наливали при помощи шланга в специальную поилку. Источником соли служил «лизунец».

Кормление и поение животных после инфицирования проводили с соблюдением санитарных правил.

Иммунизацию телят опытных групп проводили комиссионно, в панторезном станке. Вакцину из штаммов В. abortus 82 и 75/79-АВ вводили подкожно, в область средней трети шеи, в объёме 5 мл, в дозе 50 млрд м.к. Разводили данные препараты в стерильном остуженном физиологическом растворе (0,85%-ный) из расчета одна доза для крупного рогатого скота (100 млрд м.к.) в 10 мл растворителя. Предварительно шерсть на месте инъекции выстригали ножницами, а кожу обрабатывали 70° спиртом.

Реактогенные свойства вакцины изучали в течение 13 дней путем пальпации места инъекции. При этом учитывали болезненность, температуру на месте введения препарата, размеры отечности и её консистенцию, также проводили термометрию опытных и контрольных животных по известной в ветеринарии методике. Кроме этого нами были проведены наблюдения за общим состоянием животных.

Динамику появления и угасания серологических реакций у подопытных животных изучали, исследуя сыворотку крови на бруцеллез в РБП, РА и РСК с единым бруцеллёзный биофабричный Sи R (bovis, оу1з)-антигенами до вакцинации и через 5, 10,13, 29, 62, 91, 125, 153 дня после нее, а также перед заражением (спустя 6 месяцев) и через 7, 14, 21, 28, 35, 42, 50 дней после заражения. Постановка и учёт указанных методов проводили согласно регламентированным методикам. При постановке РБП использовали цветной антиген (антиген бруцеллёзный для РБП, производства Щёлковского биокомбината, серия 4, годен до 12.2005 г.). Для РСК использовали R (ovis) — производства НПФ «Биоцентр», г. Омски R (bovis)-aHTHreHbi — производства ВНИИБТЖ (из штамма 16/4, JI.B. Дегтяренко).

Кроме того, для определения естественной резистентности телят были проведены исследования морфобиохимического состава крови по общепринятым методикам.

• Заражение животных патогенным штаммом В. abortus 544 (музейный штамм, ГНУ ВНИИБТЖ СО РАСХН) с целью определения иммунологической эффективности вакцин из штаммов 82 и 75/79-АВ проводили через 6 месяцев после иммунизации. Для этого всех телят перевезли из ОПХ «Новоталицкое» в виварий ВНИИПОкаждое животное фиксировали в специальном расколе силой 3 человек, 4-й наносил суспензию в объёме 0,1 мл на конъюнктиву каждого глаза с последующим растиранием. Инфицирующая доза была равна 30 млн м.к., что составило 15 млн м.к. бруцелл в 0,1 мл.

Суспензию из референтного штамма 544 готовили по аналогии с предыдущим опытом.

Убой животных проводили по истечении 50 дней после заражения при помощи миорелаксанта «Адилин-супер» (3,5%-ный). Раствор вводили внутримышечно, в среднюю треть шеи, в объеме 2,0 мл на животное, что составило дозу 0,18 г действующего вещества.

Патологическую картину бруцеллёза у вынужденно убитых телят маралов изучали по методике М. С. Жакова (1977).

Вскрытие с последующим отбором биоматериала и бактериологическим исследованием, а также утилизацию животных проводили на скотомогильнике учхоза «Пригородное». От каждого животного были взяты, как и в предыдущем опыте, парные и непарные лимфатические узлы, а также печень и селезёнка.

Высевы из каждой пробы проводили на питательные среды, предварительно проверенные на ростовые качества: мясопептонный печёночный глюко-зо-глицериновый бульон (Ml И 11 1 Б) и агар (Ml И111 А). Методика посева регламентирована действующим «Наставлением по диагностике бруцеллёза животных» (2000).

Посевы инкубировали в термостате в течение 30 суток при температуре 37−38°С. Первичный осмотр проводили через сутки. В дальнейшем посевы просматривали каждые 3−4 сутки визуально, при необходимости через лупу.

На 7-й и 14-й день инкубирования их орошали посевным материалом и трижды учитывали результаты.

Выделенные культуры идентифицировали по тинкториальным (окраска мазков по Козловскому), морфологическим, культуральным свойствам и в РА на стекле. Пластинчатую РА на стекле изучали с Sи R-бруцеллёзными сыворотками и трипофлавином.

Патоморфологические изменения макрокартины органов при экспериментальном бруцеллезе изучали на секции у животных визуально, а микрокартины — при анализе микроструктуры приготовленных гистологических срезов под 56-кратным увеличением биологического микроскопа МБИ-1. Методика приготовления гистосрезов подробно описана в соответствующем разделе. При описании микрокартины руководствовались атласом микроскопического и ультрамикроскопического строения клеток, тканей и органов.

Полученный цифровой массив подвергался стандартной статистической обработке в операционной системе Windows 2000 ХР на PC Pentium 4 с помощью программы Microsoft Excel 2000 г.