Чувствительность эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В к химиопрепаратам

В настоящее время грипп остается глобальной проблемой. Во время обьиных ежегодных эпидемий гриппом заболевает от 5 до 15% населения Земли, а во время пандемий гриппа это число может возрастать в 4−6 раз. Практически все эпидемии гриппа сопровождаются увеличением смертйости. По данным экспертов ВОЗ, ежегодно в мире только тяжелыми формами гриппа заболевает от 3 до 5 млн. человек, а погибает от 250 000 до 500 000 человек [36,94]. Эпидемии гриппа наносят также огромный экономический ущерб, как отдельным лицам, так и обществу в целом. По данным Роспотребнадзора Минздравсоцразвития, в России в 2002 году экономический ущерб от гриппа и ОРВИ превышал 51 млрд. рублей, а в 2004 году уже составлял 82,6 млрд. рублей [15]. В США в последние годы экономический ущерб от эпидемий гриппа составлял от 71 до 167 млрд. долларов ежегодно [94].

Современный эпидемический процесс, обусловленный циркуляцией вирусов гриппа A (H3N2), A (H1N1) и В, во многом определяется степенью изменчивости их поверхностных белков — гемагтлютининов (НА) и нейраминидаз (NA). С одной стороны, поверхностные белки — НА и NA подвергаются постоянным изменениям, приводящим к постепенному вытеснению ранее циркулировавших среди людей штаммов вирусов гриппа. С другой стороны, сегментированная структура генома способствует формированию реассортантов между вирусами гриппа, А человека, млекопитающих и птиц, что, в свою очередь, может привести к возникновению нового пандемического варианта [6,18,27,50,123]. Участившиеся в последние годы случаи инфицирования людей и животных вирусами гриппа птиц A (H5N1), A (H7N7), A (H7N3) и A (H9N2) в странах Южной и Юго-Восточной Азии, а в последнее время и в странах Европы, сопровождающиеся высокой смертностью, могут привести к возникновению пандемического варианта вирусов гриппа, А [89 104,134,141,145,154].

Наряду с вакцинами, являющимися в настоящее время ведущим средством профилактики гриппозной инфекции, важное значение, особенно в последнее время, имеют химиопрепараты со специфической активностью в отношении вирусов гриппа, А и В. К преимуществам химиопрепаратов можно отнести их значительно меньшую, чем у вакцин, зависимость от постоянной изменчивости вирусов гриппа, что увеличивает их роль в борьбе с гриппом в случае формирования и распространения нового пандемического варианта.

В России спектр препаратов, обладающих выраженной противогриппозной активностью, представлен блокаторами М2-белка вирусов гриппа, А (ремантадин и альгирем), ингибитором слияния липидной оболочки вирусов гриппа, А и В с мембранами эндосом арбидол) и ингибитором нейраминидаз вирусов гриппа, А и В (озельтамивир или Тамифлю&trade-) [ 11−13,25,78,82,85,106Д42,147,162,169,.

Одним из препаратов, широко используемых на протяжении многих лет для лечения и профилактики гриппа А, как в России, так и за рубежом, является ремантадин. Однако, быстрое формирование резистентных к нему штаммов вирусов гриппа, А (особенно на фоне проводимого лечения) снижает эффективность его применения [54,70,76,80,85,125].

Результаты исследований, проведенных в период 1982;1995 гг. в разных странах мира, подтвердили факт циркуляции в естественных условиях резистентных к ремантадину штаммов вирусов гриппа А, число которых составляло менее 1,0%. [177].

В сезоне 2003;2004 гг. в ряде стран мира (Китай, Таиланд, США и др.) отмечено 30-кратное увеличение числа естественно циркулирующих штаммов, резистентных к ремантадину [58,59,130]. По последним сообщениям американских коллег, проводивших изучение чувствительности вирусов гриппа А, изолированных в период октября 2005 г. -середины января 2006 г., число резистентных штаммов составило 91,0%, что стало причиной запрета применения амантадина для лечения и профилактики гриппа в США в эпидемическом сезоне 2005;2006 гг. [59]. При этом в нашей стране в течение длительного периода времени такие исследования не проводили и данных в литературе не представлено. Необходимо также отметить, что с 2003 г. большинство штаммов вируса гриппа птиц A (H5N1), выделенных от диких и домашних птиц, а также людей, инфицированных этим подтипом вируса, были резистентны к ремантадину/амантадину [63,84].

Другим препаратом, обладающим прямым противовирусным действием, является отечественный химиопрепарат арбидол. Опыт 15-летнего использования арбидола в медицинской практике подтвердил эффективность и безвредность этого препарата. Высокая профилактическая и терапевтическая эффективность арбидола обусловлена его вирусспецифической активностью в отношении вирусов гриппа и ряда возбудителей ОРВИ, а также иммуномодулирующим, интерферониндуцирующим и антиоксидантным действием [2,4,8,9,11,21,39,40,45,48,74]. В опытах in vitro и in vivo показана его ингибирующая активность по отношению к ранее циркулировавшим вирусам гриппа, А и В. Определенный интерес представляло изучение спектра активности арбидола в отношении новых антигенных вариантов вирусов гриппа, А и В. Данные по риску формирования резистентности к арбидолу вирусов гриппа, А и В, а также факторам ее определяющим, в литературе описаны очень ограничено. Штаммы, резистентные к арбидолу, получены только в лабораторных условиях при проведении опытов in vitro после 15 и более пассажей вирусов в присутствии увеличивающихся концентраций арбидола в клетках культуры MDCK [124]. В связи с этим, большой интерес представляло изучение возможности формирования резистентных к арбидолу штаммов вирусов гриппа, А и В на фоне проводимой терапии.

В настоящее время актуальным представляется дальнейший поиск новых химических соединений, обладающих специфической активностью в отношении обоих типов вирусов гриппа — А и В. В этом плане, определенный интерес могут представлять соединения, производные индола (аналоги арбидола), синтез которых в настоящее время проводится в ряде институтов нашей страны (НИИ медицинской радиологии РАМН, г. Обнинск, ЦХЛС-ВНИХФИ, г. Москва). Кроме того, недавно были синтезированы препараты, содержащие селен производства Российского фонда «Содействие развитию наномолекулярных и биоселеновых технологий им. Алексея и Николая Новицких», изучение спектра противовирусной активности которых, в т. ч. и к вирусам гриппа, также имеет научно-практический интерес.

Все вышеизложенное послужило основанием для проведения исследований, представленных в настоящей работе.

Цель исследования.

Цель настоящего исследования заключалась в определении чувствительности современных эпидемических штаммов вирусов гриппа, А и В, циркулировавших в период 2002;2005 гг., к противовирусным препаратам с различным механизмом действия для обоснования целесообразности их применения или дальнейшего изучения.

Задачи исследования.

1. Выбрать оптимальные методы и отработать условия их постановки для оценки чувствительности эпидемических штаммов вирусов гриппа, А и В к химиопрепаратам со специфической противовирусной активностью.

2. Определить частоту возникновения естественно циркулирующих резистентных к ремантадину вирусов гриппа, А среди современных эпидемических штаммов сезонов 2002;2005 гг.

3. Изучить спектр чувствительности эпидемических штаммов вирусов гриппа, А и В к арбидолу.

4. Оценить эффективность комбинированного применения ремантадина и арбидолахимиопрепаратов с различным механизмом действия в отношении эпидемических штаммов вирусов гриппа, А в клетках культуры ткани MDCK.

5. Изучить возможность формирования резистентных к арбидолу штаммов вирусов гриппа на фоне приема препарата пациентами в период заболевания.

6. Определить чувствительность эпидемических штаммов вирусов гриппа, А и В к новым химическим соединениям — производным индола;

7, Изучить активность производных селена в отношении эталонных и эпидемических штаммов вирусов гриппа, А и В;

Научная новизна исследования.

1. Впервые в нашей стране установлен факт роста числа естественно циркулирующих резистентных к ремантадину вирусов гриппа, А среди современных эпидемических штаммов сезонов 2002;2005: гг. (с 9,5% до 17,0%), по сравнению с ранними исследованиями (1990;е годы), выявившими низкий показатель ремантадинрезистентных штаммов (менее 1,0%).

2. Показано наличие высокой активности арбидола в отношении эпидемических вирусов гриппа, А и В, в том числе штаммов вируса гриппа А^ резистентных к ремантадину;

3. Впервые изучено комбинированное действие арбидола с ремантадином в отношении современных эпидемических штаммов вирусов гриппа А. Установлено, что комбинированное применение низких концентраций арбидола и ремантадина увеличивает ингибирующий эффект препаратов на вирусную репродукцию по сравнению с эффектом, оказываемым каждым из этих препаратов в отдельности.

4: Впервые проведено изучение возможности формирования резистентных к арбидолу штаммов вирусов гриппа, А и В при приеме его пациентами в течение 5 дней в период заболевания. В клиническом наблюдении не выявлено формирования резистентных к арбидолу штаммов на фоне рекомендуемого курса лечения.

5. Изучено 14 новых соединений — аналогов арбидола. Из них выявлено 3 соединения, обладающих специфической активностью в отношении вирусов гриппа, А и В, сравнимой с активностью арбидола.

6. Впервые изучено 3 новых соединения — производных селена. Установлено, что эти соединения обладали активностью в отношении эталонных и эпидемических штаммов: вирусов гриппа, А и В.

Практическая значимость исследования.

Отработан и усовершенствован для практического применения в лаборатории метод иммуноферментного анализа (ИФА), позволивший проводить исследования чувствительности к химиопрепаратам эпидемических штаммов вирусов гриппа, А и В на 96-луночных панелях с клетками культуры ткани MDCK.

Факт роста показателя ремантадинрезистенгных вирусов гриппа, А научно обосновывает необходимость дальнейшего проведения мониторинга по изучению чувствительности эпидемических штаммов вирусов гриппа, А к ремантадину и целесообразность его применения для лечения и профилактики в РФ.

Высокая активность арбидола в отношении современных эпидемических штаммов вирусов гриппа, А и В, включая ремантадинрезистентные штаммы вирусов гриппа А, и отсутствие случаев формирования резистентных к арбидолу вирусов гриппа, А и В на фоне проводимого курса лечения подтвердили существующие рекомендации для его применения в качестве профилактического и лечебного средства при гриппе в настоящее время.

Данные об увеличении противовирусной активности в клетках культуры MDCK препаратов ремантадина и арбидола при одновременном использовании открывают перспективу для клинического изучения этих препаратов при комбинированной терапии гриппа в целях более рационального и, вместе с тем, эффективного их применения и снижения риска формирования резистентных мутантов.

Выявление среди аналогов арбидола соединений с противовирусной активностью в отношении современных эпидемических штаммов вирусов гриппа, сравнимой с активностью арбидола, открывает новые возможности в расширении ассортимента средств химиопрофилактики и химиотерапии гриппа.

Результаты, полученные при исследовании противовирусной активности новых соединений производных селена, показавшие их ингибирующий эффект в отношении эталонных и эпидемических штаммов вирусов гриппа, открывают перспективы дальнейшего поиска и экспериментального изучения противовирусных препаратов среди селенпроизводных.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Иммуноферментный анализ (ИФА) является чувствительным методом для изучения спектра активности широко применяемых на практике специфических химиопрепаратов — ремантадина и арбидола в отношении циркулирующих штаммов вирусов гриппа.

2. Среди современных эпидемических штаммов установлена тенденция возрастания в России числа резистентных к ремантадину естественно циркулирующих вирусов гриппа А.

3. Арбидол обладает высокой активностью в отношении эпидемических штаммов вирусов гриппа А, в том числе, ремантадинрезистентных штаммов. Для штаммов вирусов гриппа В отмечена гетерогенность в их чувствительности к препарату.

4. Комбинированное применение ремантадина и арбидола в низких концентрациях в клетках культуры ткани MDCK в отношении современных эпидемических штаммов вирусов гриппа, А увеличивает ингибирующий эффект препаратов на вирусную репродукцию по сравнению с эффектом, оказываемым каждым из этих препаратов в отдельности.

5. В клиническом наблюдении, проведенном среди пациентов в период заболевания, не выявлено формирования резистентных к арбидолу штаммов вирусов гриппа, А и В на фоне приема препарата.

6. Химические соединения — аналоги арбидола и производные селена являются перспективными для дальнейшего изучения и поиска новых препаратов, обладающих активностью в отношении штаммов вирусов гриппа, А и В.

Апробация результатов исследования.

Результаты работ были представлены на международных симпозиумах и конференциях: Международном симпозиуме «Повышение готовности к пандемии гриппа на основе военно-гражданского сотрудничества», Санкт-Петербург, 9−11 мая 2003; Symposium materials «Strengthening influenza pandemic preparedness through civil military cooperation», Saint-Petersburg, may 9−11, 2003; Int. Conf. «Options for the Control of Influenza V», Nago City, Okinawa, Japan, October 7−11, 2003; Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией», Санкт-Петербург, 1−2 декабря 2004; Международной конференции «Актуальные вирусные инфекции — теоретические и практические аспекты», Санкт-Петербург, 2−5 ноября 2004; The First International Conference on Influenza Vaccines for the World, Lisbon, Portugal, 24−26 May 2004; International Conference on Options for the Control of Influenza V, Elsevier, 2004; 5th Louis Pasteur Conference on Infectious Diseases, Institute Pasteur, Paris, France, 17−20 November 2004; IV Конгрессе детских инфекционистов России.

Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики у детей", 14−16 декабря 2005 г.- International Conference «Bird Flu: The first pandemic of the 21st centure: a central role for antivirals», London, 19−20 January 2006,.

Публикации.

Основные результаты диссертации опубликованы в 16 научных трудах, в том числе 4 — в реферируемых журналах, материалах докладов на Международных и Всероссийских конгрессах, симпозиумах и конференциях, а также в отчетах НИР ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

Соавторами научных трудов являются: А. Н. Слепушкин, Е. И. Бурцева, В. Т. Иванова, А. Л. Беляев, Т. А. Оскерко, ЛНМеркулова, Р. З. Гатич (ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН) — И. А. Ленева (ЦХЛС-ВНИХФИ, г. Москва) — А. Л. Заплатников (Российская медицинская академия последипломного образования МЗ РФ, г. Москва). Автор глубоко благодарен и признателен всем своим соавторам.

Автор выражает искреннюю благодарность и глубокую признательность своим научным руководителям Заслуженному деятелю науки РФ, доктору медицинских наук, профессору А. Н. Слепушкину и доктору медицинских наук Е. И. Бурцевой за научное руководство, а также коллективу лаборатории этиологии и эпидемиологии гриппа ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН за ценные рекомендации, высказанные в ходе обсуждения результатов диссертации.

Структура и объем диссертации

.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка литературы, состоящего из 50 работ отечественных и 127 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и включает 22 таблицы и 15 рисунков.

выводы.

1. Показано преимущество иммуноферментного анализа (ИФА) в модификации на панелях с клетками культуры ткани MDCK для определения чувствительности эпидемических штаммов вирусов гриппа, А и В к противовирусным препаратам.

2. Впервые установлен факт возрастания в России числа естественно циркулирующих резистентных к ремантадину вирусов гриппа, А среди современных эпидемических штаммов сезонов 2002;2005 гг.: в эпидсезоне 2002;2003 гг. показатель составил 9,0% A (H1N1) и 10,0% A (H3N2) — в эпидсезоне 2003;2004 гг. — 14,0% A (H3N2) и 18,0% штаммов A (H3N2) сезона 2004;2005 гг.

3. Результатами молекулярно-генетического анализа подтверждена характерная замена аминокислоты серина на аспарагин в 31 положении М2 белка эпидемических штаммов вирусов гриппа A (H3N2), выявленных в ИФА как резистентные к ремантадину.

4. Впервые выявлена высокая активность арбидола в отношении эпидемических вирусов гриппа А, в том числе штаммов, резистентных к ремантадину. Подтверждена противовирусная активность арбидола в отношении эпидемических штаммов вирусов гриппа В, при этом отмечена гетерогенность в их чувствительности к препарату.

5. Показано увеличение эффекта подавления вирусной репродукции в клетках культуры MDCK при комбинированном использовании ремантадина и арбидола в отношении современных эпидемических штаммов вирусов гриппа А, по сравнению с эффектом, оказываемым этими же концентрациями препаратов в отдельности. Наиболее выраженное усиление активности получено при использовании низких концентраций ремантадина (0,001−0,005 мкг/мл) и арбидола (2,5−5,0 мкг/мл).

6. Впервые в клиническом наблюдении, проведенном среди пациентов, перенесших гриппозную инфекцию, вызванную вирусами гриппа A (H3N2) или В, не выявлено формирования резистентных к арбидолу штаммов на фоне рекомендуемого курса лечения.

7. Показано, что химический ряд производных индола является перспективным для дальнейшего поиска новых соединений, обладающих активностью в отношении вирусов гриппа, А и В. Из 14 изученных новых соединений, 3 — обладали специфической активностью в отношении современных вирусов гриппа, А и В, сравнимой с активностью арбидола.

8. Установлено, что новые соединения — производные селена обладали активностью в отношении эталонных и эпидемических штаммов вирусов гриппа, А и В, что делает перспективным их дальнейшее изучение, с целью разработки противовирусных препаратов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В настоящее время грипп остается серьезным заболеванием для населения всего мира, приводящим к огромным экономическим потерям и высокой смертности. Поверхностные белки вирусов гриппа — НА и NA подвергаются постоянным изменениям, приводящим к постепенному вытеснению ранее циркулировавших среди людей штаммов вирусов гриппа. Реассортация между штаммами вирусов гриппа, А человека, млекопитающих и птиц способствует возникновению нового пандемического варианта вируса гриппа А. Участившиеся в последние годы случаи инфицирования людей вирусами гриппа птиц A (H5N1), A (H7N7), A (H7N3) и A (H9N2) в странах Южной, Юго-Восточной Азии и Африки, сопровождающиеся высокой смертностью, могут стать причиной возникновения пандемического варианта.

Всемирной Организацией Здравоохранения в настоящее время помимо вакцинации как основного средства борьбы против гриппа рекомендовано применение препаратов этиотропного действия, то есть препаратов, направленных на определенную вирусспецифическую мишень в цикле вирусной репродукции. Значение химиопрофилактики возможно будет более ощутимым в случае появления нового пандемического варианта вируса гриппа А, быстрое распространение которого затруднит своевременное проведение массовой вакцинации населения в необходимом объеме. В России спектр таких препаратов представлен блокатором М2-белка вирусов гриппа, А — ремантадин и ингибитором слияния липидной оболочки вирусов, А и В с мембранами эндосом — арбидол.

Исследования по изучению чувствительности современных эпидемических штаммов вирусов гриппа, А и В в период с 2002 по 2005 гг. к этим противовирусным препаратам, проведенные в ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, показали, что ремантадин обладал высокой противовирусной активностью (50,0−100%) в отношении большинства эпидемических вирусов гриппа, А в клетках культуры ткани MDCK. Однако в ходе эксперимента были выявлены вирусы гриппа A (H3N2), резистентные к ремантадину, циркулирующие в естественных условиях, показатель которых в эпидемическом сезоне 2004;2005 гг. составил 18,0% и оказался выше по сравнению с результатами предыдущих сезонов 2002;2003 гг. (10,0%) и 2003;2004 гг. (14,0%).

Арбидол обладал выраженной противовирусной активностью (50,0−100%) в отношении всех изученных эпидемических штаммов вирусов гриппа А, в том числе, ремантадинрезистентных штаммов. Действие арбидола в отношении эпидемических штаммов вирусов гриппа В оказалось различным: 48,0% штаммов ингибировались арбидолом менее чем на 50,0%, в отношении остальных вирусов гриппа В активность арбидола составила 51,0−100%. Не было получено естественно циркулирующих резистентных к арбидолу штаммов вирусов гриппа. Проведенные дальнейшие исследования по изучению возможности возникновения резистентных к арбидолу вирусов гриппа, А и В в клинических условиях не выявили формирования арбидолрезистентных штаммов при приеме препарата пациентами в течение 5 дней лечения. Таким образом, в этом плане, лечение арбидолом обладает определенным преимуществом над ремантадином, к тому же, он эффективен при лечении гриппа В.

Одним из подходов к увеличению эффективности химиопрепарата против гриппозной инфекции является его использование в комбинации с другим препаратом, имеющим отличный от него механизм действия. Проведенное изучение эффективности сочетанного применения ремантадина и арбидола в отношении эпидемических штаммов вирусов гриппа, А показало, что их комбинация увеличивает ингибирующий эффект препаратов на вирусную репродукцию по сравнению с эффектом, оказываемым каждым из этих препаратов в отдельности при использовании их низких концентраций. Полученные данные подтвердили выраженное усиление взаимодействия арбидола и ремантадина, что может способствовать снижению лечебных дозировок, а значит токсичности, частоты побочных эффектов (особенно для ремантадина) и риска формирования резистентных мутантов.

Исследования с целью поиска соединений среди производных уже известных и широко применяемых в клинике химиопрепаратов могут привести к выявлению новых препаратов, обладающих высокой активностью в отношении вирусов гриппа. В исследовании была изучена активность новых соединений — аналогов арбидола и производных селена в отношении эталонных и эпидемических штаммов вирусов гриппа, А и В. Метод ИФА был успешно применен для первичного скрининга активных соединений среди аналогов арбидола и производных селена в отношении вирусов гриппа в клетках культуры MDCK. Использование этого метода позволяет оценивать противовирусную активность соединений быстро, количественно и объективно. Выявление с использованием метода ИФА среди производных индола и селена соединений с высокой ингибирующей активностью в отношении эпидемических штаммов вирусов гриппа открывает перспективы дальнейшего поиска новых химических соединений с противовирусной активностью.

Подводя итог полученным результатам, необходимо отметить следующее. Проведенное исследование подтверждает специфическую эффективность арбидола в отношении современных эпидемических штаммов вирусов гриппа, А и В, в том числе, ремантадинрезистентных штаммов гриппа А. Одновременно оно показывает преимущество арбидола по сравнению с ремантадином, как препарата более широкого спектра действия в настоящее время и не вызывающего формирования резистентности при применении по рекомендуемой схеме лечения. Факт роста показателя ремантадинрезистентных вирусов гриппа, А обосновывает необходимость дальнейшего проведения исследований по изучению чувствительности эпидемических штаммов вирусов гриппа, А к ремантадину и целесообразность его применения для лечения и профилактики. Данные об увеличении противовирусной активности препаратов ремантадина и арбидола при сочетанием использовании открывают перспективу для клинического изучения этих препаратов при комбинированной терапии гриппа.

Полученные результаты еще раз подчеркивают необходимость постоянного мониторинга определения чувствительности вирусов гриппа к химиопрепаратам и, в случае необходимости, замены их на новые и более активные препараты.