Исследование молекулярных механизмов и регуляции биосинтеза белка у растений

Содержание

Актуальность проблемы. Изучение механизмов и регуляции биоситеза белка — одна из главных задач молекулярной биологии. Контроль экспрессии генов на уровне трансляции матричных (м)РНК у прокариот известен уже на протяжении многих лет и лишь относительно недавно был надежно продемонстрирован на молекулярном уровне для эукариотических организмов. В настоящее время уже хорошо описано несколько примеров трансляционного контроля экспрессии генов в эукариотических клетках: мРНК гена С&euro-N4 у дрожжей- мРНК белков теплового шока 22 кДа и 70 кДа у ОюяорИНа- мРНК ферритина и трансферринового рецептора, а также многие мРНК вирусов животных и растений. Изучение этих примеров показало, что первичная структура мРНК заключает в себе не только информацию о кодируемом белке, но и полный набор сведений о самой мРНК как о функционирующей молекуле. Информация второго рода расшифровывается труднее и далеко не все элементы структуры, существенные для функционирования мРНК, выявлены в настоящее время. Даже в тех случаях, когда они известны, чаще всего не ясно, каким компонентам транслирующего аппарата адресована эта информация и как она распознается и реализуется.

Многочисленные работы последних лет показывают, что важную роль в модуляции эффективности трансляции мРНК играют их 5'-нетранслируемые последовательности (5'-НТП). Основными структурными чертами 5'-НТП, влияющими на эффективность трансляции эукариотических мРНК, являются: наличие и стабильность вторичной структуры- присутствие и взаимное погттЛт, ожение «ложных» инициирующих кодонов и соответствующих им .ыТых рамок трансляции- определенное нуклеотидное окружение вблизи ложных" и «истинных» инициирующих кодонов- доступность 5'-концевой ¡-(-структуры мРНК.

Однако, несмотря на очевидную значимость, ни одна из этих черт, ни даже 11 озокупность не могут охватить всего многообразия факторов, регулирующих — | «ансляцию мРНК в эукариотических клетках. Большая роль в этом отводится мому аппарату трансляции. Из 12 белковых факторов инициации трансляции? ул^рцот (еГР) некоторые (е1Р4Е, -4Г, -4А) могут связываться с 5'-концевой — -структурой и участвовать в АТФ-зависимом расплетании вторичной эуктуры 5'-НТО мРНК. Активность факторов трансляции (е!Р2, -4 В, -4Е,

4 °F, eEFl, eEF2) может регулироваться посредством ковалентных модификаций. Кроме того, в последнее время появляются работы по изучению низкомолекулярных РНК и вторичных продуктов метаболизма, которые, по-видимому, могут участвовать в регуляции процесса трансляции. Следует помнить также, что мРНК в эукариотических клетках находятся в комплексе со специфическими белками, образуя рибонуклеопротеидные комплексы -информосомы, и что белки информосом также могут регулировать эффективность трансляции мРНК.

Таким образом, эукариотические мРНК транслируются с различными эффективностями как in vivo, так и in vitro. Молекулярные механизмы такой неравной трансляции еше не выяснены, однако экспериментальные данные свидетельствуют, что в их основе лежит взаимодействие мРНК с компонентами белок-синтезирующего аппарата. Влияние eis- и í-rans-действующих регуляторных факторов на эффективность трансляции мРНК у растений изучено гораздо слабее, чем у животных.

Хотя основные пути биогенеза мРНК и этапы их трансляции в клетках животных и растений сходны, исследования последних лет свидетельствуют, что между ними имеется существенная разница в механизмах регуляции биосинтеза белка. Как показано в работах нескольких групп исследователей, многие белковые факторы трансляции растений отличаются от своих аналогов из клеток животных по структуре и не являются взаимозаменяемыми в гетерологичных бесклеточных системах синтеза белка. Нами впервые показано, что в растительных системах, по-видимому, отсутствует регуляция синтеза белка посредством фосфорилирования факторов инициации eiF2 и элонгации eEF2, надежно установленная и хорошо изученная для клеток животных.

Все эти факты свидетельствуют, что молекулярные механизмы и регуляция биосинтеза белка у растений требуют самостоятельного детального изучения. Знание этих механизмов позволит направленно создавать растения с качественно новыми хозяйственно-ценными признаками, открывает возможность для борьбы с вирусными заболеваниями.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена изучению молекулярных механизмов и регуляции биосинтеза белка в клетках высших растений с целью поиска механизмов трансляционного контроля, характерных для клеток растений, а также с целью сравнения их с таковыми у клеток животных и выявления возможных различий между ними.

В задачи исследования входило:

1. Выделение, характеристика белковых факторов инициации (eIF2) и элонгации (eEF2) трансляции из зародышей пшеницы и изучение регуляции их активностей посредством фосфорилирования.

2. Поиск продуктов вторичного метаболизма растений, обладающих способностью специфически влиять на процесс трансляции, и изучение механизма их действия.

3. Идентификация и характеристика преинициаторных трансляционных комплексов в экстрактах зародышей пшеницы и выяснение причин их накопления.

4. Поиск и характеристика малых шггошшматических РНК клеток зародышей пшеницы. Изучение их биогенеза, свойств и возможных функций в регуляции трансляции.

Научная новизна и практическая ценность работы. Основным достижением данной работы представляется проведенное впервые широкое и систематическое исследование молекулярных механизмов регуляции биосинтеза белка у растений в сравнении с таковыми у животных. Установлено, что между ними имеются существенные различия. Кроме того, данные, полученные в настоящей работе, свидетельствуют, что в клетках растений могут функционировать специфические, отличные от животных, механизмы трансляционного контроля.

Впервые изучены параметры взаимодействия фактора инициации трансляции e! F2 зародышей пшеницы с GDP и GTP. Измеренные константы диссоциации этих комплексов свидетельствуют, что сродство фактора eIF2 растений к GDP лишь в 10 раз выше, чем к GTP, в то время как в клетках животных это превышение оценивается в 100−300 раз. Эти результаты свидетельствуют, что механизм регуляции активности растительного фактора eIF2 может существенно отличаться от механизма регуляции аналогичного фактора клеток животных, а также во многом объясняют отсутствие ингибирующего действия низких концентраций двуспиральных (дс)РНК на синтез белка в клетках растений.

Также впервые показано, что фактор элонгации 2 (eEF2) из зародышей пшеницы способен фосфорилироватьея в условиях in vitro посредством eEF2-специфичной Са2+/калмодулин-зависимой киназы, полученной из ретикулоцитов кролика. При этом фосфорилированный фактор eEF2 зародышей пшеницы теряет свою активность в бесклеточной системе трансляции так же как и его фосфорилированный животный аналог. Однако в экстрактах из различных растительных объектов не удалось обнаружить эндогенной eEF2-фосфоршшрующей активности. Эти данные свидетельствуют что, хотя активность фактора eEF2 растений потенциально может регулироваться фосфорилированием, данный механизм регуляции, по-видимому, не реализуется в клетках растений.

Впервые обнаружено, что полипроантоцианидин (И ПА) — полифенольное соединение из верблюжьей колючки Alhagi kiigisorum S. в концентрации 1−5 мкМ практически полностью ингибирует синтез белка в бесклеточных системах трансляции, специфически связываясь с фактором eIF2 и блокируя его способность формировать тройной комплекс [GTP*eIF2*Met-tRNAj |. Эти данные свидетельствуют, что вещества вторичного метаболизма могут играть важную роль в регуляции белкового синтеза в клетках растений.

Впервые в клетках высших растений обнаружены 45S рибонуклео-протеидные (РНП) частицы, содержащие значительное количество быстрометящейся н о во с и н тез и ро r, а н н о й РНК, обладающей матричной активностью. Изучение компонентного состава и физико-химических свойств 45S частиц свидетельствует, что они представляют собой 48S преинициаторные трансляционные комплексы, содержащие 40S рибосомные субчастицы, факторы инициации, GTP, Met-tRNA? и мРНП. Накопление таких комплексов в цитоплазме клеток растений указывает на существование факторов, контролирующих последовательность этапов инициации после связывания мРНП с 40S, но до присоединения 60S субчастиц.

Впервые в составе 45S РНП частиц зародышей пшеницы обнаружена малая РНК длиной около 135 нуклеотидов (обозначенная как 5,3S РНК). Показано, что 5,3S РНК локализуется также в полисомах и 80S рибосомах, но не обнаруживается в безрибосомных субклеточных фракциях. После диссоциации 80S рибосом в буфере с высокой ионной силой 5,3S РНК остается в комплексе с 40S субчастицей.

Установлено, что при нормальной температуре (25°С) 5,3S РНК присутствует в составе лишь 5−10% рибосом, тогда как после теплового шока (1ч при 37°С) ее количество увеличивается в 5 раз и от 25 до 50% рибосом становятся 5,3S РНК-содержащими. Кроме того установлено, что выделенная 5,3S РНК прочно и специфически связывается с фактором инициации eIF2, но не взаимодействует с элонгационным фактором eEF2. Эти данные свидетельствуют, что 5,3S РНК может участвовать в регуляции синтеза белка у зародышей пшеницы при тепловом шоке на уровне инициации трансляции.

Работа имеет теоретическое и методическое значение для последующих исследований по выяснению регуляторных механизмов биосинтеза белка и представляет интерес для специалистов в области молекулярной биологии, вирусологии и физиологии растений. Обнаруженное ингибирующее действие ППА на функцию фактора eIF2 предполагает возможность использования его в качестве тонкого инструмента при изучении механизмов и регуляции трансляции в эукариотических бесклеточных системах, поскольку он весьма специфично ингибирует функцию фактора eIF2 как зародышей пшеницы, так и ретикулоцитов кролика. Очищенный препарат ППА передан для проведения научно-исследовательских работ в лаборатории Техасского Университета (г. Остин, США) и Кентского Университета (г. Кантербери, Англия). Очищенные препараты факторов eIF2, eIF4E, eEF2 зародышей пшеницы передавались в различные научно-исследовательские лаборатории в России: Институт белка PAII, МГУ им, М. В. Ломоносова, Новосибирский Институт биоорганической химии, а также в других странах: Кентский Университет (Англия), Институт Фридриха Миш ера (Швейцария). В эти же, а также во многие другие организации передавался высококачественный экстракт из зародышей пшеницы, который использовался для in vitro трансляции.

Структура работы. Диссертация изложена в форме научного доклада. Материалы, использованные в диссертации, получены самостоятельно и в соавторстве с сотрудниками лаборатории белка и нуклеиновых кислот Института молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айтхожина — С. К. Смаиловым, С. М. Шайхиным, А. В. Ли, Е. В. Кожановым, Н. С. Полимбетовой, К. И. Мадиным, С. Ш. Жаныбековой. Всем коллегам автор выражает благодарность. Особую благодарность автор приносит академику А. С. Спирину за поддержку и постоянный интерес к данной работе.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на многих конференциях и симпозиумах, в том числе: 14-м Международном конгрессе по биохимии (Прага, 1988) — Международном симпозиуме «Молекулярная организация биологических структур» (Москва, 1989) — 19-й конференции ФЕБО (Рим, 1989) — Международном симпозиуме «Регуляция трансляции» (Рига, 1989) — Республиканской конференции «Современные проблемы физико-химической биологии и биотехнологии» (Алма-Ата, 1989) — 10-м Советско-Французском симпозиуме «Организация и экспрессия геномов эукариот и прокариот» (Киев, 1990) — 2-м съезде

Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990) — 3-м Всесоюзном симпозиуме «Клеточные механизмы адаптации» (Чернигов, 1991) — 14th International tRNA Workshop (Ридзина, Польша, 1991) — Всесоюзной конференции «Генетические механизмы устойчивости растений к неблагоприятным факторам среды» (Иркутск, 1991) — Международной конференции «Protein biosynthesis» (Пущино, 1991) — 2-м Всесоюзном симпозиуме «Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии» (Самарканд, 1991) — 1-м Всесоюзном симпозиуме «Новые методы биотехнологии растений» (Пущино,

1991) — 3-й конференции «Translational Control» (Колд Спринг Харбор, США,

1992) — 2-м Российском симпозиуме «Новые методы биотехнологии растений» (Пущино, 1993) — 4-м Международном конгрессе по молекулярной биологии растений (Амстердам, Нидерланды, 1994) — Международной конференции «Baev memorial conference» (Москва, 1996) — «Translational control» (Колд Спринг Харбор, США, 1996) — Международном симпозиуме по стрессу и ассимиляции неорганического азота (Москва, 1996) — 10-м вирусологическом конгрессе (Иерусалим, Израиль, 1996).

Диссертация обобщает результаты 28 экспериментальных работ, опубликованных в отечественных и зарубежных журналах, а также в монографии «Информосомы растений» (М.А. Айтхожин, Б.К. Искаков). Работа выполнена при финансовой поддержке Академии наук Казахстана, Международного научного фонда (грант MYH000), фонда INTAS (грант 93−2549).

Использованные сокращения. 40S СЧ. 60S СЧ — 40S и 60S субчастицы рибосом- 5'-НТП — 5'-нетранслируемая последовательность мРНК- БТШ — белки теплового шока- ДС-Na — додецилсульфат натрия- дсРНК — двуспиральная РНК- НАД — никотинамидадениндинуклеотид- ПААГ — полиакриламидный гель- ППА — полипроантоцианидин- РНП — рибонуклеопротеид- ФМСФ -фенилметилсульфонилфторид- ЭДТА — этиле идиаминтетрауксусная кислота- eEF — эукариотический фактор элонгации трансляции- meEF — eEF млекопитающих- peEF — eEF растений- elF — эукариотический фактор инициации трансляции- eIF2(aP) — фактор eIF2, фосфорилированный по а-субъединице- melF — elF млекопитающих- ре IF — elF растений- HRI — гемин-регулируемый ингибитор (протеинкиназа, активируемая при дефиците гемина) — Met-tRNA, — инициаторная тРНКМет, ацидированная метионином- р! — изоэлектрическая точка: PKR -протеинкиназа, активируемая дсРНК- mPKR — PKR млекопитающих- pPKR -PKR растений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. РЕГУЛЯЦИЯ СИНТЕЗА БЕЛКА В КЛЕТКАХ РАСТЕНИЙ НА

УРОВНЕ БЕЛКОВЫХ ФАКТОРОВ ТРАНСЛЯЦИИ Синтез белка в клетках про- и эукариот представляет собой комплексный процесс, состоящий из многих стадий и включающий в себя большое число компонентов. Собственно синтез полипептидов обеспечивается рибосомными субчастицами, с которыми взаимодействуют трансляционные ферменты (факторы инициации, элонгации и терминации), мРНК и аминоацил-тРНК.

Среди белков, входящих в состав аппарата трансляции эукариотических клеток, идентифицировано более, чем 20 фосфопротеинов, (J. W. В. Hershey, 1989, J.Biol.Chem., Vol. 264, рр.20 823−20 826). Это указывает, что их фосфорилирование/дефосфорилирование может служить механизмом регуляции трансляции. Действительно, в ретикулоцитах кролика впервые были обнаружены и охарактеризованы механизмы регуляции активности двух ключевых факторов трансляции — фактора инициации 2 (eIF2) и фактора элонгации 2 (eEF2). Оба механизма основываются на фосфорилировании факторов специфическими протеинкиназами, что сопровождается ингибированием синтеза белка. Эти механизмы были позднее обнаружены и в других клетках животных, а также у дрожжей, что позволило считать фосфорилирование eIF2 и eEF2 универсальными механизмами регуляции трансляции для всех эукариотических клеток.

Процесс трансляции для растительных объектов изучен значительно слабее, и предполагается, что он регулируется так же, как и в клетках животных. Однако, в последнее время стали накапливаться данные, свидетельствующие о различиях в трансляционных аппаратах животных и растительных клеток. Например, было показано, что некоторые, функционально аналогичные, факторы трансляции из зародышей пшеницы и из ретикулоцитов кролика существенно различаются по структуре и не могут полностью заменять друг друга в гетерологичных бесклеточных системах трансляции (R.D. Abramson, et al., 1988, J.Biol.Chem., Vol. 263, pp. 5462−5467).

До начала нашей работы молекулярные механизмы регуляции процесса трансляции в клетках высших растений были мало изучены. Эти обстоятельства побудили нас исследовать регулируются ли активности факторов eIF2 и eEF2 растений подобно тому, как это имеет место в клетках животных.

1.1. Изучение регуляции активности фактора инициации 2 растений (peIF2). 1.1.1. Выделение и характеристика фактора pelF2 зародышей пшеницы.

Одной из ранних стадий инициации трансляции всех мРНК является связывание инициаторной метионил-тРНК (Met-tRNAj) с 40S рибосомной субчастицей. Фактор eIF2 является ключевым белком этого процесса, а тройственный комплекс [GTP*eIF2*Met-tRNAi| - обязательным интермедиатом, в составе которого Met-tRNAj переносится на 40S субчастицу.

С использованием модифицированного метода очистки (S. M. Shaikhin et al., 1992, Biochimie, Vol. 74, pp. 447−454) нами были выделены препараты eIF2 из ретикулоцитов кролика (meIF2) и из зародышей пшеницы (peIF2). Относительная молекулярная масса (Мг) нативного фактора peIF2 была определена методом гель-фильтрации и составила приблизительно 150 000. По данным электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) с додецил-сульфатом натрия (ДС-Na) препарат peIF2 содержит четыре полипептида с Мг 37 000 (р37), 40 000 (р40), 42 000 (р42), 52 000 (р52) (рис. 1). Денситометрическое сканирование геля показало, что эти полипептиды находятся в соотношении .1: 0,6: 0,2: 0,9, соответственно.

— рГ. У

— 30 к I

Рис. 1. Электрофорез очищенных препаратов eIF2:

1 — melF2 ретикулоцитов кролика-

2 — peIF2 зародышей пшеницы-

3 — маркерные полипептиды (указаны их молекулярные массы в кДа).

Весьма вероятно, что полипептвд р40 фактора peIF2 является продуктом частичного протеолиза полипептида р42 (J. О. Langland et al., 1996, J.Biol.Chem., Vol. 271, pp. 4539−4544, К. S. Browning and A. M. Metz, неопубликованные данные).

Принимая во внимание это обстоятельство, можно считать, что фактор peIF2 состоит из трех субъединиц: р37, р42 и р52, в соотношении близком к 1:1:1. Аналогичный фактор ретикулоцитов кролика (raeIF2) также состоит из трех субъединиц с Мг 36 000 (а), 38 000 (Р) и 52 000 (у). Недавно, при сравнении нуклеотидных последовательностей кДНК субъединиц факторов peIF2 и melF2, было выявлено, что субъединица р42 фактора peIF2, по-видимому, функционально соответствует а-субъединице фактора meIF2, р37 — (3-субъединице, а р52 — у-субъединице (К. S, Browning, 1996, Plant Mol.Biol., Vol.32, pp.107−144). Вместе с тем, следует отметить, что монокяональные антитела к каждой из субъединиц фактора meIF2 не взаимодействуют ни с одной из субъединиц фактора peIF2 (А. В. Ли, Б. К. Искаков и К. Г. Прауд, неопубликованные данные), что указывает на существенные различия в структуре eIF2 животных и растений.

1.1.2. Фосфорширование peIF2 и регуляция его активности.

Хорошо известно, что аминокислотный остаток Сер-51 а-субъединицы фактора eIF2 клеток млекопитающих (meIF2) является мишенью для фосфорилирования посредством по крайней мере двух специфических протеинкиназ: 1) HR1 — протеинкиназа, активируемая автофосфорилированием при дефиците гема (в ретикулоцитах), а также при многих стрессовых воздействиях, таких как тепловой шок, голодание по аминокислотам, глюкозе, и др. (R. Е. Rhoads, 1993, J.Biol.Chem., Vol. 268, рр.3017−3020- J.-J. Chen and L M. London, 1995, TIBS, Vol. 20, pp.105−108). 2) PKR — протеинкиназа, индуцируемая интерфероном и активируемая автофосфорилированием в присутствии низких концентраций (10 — 50 нг/мл) двуспиральных (дс)РНК (R. Е. Rhoads, 1993- R.C. Wek, 1994, TIBS, Vol. 19, pp.491−496). Недавно у дрожжей была обнаружена еще одна протеинкиназа (GCN2) с аналогичной субстратной специфичностью, которая активируется в условиях аминокислотного голодания (A. G. Hinnebusch, 1994, TIBS, Vol. 19, рр.409−414).

Фосфорилирование а-субъединицы фактора eIF2 ингибирует обмен GDP на GTP, катализируемый фактором eIF2B. Фактор eIF2B не может стимулировать GDP/GTP-обмен на фосфорилированном elF2- кроме того бинарный комплекс [eIF2(aP)*GDP|, содержащий фосфорилированный eIF2, имеет значительно большее сродство к фактору eIF2B, чем нефосфоршшрованый? elF2*GDP|. Поскольку фактора eIF2 содержится в клетке в 3−6 раз больше чем фактора eIF2B, то фосфорилирование лишь 1530% молекул eIF2 приводит к связыванию всех молекул eIF2B и прекращению образования новых тройственных комплексов |GTP*eIF2*Met-tRNAj], что в свою очередь приводит к полному блокированию инициации трансляции и остановке синтеза белка (М.1.Clemens, 1994, Mol.Biol. Rep., Vol.19, pp20l-210).

В настоящее время не ясно, функционирует ли подобный механизм регуляции трансляции посредством фосфорилирования фактора el F2 в клетках высших растений.

Нами была исследована способность фактора peIF2 служить в качестве субстрата для фосфорилирования посредством выделенной из ретикулоцитов кролика протеинкиназы — mPKR, активируемой дсРНК (рис. 2). Инкубация очищенного препарата mPKR в присутствии |-у-32Р|АТР и 10 нг поли (1):поли© приводила к ее активации и автофосфорилированию (рис. 2, дорожка 1). При добавлении в инкубационную смесь очищенного препарата фактора melF2 (ретикулоцитов кролика), как и следовало ожидать, происходит фосфорилирование его а-субъединицы (дорожка 2). У фактора peIF2 (зародышей пшеницы) mPKR-киназа фосфорилирует полипептиды р40 и р42 (рис. 2, дорожка 3).

Рис. 2. Фосфорилирование факторов meIF2 и peIF2 протеинкиназой mPKR из ретикулоцитов кролика. Препараты инкубировали в присутствии |у-32Р| АТР и 10 нг поли (1):поли©, затем проводили электрофорез и радиоавтографию. 1 — mPKR-киназа- 2 — mPKR-киназа + meIF2- 3 — mPKR-киназа + peiF2. Указаны положения mPKR-киназы и субъединиц факторов.

— т -vKM-m -у — 1>— мт — р1-'

Ш— р-н) — а — р: г/

Полученные нами результаты согласуются с данными нескольких групп исследователей о фосфорилировании полипептидов р40/42 фактора peIF2 посредством как экзогенной HRI-киназы ретикулоцитов кролика (R. Benne et al, 1980 a, Eur.J.Biochem., Vol.104, pp.109−117- R. D. Clarke and R. S. Ranu, 1987, Mol.Cell.Biochem., Vol.74, pp. 129−135- N. Janaki et al., 1995, Arch.Biochem.Biophys., Vol.342, pp.1−8), так и эндогенными протеинкиназами растений (К. S, Browning et al., 1985, Plant Physiol, Vol.77, pp.370−373).

Принимая во внимание недавнее сообщение о том, что субъединица р42 фактора peIF2, по-видимому, функционально соответствует а-субъединице фактора melF2 (К. S. Browning, 1996, Plant Mol.Biol., Vol.32, pp. 107−144), можно предположить, что в клетках растений возможно существование механизма контроля синтеза белка, в основе которого лежит фосфорилирование фактора peIF2. Однако это предположение не согласуется с тем обстоятельством, что ни в одной из упомянутых работ фосфорилирование субъединиц фактора peIF2 не сопровождалось заметным ингибированием трансляции в бесклеточной системе из зародышей пшеницы. Некоторые авторы сделали заключение, что в зародышах пшеницы, по-видимому, не функционирует гемин-контролируемая система регуляции трансляции (R. Benne et al, 1980, Eur J. Biochem., Vol. 104, pp.501−509- R. D. Clarke and R. S. Ranu, 1987).

Известно, что в бесклеточной системе трансляции, выделенной из ретикулоцитов кролика, в присутствии небольших количеств дсРНК происходит активация PKR-киназы, которая фосфорилирует а-субъединицу meIF-2, что в свою очередь приводит к ингибированию белкового синтеза. Нам представлялось интересным выяснить, как влияет присутствие дсРНК на бесклеточную систему трансляции из зародышей пшеницы.

На рисункеЗ показана зависимость эффективности трансляции РНК вируса табачной мозаики (ВТМ) от количества поли (1): поли©, вносимого в бесклеточные системы трансляции из зародышей пшеницы (кривая 1) и из ретикулоцитов кролика (кривая 2). Трансляция в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика значительно ингибировалась при концентрации дсРНК около 10 нг/мл, тогда как на систему из зародышей пшеницы присутствие дсРНК во всем испытанном диапазоне концентраций (1 нг/мл — 1 мкг/мл) не оказывало существенного влияния.

Рис. 3. Влияние дсРНК на трансляцию РНК ВТМ в бесклеточных системах из зародышей пшеницы (1) и ретику-лоцитов кролика (2).

Отсутствие заметного влияния низких концентраций дсРНК на трансляцию в бесклеточной системе из зародышей пшеницы, показанное в настоящей работе, согласуется с аналогичными результатами других авторов (L. Raijnders et al., 1975, Biochim.Biophys.Acta, Vol.390, pp.69−77- L. K. Grill et al., 1976, Biochem.Biophys.Res.Corrumm., Vol.73, pp. 149-i56) и указывает на то, что в клетках зародышей пшеницы, по-видимому, не функционирует система рефляции трансляции посредством фосфорилирования фактора peIF2.

Единственным свидетельством в пользу существования подобной системы в клетках растений являются работы Д. Рота с соавторами, в которых наблюдалось фосфорилирование белка с Мг 68 000 (р68) в тканях табака, зараженных ВТМ (С. J. Crum et al., 1988, J.Biol. Chem, Vol.263, pp. 1 344 013 443). Поскольку фосфорилирование p68 усиливалось в присутствии дсРНК и, кроме того, этот белок взаимодействовал с антителами на PKR-киназу клеток млекопитающих (mPKR), авторы сделали вывод о функциональной идентичности белка р68 (pPKR) с mPKR. Действительно, позднее было показано, что pPKR, также как и mPKR, способна специфически фосфорилировать р42-субъединицу фактора pelF2 зародышей пшеницы и, что in vifro-фосфорилированный (только посредством mPKR) фактор peIF2 ингибировал трансляцию в бесклеточной системе зародышей пшеницы (J. О. Langland et al., 1996, j.Biol.Chem., Vol. 271, pp. 4539−4544). Следует отметить, однако, что для активации pPKR требовались в 1000 раз более высокие концентрации дсРНК (10−100 мкг/мл), чем для активации mPKR (10−50 нг/мл) и, что ингибирующий эффект дсРНК на in vitro-трансляцию в системе из зародышей пшеницы не всегда воспроизводился. Хотя растительный аналог фактора eIF2B до сих пор не обнаружен, тем не менее авторы считают, что в л н о о х л

100 80 604 020

Hi&-O-O-O-О

О 0.2 0.4 0.6 0.8 1 [дсРНК], мкг/мл клетках растений имеются все компоненты, необходимые для функционирования механизма регуляции синтеза белка посредством фосфорилирования фактора peIF2.

Таким образом, данные по влиянию дсРНК на синтез белка в растительных системах противоречивы, а вопрос о наличии в клетках растений регуляторного механизма, основанного на фосфорилировании фактора peIF2, остается пока открытым.

1.1.3.Изучение кинетических параметров взаимодействия peIF2 с GDP и GTP

После каждого цикла инициации фактор eIF2 остается в составе неактивного и прочного комплекса с GDP [eIF2*GDP|. Для того, чтобы e! F2 мог участвовать в следующем цикле, связанная молекула GDP должна быть заменена на GTP. Этот обмен не может протекать самопроизвольно, так как сродство фактора к GDP в клетках животных на 2 порядка выше, чем к GTP, и осуществляется при помощи вспомогательного фактора eIF2B. Фактор eIF2B образует комплекс с [e!F2*GDP], который легко диссоциирует на |eIF2*eIF2B] и GDP. Константы диссоциации комплексов [eIF2*clF2B| с GTP либо GDP составляют 1.7 х НИ М и 1.8 х Ю-7 М, соответственно (В. Safer, 1983, Cell, Vol.33, pp.7−8). Поскольку физиологические концентрации GTP и GDP в клетке соотносятся как 10:1 (R. A. de Abreu, et al, J.Chromatogr., Vol.227, pp.45−52) то, при равном сродстве к гуаниловым нуклеотидам, реакция будет сдвигаться в сторону образования активного комплекса с GTP [eIF2*GTP] и, следовательно, процесс инициации будет протекать нормально.

Механизм регуляции функции фактора eIF2 в клетках животных посредством его фосфорилирования заключается в том, что фосфорилированный eIF2 в комплексе [e[F2(aP)*GDP] прочно связывает elF2B, вследствие чего последний становится недоступным даже для нефосфорилированных молекул eIF2: нуклеотидный обмен блокируется и инициация ингибируется. Таким образом, одним из главных условий функционирования данного механизма является намного большее сродство фактора eIF2 к GDP чем к GTP.

В связи с этим нами впервые были измерены константы диссоциации комплексов фактора peIF2 зародышей пшеницы с GDP и GTP. Полученные величины констант диссоциации составили соответственно Kd (GDP) = 1.5 х Ю-7 М и Kd (GTP) = 1.5 х Ю-6 М, т. е. сродство фактора peIF2 к GDP всего в

10 раз выше, чем к GTP, тогда как для фактора из клеток животных (meIF2) эта разница в сродстве составляет 80 — 300 раз (табл.1).

Таблица 1.

Кинетические параметры взаимодействия GTP и GDP с eiF-2 из различных объектов

Константы Источники препарата е1Рдиссоциации Асцитные клетки Ретикулоциты Зародыши комплексов опухоли Эрлихаа) кролика6) пшеницы

KdGTP, нМ

KdGDP, нМ

KdGTP/KdGDP а) R. Panniers et al., 1988, J.Biol.Chem., Vol.263, pp.5519−5525. б) G.M. Walton and G.N. Gill, 1975, Biochim.Biophys.Acta, Vol.390, pp.231−245.

Близкие величины Kd для комплексов pel F2 с гуаниловыми нуклеотидами свидетельствуют о том, что при достаточно высоком соотношении концентраций GTP к GDP обмен нуклеотидов может происходить самопроизвольно без участия дополнительного elF2B- подобного белкового фактора. Действительно, как показано на рисунке 4, уже в концентрации цМ молекулы GTP практически полностью вытесняют GDP из комплекса с фактором pel F2 зародышей пшеницы. В отличие от этого, даже в концентрации 400 дМ GTP не вытесняет GDP из прочного комплекса с фактором merF2 ретикулоцитов кролика.

Рис. 4. Замещение GDP из комплексов eIF2*[3HJGDP на GTP.

1 — peIF2 зародышей пшеницы,

2 — meIF2 ретикулоцитов кролика.

ГГгТР! IiМ

На рисунке 5 приведены данные по влиянию фактора те1Р2 В ретикудоцитов на обмен гуаниловых нуклетидов в комплексах с ше1Р2 или ре1Р2. Как видно из рисунка те! Р2 В значительно стимулирует ОЭР/СТР обмен на факторе те1Р2, но не оказывает влияния на аналогичный обмен в случае фактора ре! Р2. о 0.01 0.02 о. оз 0.04 0.05 0.06 2 — те! Р2 ретикулоцитов кролика. ше! Р2 В, разведения

Полученные нами результаты согласуются с данными К. Рамайа и соавторов (К.^пак1 ег а1., 1995, Агс11.ВюсЬет.Вюр11у5., Уо!.342, рр.1−8), изучавших обмен гуаниловых нуклеотидов на факторах ше! Р2 и ре! Р2 в лизатах ретикулоцитов кролика, в которых синтез белка был заингибирован в условиях дефицита тема, либо добавлением низких концентраций дсРНК. В таких лизатах функция фактора ше1Р2 В нарушается вследствии активации соответственно НШ- либо тРКИ- киназ и фосфорилирования остатка Сер-51 сх-субъединицы фактора е! Р2. На ретикулоцитном факторе ше1Р2 обмен гуаниловых нуклеотидов блокировался, тогда как на пшеничном факторе ре1Р2 — происходил нормально. Эти данные также свидетельствуют, что вОР/ОТР-обмен на факторе из клеток растений может происходить независимо от того, фосфорилирован ре1Р2 или нет. Такому предположению не противоречат результаты работ, в которых не удалось обнаружить функциональных аналогов е1Р2 В в растительных объектах (Б. II. Ьах ег а1., 1982, 1. В1о1.СЬет., Уо1.257, рр.8233−8237- у, (МейюШ ел а1., 1983, .Шо1.СЬет., Уо1.258, рр.8285−8289). Следовательно, можно говорить о существенном отличии механизмов регуляции активности фактора е]Р2 в зародышах пшеницы по сравнению с клетками животных.

Рис. 5. Влияние фактора mcl F2B ретикулоцитов кролика на замещение GDP из комплексов eIF2*|3H|GDP на GTP. Фактор meIF2B добавляли в указанных разведениях исходного раствора. Концентрация GTP составляла для peiF2 — 3,5 цМ, а для meIF2 -350 цМ.

1 — peIF2 зародышей пшеницы,

1,2. Изучение регуляции активности фактора элонгации 2 растений (реЕР2), 1.2.1. Выделение и характеристика фактора рсЕР2 зародышей пшеницы.

В настоящей работе, с целью получения полноразмерного и активного препарата реЕР2, в качестве ингибитора протеаз применялся фенилметидсудьфонилфторид (ФМСФ) в концентрации 1 мМ и преследовалась цель максимально сократить продолжительность процедуры выделения. Полученный препарат являлся необходимым компонентом бесклеточной поли (и)-зависимой системы синтеза полифенилаланина (см. табл. 3), что свидетельствовало о его функциональной полноценности.

По данным двумерного электрофореза (рис. 6А) реЕР2 зародышей пшеницы имеет Мг около 100 000 и представлен тремя зарядовыми изомерами с ер -2 изоэлектрическими точками (р1) в интервале от 6,1 до 6,4: два главных компонента с р1 6,1 и 6,2, соответственно, и минорный — с р! 6,4. мг Ш¥- хНГ3 й

43 30

94 -67

43 -30

Рис. 6. Двумерный электрофорез препаратов фактора реЕР2 зародышей пшеницы. А — очищенный реЕР2- са Б — реЕР2, фосфорилирован-ный теЕР2-киназой из рети-кулоцитов кролика- В — радиоавтограмма геля Б. Слева показаны положения маркерных белков, справа -положения фактора (ЕР-2) и карбоангидразы (СА).

Величины pi были определены с помощью карбамилированной карбоангидразы (Carbamylyte™, Pharmacia), которая при двумерном электрофорезе образует серию пятен с Мг 30 000. Положение крайнего левого пятна соответствует pi 6,7, а у каждого следующего вправо пятна величина р! уменьшается на 0,1. Наличие нескольких зарядовых изомеров (до четырех компонентов) было также описано для фактора meEF2 из клеток животных. Причиной существования зарядовых изомеров eEF2 могут являться ковалентные модификации, такие как образование дифтамида (J. С, Chen and J. W. Bodley, 1988, J.Biol.Chem., Vol.263, pp.11 692 11 696), ADP-рибозилирование (Zamboni et al., 1991, Eur.J.Biochera., Vol.200, pp. 13−18) и (или) фосфорилирование (J. E. Celisetal., 1990, Proc. Nat 1.Acad.Sei.USA., Vol.87. pp.4231−4235).

1.2.2. Фосфорилирование фактора peEF2 и регуляция его активности.

С целью выяснения способности фактора peEF2 зародышей пшеницы к фосфорилированию, очищенный препарат этого фактора инкубировали с теЕГ2-кинаюй ретикулоцитов кролика в присутствии [у-3-Р]АТР и затем анализировали двумерным электрофорезом (рис. 6Б и 6В). Из электрофореграммы (рис. 6Б) видно, что в результате реакции in vitro-фосфорилирования изоэлектрическая точка одного из главных зарядовых изомеров peEF2 (pi 6,1) сдвигается в кислую область до величины pi 5,8. Как следует из радиоавтограммы того же геля (рис. 6В), именно эта фракция молекул peEF2 наиболее интенсивно фосфорилируегся. Следовательно, по крайней мере часть молекул peEF2 зародышей пшеницы (более 50%) является аутентичным субстратом для теЕРЗ-киназы животного происхождения. Небольшое количество радиоактивных фосфатных групп содержится также в двух других зарядовых изомерах (с р! 6,2 и 6,4), тем не менее они почти не изменяют своих электрофоретических подвижностей. Следует отметить, что при стандартных условиях реакции in viiro-фосфорилирования посредством meEF2-KHHa3bi ретикулоцитов кролика, фактор peEF2 зародышей пшеницы фосфорилируется до такой же степени, что и meEF2 ретикулоцитов кролика.

Недавно была определена аминокислотная последовательность фактора pcEF2 из водоросли Chlorella kessleri (G. Schnelbogl and Т. Tanner, 1991, Plant Physiol., Vol.97, pp.469−471). Сравнение этой последовательности с последовательностью фактора meEF2 из ретикулоцитов кролика (N. Т. Price ei ai, 1991, FEBS Lett., V6L282, pp.253−258) показывает их большое сходство в домене фосфорилировавия (рис. 7), peEF2 52Гли-Асп-Тлн-Арг-Лей-Тре-Асп-Тре-Арг meEF2 51Гли-Глу-Тре-Арг-Фен- Гре-Асп-Тр^АргЗЗ

Рис. 7. Сравнение аминокислотных последовательностей домена фосфоршшрования в молекулах фактора eEF2 из клеток растений и животных. Выделены сайты фосфорилирования.

Поскольку известно, что фосформлироваиие фактора meEF2 клеток животных сопровождается ингибированием синтеза белка in vitro (A. G. Ryazanov and A. S. Spirin, 1990, New Biologist, V.2, pp.843−859) и, по-видимому, in vivo (J. E. Celis et al, 1990, Proc.Natl.Acad.Sci.USA., VoL87, pp.4231−4235), нами было исследовано влияние фосфорнлирования на активность peEF2 зародышей пшеницы (табл. 2). Фосфорилированный фактор зародышей пшеницы, так же как и его аналог из клеток животных, теряет свою активность в поли (11)~зависимой бесклеточной трансляционной системе, что сопровождается ингибированием синтеза полифенилаланина. Такого ингибирования не наблюдается в присутствии антагониста кальмодулина -трифторперазина или в отсутствии кальмодулина и ионов Са2+ (табл. 2). Последнее обстоятельство еще раз подтверждает Са2+/кальмодулин-зависимую регуляцию активности теЕР2-киназы клеток животных, описанную ранее (A. G. Ryazanov et al., 1988, Nature, Vol.334, pp. 170−173).

Влияние фосфорнлирования на активность peEF2 зародышей пшеницы в поли (I-) зависямой бесклеточной системе трансляции

Таблица 2,

Добавки

3Н]палифенилаланин, пмоль

Без добавок EF-2-киназа

EF-2-киназа трифторперазин EF-2-киназа без Са2+ и кальмодулина

23,0 8,5 25,3 22,

Очищенный препарат реЕР2 прединкубировался с указанными добавками и затем вносился в бесклеточную систему трансляции.

Таким образом, фактор peEF2 зародышей пшеницы является аутентичным субстратом для теЕР2-киназы клеток животных, и его активность потенциально может регулироваться фосфорилированием. Естественно возникает вопрос: реализуется ли эта возможность в клетках растений, или, иначе говоря, имеется ли в клетках растений реЕР2-киназа, аналогичная таковой клеток животных?

Для того, чтобы ответить на эти вопросы, цитоплазматические экстракты (S23) из покоящихся и прорастающих (6−48ч при 25°С) зародышей пшеницы инкубировали с [у-32Р]АТР в присутствии кальмодулина и ионов Са2+ и подвергали электрофорезу (рис, 8, дорожки 4−7). В некоторых вариантах для усиления чувствительности детекции реЕР2.-киназы в инкубационную смесь вносили очищенный фактор peEF2 (рис. 8, дор. 5 и 7). В указанных экстрактах наблюдается большое количество полипептидов, являющихся субстратами для эндогенных протеик-фосфокиназ зародышей пшеницы. Однако, ни в одном из вариантов опыта не наблюдалось фосфорилирования фактора реЕР2 за счет эндогенной реЕР2-киназной активности (рис. 8). Аналогичный результат был получен и с экстрактами зародышей из созревающих (стадии молочно-восковой и восковой спелости) семян пшеницы.