Генетические основы и методы биохимической диагностики наследственных болезней обмена веществ

Наследственные болезни обмена веществ (НБ0) — обширная группа моногенно наследующихся болезней человека. Практическое значение их исследования определяется чисто медицинскими аспектами, т. е. необходимостью разработки методов диагностики, лечения, профилактики этих заболеваний, представляющих серьезную проблему для современного здравоохранения. С другой стороны, НБО — типичные «биохимические» мутации человеческого генома — являются мощным инструментом исследования нормального метаболизма человека, характеризующегося большой сложностью и большим числом «белых пятен» на своей карте. Являясь одной из наиболее бурно развивающихся ветвей современной медицинской биохимической генетики, исследования НБО способствуют решению важных медицинских проблем (снижение детской заболеваемости и смертности) и развитию генетики, в частности, генетики человека (исследование структурной организации генома, молекулярного механизма мутаций, биохимического полиморфизма популяций, картирование генов на хромосомах и т. д.).

Актуальность теш.

Снижение детсксй заболеваемости и смертности является одной из кардинальных проблем советского здравоохранения. Благодаря разработке и внедрению в практику успешных мер борьбы с инфекционными и алиментарными болезнями наследственная патология становится одним из важных этиологических факторов детской заболеваемости и смертности, причиняя также тяжелый моральный ущерб отягощенным семьям /4,8,10,22/. Из -2500 моногенных наследственных болезней каталогизированных Маккьюсиком /264/ на 1978 г., более 600 нозологических единиц составляют НБО. Доминирующая часть последних представлена летальными и сублетальными формами и манифестирует в детском возрасте. На НБО приходится 11−17% госпитализаций и 8,5% смертности в крупных педиатрических клиниках экономически развитых стран /164,347/. Характерные особенности этой группы заболеваний — выраженная генетическая гетерогенность, клинический полиморфизм, наличие гено-и фенокопий — создают большие трудности для их диагностики. Тем не менее, решение всех практических и теоретических задач, связанных с НБО, требует их точной диагностики, т. е. локусной и, во многих случаях, аялельной идентификации, основанной на применении биохимических методов. В течение 20-летнего периода (начиная с 1964 г.) интенсивных исследований НБО была выработана специфическая стратегии их биохимической диагностики. Она включает использование программ массового и селективного просеивания для предположительного выявления НБО с последующей подтверждающей диагностикой. Последняя использует самые современные методы биохимии и смежных с нею дисциплин и нередко представляет самостоятельное научное исследование /4,11,22,33,87,179/.

По приказу M3 СССР В 813 от 1939 г. в стране была создана сеть кабинетов по медико-генетическому консультированию, а по приказу te 1120 от 1979 г. эта сеть была принципиально расширена. Поскольку в обязанности кабинетов входит выявление больных с НБО, это ставит задг. чу создания программ селективного просеивания на НБО с максимальной адаптацией ее к реальным возможностям организации медико-генетической службы на базе областных и республиканских больниц.

НБО характеризуется выраженной неравномерностью их этнического распространения, что проявляется и на локусном и на аллель-ном уровне. В связи с разработкой эффективных методов лечения и профилактики все возрастающей группы НБО изучение их геногеог-рафии в Советском Союзе с разнообразным этническим и национальным составом является очень актуальным. Существование географических, языковых, родовых, национальных и др. барьеров способствовало многочисленной подразделенности населения страны и формированию региональных особенностей груза наследственной патологии, сказавшихся на частоте и спектре НЕО /8,19/.

Из Есего вышеизложенного делается очевидным, что перед здравоохранением каждой страны стоит задача самостоятельной разработки и применения, программ выявления и подтверждающей диагностики НБО. Необходимость разработки таких программ вытекает из потребностей медгко-генетического консультирования отягощенных семей, включая, дородовую диагностику, и актуально для планирования органами здравоохранения мер первичной и вторичной профилактики НБО. Внедрение просеивающих программ в практику требует существеннш: бюджетных ассигнований и является делом органов здравоохранения. Разработка же (методическая и организационная) просеиваищих программ нуждается в проведении определенных научных исследований и осуществляется в рамках научно-исследовательских учреждений. При этом должны решаться в первую очередь такие научные и практические задачи, как определение частоты и спектра НБО в популяциях, выяснение популяционно-ге-нетических закономерностей регионального распространения НБО, изучение генетической гетерогенности НБО в регионах, методическая адаптация просеивающих программ к материальным возможностям и организационной структуре службы здравоохранения. Иными словами, научно-исследовательские разработки должны дать органам здравоохранения ответ на вопросы, какие НБО, как и где нужно выявлять и доводить до клинического диагноза. Находясь у истоков создания отечественных программ массового и селективного просеивания, мы сосредоточили свои усилия на решении этих задач, разработав ряд программ селективного просеивания и подтверждающей диагностики и применив их к обследованию контингентов повышенного риска, т. е. контингентов с ожидаемым накоплением ИБО, и популяционных Еыборок.

Делъ и задачи исследования. Основном целью данной работы являлась разработка и реализация подходов к локусной и аллель-ной идентификации некоторых групп ИБО и изучение особенностей популяционного распространения последних в разных этнических группах Советского Союза. При этом решались следующие конкретные задачи:

1. Разработать программы селективного просеивания и подтверкдающ щей диагностики ЕБО для контингента детей с отставанием в ум- -ственном и физическом развитии и больных с несфероцитарными гемолитическими г немиями.

2. Определить спектр НБО в контингентах повышенного риска и порядок региональных частот некоторых ИБО путем обследования этих контингентов и выборок из популяций.

3. Изучить генетическую гетерогенность недостаточности эритро-цитарной глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФД) у гематологических больных и в выборках здоровых лиц из разных этнических групп СССР.

4. Изучить генетические закономерности распространения аллелей йсГ в разных этнических группах.

5. Изучить генетическую гетерогенность и особенности геногеог-рафии болезней накопления гликозаминогликанов (ГАГ) в СССР.

Научная новизна и практическая значимость. Основная часть конкретных результатов исследования получена впервые. Это касается характеристики частот, спектра и геногеографии НБО в стране. Для оценки этих параметров были применены практически все возможные виды селективного просеивания на НБО, что позволило сформулировать генетические закономерности их популяционного распространения.

Впервые в СССР были изучены особенности популяционного распространения некоторых НБО — фенилкетонурии (ФКУ), недостаточно-, сти эритроцитарной ГЗФД, болезней накопления ГАГ. Впервые был определен порядок частоты ФКУ в центральноевропейском регионе страны, показана целесообразность и созданы методические предпосылки массового просеивания на эту НБО. Справедливость Еывода о целесообразности массового просеивания на ФКУ впоследстврги была подтверждена при организации массового просеивания на ФКУ в БССР, Литве и Латвии /30 /. В ряде этнических групп страны определена частота недостаточности эритроцитарной Г6ФД и показана неравномерность этнического распространения аллелей вс (~ .

Впервые в СССР была разработана методическая база для ло-кусной и аллельной идентификации некоторых групп НБО и исследована их генетическая гетерогенность. Проведено аллельное типиро-вание по локусу &-сС как среди гематологических больных, так и в выборках здоровых луц из разных этнических групп. Всего в ходе данного исследовании было изучено 69 аллелей по локусу, идентифицировано 27 разных аллелей, из них 20 ранее не описано в литературе. Все аллели из числа последней группы, включены в Международную классификацию аллелей С-Ы. /380,381/. Сопоставление частот и спектров аллелей в трех этнических группах наряду с анализом генетических факторов, влияющих на эти параметры, позволило сформулировать гипотезу о закономерностях распространения аллелей в разных популяциях. Разработанная программа исследования метаболизма ГАГ позволила выявить его нарушения при других формах врожденной патологии скелета (не относящихся к болезням накопления ГАГ) и показать их генетическую гетерогенность. Эти данные важны для прогресса биохимической генетики в исследовании наследственной патологии соединительной ткани.

Основное значение данной работы состоит в создании научных и методических предпосылок для внедрения программ массового и селективного просеивания в практику здравоохранения СССР. Нами было разработано и внедрено в практику медико-генетического консультирования страны в виде методических рекомендаций («Методические рекомендации по выявлению наследственных болезней обмена», «Методические рекомендации по клинико-биохимической диагностике мукополисахаридозов») ряд программ селективного просеивания на НБО. Программы предназначены для двух контингентов повышенного риска — контингента детей с отставанием в умственном и физическом развитии и больных с несфероцитарными гемолитическими анемиями. Для каждой из этих программ были созданы, соответственно, программы подтверждения диагноза НБО. Все эти программы были апробированы при обследовании более 4000 больных с подозрением на НБОинтернированных в спецучреждения, обращавшихся в Центр по медико-генетическому консультированию Института медицинской генетики АМН СССР. Это позволило диагностировать 293 случая НБО, представленных 33 нозологическими формами, и на основании диагноза дать медико-генетическую консультацию отягощенным семьям. Поскольку к началу нашего исследования биохимическая диагностика НБО в стране только начиналась, многие нозологические единицы из класса НБО были диагностированы впервые в СССР.

Результаты данной работы использованы для разработки и решения некоторых задач, предусмотренных 4-мя темами научно-технической проблемы 0.69.07 на 1981;1985 гг. ГКНТ при СМ СССР, а именно: «Изучить закономерности реализации генетической информации при моногенных наследственных болезнях обмена веществ на уровне биохимических дефектов», «Разработать медико-генетические карты распространенности ряде наследственных болезней в СССР», «Изучить молекулярно-генетическую природу наследственных болезней», «Разработать и апробировать новые методы раннего выявления наследственных дефектов обмена веществ». Научно-методические разработки данного исследования использованы при планировании мер по улучшению биохимической диагностики НБО в стране в готовящемся приказе Минздрава СССР «О мерах по дальнейшему улучшению медико-генетической помощи населению'.' Один из разделов данного исследования, посвященный разработке и внедрению программ селективного просеивания и подтверждающей диагностики в практику медико-генетического консультирования, награжден серебряной медалью ВДНХ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Биохимическая генетика исследует генетический контроль сложнейшего метаболизма живых организмов, насчитывающего сотни различных, но взаимодействующих друг с другом метаболических путей. С 40-х гг. XX Еека — даты рождения биохимической генетики как науки — достигнуты огромные успехи в исследовании нормального метаболизма и его генетического контроля у человека, хотя количество «белых пятен» все еще очень велико. По сравнению с другими разделами генетики биохимическая генетика требует владения уникально большим количеством методов и организации уникально разнообразного производства по обеспечению реактивами и приборами этих исследований. Поскольку к настоящему времени большинство метаболических путей человека уже маркировано тем или иным числом НБО, то все трудности, стоящие перед биохимической генетикой, наследует и ее ветвь — медицинская биохимическая генетика. Однако, развитие последней связано с охраной здоровья населения и необходимо для нужд здравоохранения каждой страны. Путь преодоления этих трудностей и одновременно важнейшая задача отечественной медицинской биохимической генетики видится в: I) создании методической базы для анализа постепенно увеличивающегося числа метаболических путей и 2) применении этой базы для изучения природы патологических генных мутаций у человека и создания методов их диагностики.

Данное исследование является примером такого подхода к решению задач, стоящих перед отечественной медицинской биохимической генетикой. В нем сформулирован общий методологический принцип стратегии биохимической диагностики НБО от простых просеивающих методов до локусной и аллельной дифференциации. Для практической реализации этого подхода в соответствии с задачами исследования нами были использованы практически все методические разновидности селективного просеивания на ИБО, включая просеивание в контингентах повышенного риска и в популяциях.

Основная направленность и значение данного исследования — в проведении методических и научно-исследовательских разработок для планирования органами здравоохранения мер по диагностике, профилактике и лечению ИБО. Практическая значимость и перспективы использования данного исследования многоплановы. Оно создало базу для развертывания в стране выявления и диагностики широкого спектра ИБО. Было разработано, апробировано и внедрено в практику медико-генетического консультирования страны ряд программ селективного просеивания и подтверждающей диагностики ИБО. Эти программы адаптированы к возможностям службы здравоохранения страны и позволяют диагностировать аминоацидопатии, гликозурии, сфинго-лшшдозы, гликопротеидозы, мукополисахаридозы, эритровдтарные энзимопатии. Методы, использованные нами для локусной дифференциации ИБО, в большинстве случаев могут быть использованы для их дородовой диагностики — самого эффективного на сегодняшний день метода профилактики летальных и сублетальных форм ИБО. Таким образом, использованные наш программы селективного просеивания и подтверждения диагноза ИБО не только позволяют уточнить диагноз, дать семье грамотное медико-генетическое консультирование, но и обеспечивают возможность дородовой диагностики обширной группы ИБО.

Был определен спектр и порядок частот некоторых ИБО в ряде регионов страны и показана неоднородность их этнического распространения. Дальнейшее внедрение разработанных нами программ селективного просеивания на ИБО в практику медико-генетической службы страны должно способствовать уточнению региональных особенностей груза наследственной патологии и планированию научно обоснованных мероприятий по выявлению, лечению и профилактике НБО,.

Была доказана целесообразность массового просеивания новорожденных на ФКУ в регионах страны с европеоидным населением и созданы методические и организационные предпосылки для его реализации. Полученные нами данные о частоте и геногеографии ФКУ и накопленный методический опыт ее выявления стимулировали внедрение программ массового просеивания новорожденных в Литве, Латвии, БССР, Москве, Ленинграде, Краснодаре, Орле. Они положены также в основу готовящегося по Минздраву СССР приказа о массовом обследовании новорожденных на ФКУ в рамках страны.

Была решена впервые в СССР задача локусной дифференциации болезней накопления ГАГ и заложены основы организации медико-генетической помощи семьям, отягощенным этими сублетальными формами НБО с высокой суммарной частотой, для которых не разработано доступных методов терапии.

Была решена впервые в СССР задача аллельной идентификации при недостаточности эритроцитарной Г6ФД. Это имеет практическое значение для регионов с высокой частотой дефекта, поскольку обеспечивает данные для оценки риска применения лекарственных препаратов, обладающих потенциальным гемолитическим действием. Особенно важно это для мальчиков-гемизигот, которым предстоит отбывать воинскую повинность в разных регионах страны, где медицинская служба могла не сталкиваться с этой наследственной патологией. Поэтому завершающим этапом всех наших экспедиционных обследований являлось чтение лекций для медперсонала данного региона и передача списков выявленных больных и отягощенных семей районной или областной службе здравоохранения с дачей соответствующих рекомендаций.

Наконец, семьи больных с НБО, диагностированных в ходе данного исследования" получили медико-генетическую консультацию.

Теоретическое значение данного исследования определяется в основном результатами изучения генетической гетерогенности эрит-роцитарной Г6ФД и болезней накопления ГАГ. Типирование аллелей G-сГ позволило получить интересные данные о генетической гетерогенности этого дефекта и проанализировать закономерности их распространения в разных этнических группах страны. В результате была сформулирована гипотеза о доминирующей роли отдельных генетических факторов в формировании частоты и спектра аллелей Gd~~ в разных популяциях. Согласно этой гипотезе у русских доминирующую роль играет мутационный процесс, у азербайджанцев — естественный < отбор и инбридинг, у евреев-ашкенази — генный дрейф. В ходе исследования генетической гетерогенности ГбФД-недостаточности наш было изучено 69 мутантных форм Г6ФД и открыто 20 новых аллелей Gd, включенных в международную классификацию. Наконец, ГбФД-недостаточность выполнила функции модели для исследования генетической гетерогенности наследственных энзимопатий. Удобство этой модели определялось монолокусным контролем реализации ферментного фенотипа и моноаллельным контролем его экспрессии у гемизигот. Освоение этой модели создало базу для решения задачи локусной и аллель-ной дифференциации других энзимопатий, требующей разработки более сложных методических подходов. Типирование аллелей G-d" в этнических группах в будущем может быть использовано в качестве модели .для изучения динамики генетического груза в популяциях /190/.

Изучение генетической гетерогенности болезней накопления ГАГ с помощью разработанной нами методической программы выявило нарушение метаболизма ГАГ и при других видах системной патологии скелета. Это привело к разработке принципов выявления наследственных нарушений метаболизма протеогликанов при врожденных пороках развития скелета и системной его патологии, развивающейся постнаталь-но. Исходя из этих принципов, была разработана методическая программа /56/, предназначенная для расшифровки первичного биохимического дефекта в группе моногенно наследующихся болезней, насчитывающей «80 нозологических единиц. Расшифровка этиопатогенеза НБО, в свою очередь, всегда способствует обогащению знаний о нормальном метаболизме человека, демонстрируя неразрывность связи практических и научных аспектов изучения НБО.

Использование программ селективного просеивания и подтверждения диагноза НБО также имеет теоретический аспект, т.к. будучи интегрированными в структуру здравоохранения, они создают базу для изучения динамики генетического груза в популяциях и факторов, на нее влияющих.

Опыт по выявлению и диагностике НБО, накопленный наш при постоянном контакте с кабинетами по медико-генетическому консультированию, позволяет сделать и некоторые организационные выводы, имеющие отношение к будущему медико-генетической службы страны. Становится очевидным, что для такой большой страны как СССР с выраженной неравномерностью регионального распространения НБО необходимо создание региональных медико-генетических центров по принципу численности населения (100−150 тыс. новорожденных в год). Эти центры могут быть созданы на базе кабинетов по медико-генетическому консультированию соответствующего региона при областных, краевых и республиканских больницах. В их обязанности должно входить в плане НБО не только селективное просеивание, но также массовое просеивание на ФКУ (в будущем — на гипотиреоз и другие НБО), подтверждение диагноза и биохимический контроль за лечением. Необходимо также создание 2−3 референсных центров в стране, хорошо оснащенных реактивами и оборудованием, осуществляющих подтверждающую и пренатальную диагностику НБО и контроль за качеством диагностики в региональных центрах и кабинетах по медико-генетическому консультированию. Каждый из этих референсных центров должен специализироваться по определенным видам метаболизма.