Новые синаптические рецепторы

Функционирование нервной системы определяется высоко организованным взаимодействием нервных клеток, образующих развитую сеть межклеточных синаптических контактов. Синапсы служат для направленной, тонко регулируемой передачи сигналов от одной клетки к другой. Направленность передачи сигнала — обеспечивается существованием специальных надмолекулярных структур в месте синаптического контакта — пресинаптического аппарата, обеспечивающего выброс нейромедиатора путем экзоцитоза синаптических пузырьков на одной клетке и постсинаптических рецепторных комплексов на другой клетке. Образование и исчезновение синаптических контактов является регулируемым процессом, обеспечивающим организацию сложных сетей передачи и обработки сигналов в мозгу.

Детальное понимание механизмов синаптической передачи и синаптогенеза требует идентификации и характеристики молекулярных компонентов синапса. Несмотря на прогресс, достигнутый в этой области в течение последних лет, многие молекулы, важные для функционирования синапсов, остаются неизвестными, либо мало изученными. В наибольшей степени данное относится к пресинаптическому аппарату, который осуществляет сложные процессы регулируемого транспорта синаптических пузырьков и их слияние с клеточной мембраной.

Методические сложности изучения молекулярных механизмов выброса нейромедиаторов определяются тем, что в отличие от других биологических процессов таких как, например, ферментативные реакции или трансмембранный транспорт ионов, реконструкция функционального пресинаптического аппарата in vitro остается крайне сложной и в настоящее время неосуществленной задачей. Выделение белковых компонентов пресинапса на основе легко определяемой биохимической характеристики не представляется возможным. В связи с этим, исследователями синаптической передачи были использованы непрямые подходы для идентификации пресинаптических белков, такие как анализ случайных и направленных мутаций в различных организмах, выделение и систематический анализ белковых компонентов синаптических пузырьков, использование пресинаптических нейротоксинов и пр.

На сегодняшний день, наши знания о структуре пресинаптического аппарата ограничиваются коротким и, очевидно, неполным списком белков, которые предположительно участвуют в процессе выброса нейромедиаторов. Вышеизложенное позволяет заключить, что идентификация и структурно-функциональное исследование пресинаптических белков является актуальной проблемой современной физико-химической биологии.

Основной целью настоящей работы явилась идентификация, структурная и биохимическая характеристика ранее неизвестных белковых компонентов пресинаптического аппарата.

В качестве ключевого методического подхода к решению данной задачи было выбрано использование природного нейротоксина альфа-латротоксина (далеелатротоксина) в качестве инструмента исследования. Латротоксин является пресинаптическим токсином, вызывающим массовый выброс нейромедиатора путем стимуляции экзоцитоза синаптических везикул (Ceccarelli and Hurlbut, 1980; Gorio et al., 1978; Tzeng et al., 1978; Tzeng and Siekevitz, 1978; Tzeng and Siekevitz, 1979aTzeng and Siekevitz, 1979b). Латротоксин стимулирует выброс различных нейромедиаторов, в том числе ацетилхолина, глютамата, ГАМК и др. Более того, латротоксин стимулирует экзоцитоз в секреторных клетках, таких как хромафинные и панкреатические клетки (Bittner and Holz, 2000; Bittner et al., 1998; Lang et al., 1998).

Многочисленные исследования указывают на то, что действие латротоксина определяется наличием специфических белков на поверхности клетки, с которыми токсин связывается с высокой аффинностью в наномолярном диапазоне. За данными белками исторически утвердилось наименование «рецепторы латротоксина» (Meldolesi, 1982), хотя, поскольку латротоксин не является физиологическим эндогенным лигандом данных мембранных белков, правильнее было бы их именовать «акцепторами латротоксина».

В результате связывания токсина с мембранными рецепторами, его молекулы частично погружаются в мембрану и образуют катион-селективные поры, что объясняет большинство эффектов латроксина на клетку, включая стимуляцию секреции и цитотоксичность (Grasso et al., 1980; Krasil’nikov et al., 1982; Mironov et al., 1986; Orlova et al., 2000; Robello, 1989; Tse and Tse, 1999). В то же время ряд экспериментов указывает на то, что действие латротоксина возможно в условиях, когда ионные потоки контролируются и повышения кальция внутри клетки не наблюдается (Capogna et al., 1996; Meldolesi et al., 1983; Misler and Falke, 1987; Rosenthal et al., 1990). В частности было предложено, что латротоксин частично проходит через цитоплазматическую мембрану и за счет внутриклеточных взаимодействий активирует гипотетический эффектор, сопряженный с аппаратом экзоцитоза (Khvotchev and Sudhof, 2000).

Несмотря на то, что детальный механизм действия латротоксина остается предметом дискуссии, не вызывает сомнений тот факт, что его рецепторы, присутствующие в нервных тканях в относительно низких концентрациях, являются маркерами зон экзоцитоза и вовлечены в регуляцию нейросекреции. Этим определяется интерес к рецепторам латротоксина и интенсивные исследования в различных лабораториях мира, направленные на их идентификацию и структурно-функциональную характеристику (Rosenthal and Meldolesi, 1989).

Начальные эксперименты по характеристике рецепторов латротоксина показали, что они обратимо связывают латротоксин с высокой аффинностью (Кд порядка Ю~10 М" 1), имеют белковую природу и сконцентрированы в зонах пресинаптических контактов (Grasso et al., 1982; Meldolesi, 1982; Tzeng and Siekevitz, 1979bUshkarev Iu and Grishin, 1986; Valtorta et al., 1984). Также было показано, что количество латротоксин-связывающих участков уменьшается примерно в два раза при удалении кальция из внешней среды хелатированием (Meldolesi, 1982).

В середине 80-х годов прошлого столетия была предложена методика солюбилизации рецепторов латротоксина неионными детергентами, в частности тритоном Х-100. Солюбилизация сохраняла латротоксин-связывающие свойства рецепторов и открывала возможность для их выделения хроматографическими методами. Первая попытка выделения рецепторов латротоксина завершилась идентификацией мультимерного комплекса массой 200 кДа, состоящего из субъединиц массой 54 и 66 кДа (Scheer and Meldolesi, 1985). Однако, поскольку количество выделенного белка находилось на грани детекции, достоверность идентификации рецепторов вызывала сомнение.

На первом этапе данной работы была поставлена задача вьщеления рецепторов латротоксина и их первичная характеристика белковым электрофорезом. При этом учитывалось, что возможно также со-выделение белков, не являющихся непосредственно рецепторами токсина, но специфически взаимодействующих с ними, а также примесных белков, не имеющих отношения к рецепторам.

В связи с этим, на втором этапе работы планировалось идентифицировать выделенные белки по их аминокислотной последовательности, получить антитела к ним и определить их роль в рецепции латротоксина. Ключевой задачей на этом этапе стало клонирование структурных генов ранее неизвестных белков, определение их нуклеотидной последовательности, и функциональная экспрессия в эукариотических клетках.

Целью следующего этапа исследования стало определение мембранной топологии и доменной структуры найденных рецепторов путем компьютерного анализа их аминокислотной последовательности в сочетании с иммунохимическим анализом. Также была поставлена задача определения участков связывания латротоксина в полипептидных цепях рецепторов.

В ходе данной работы был открыт рецептор, являющийся представителем нового семейства природных гибридов G белок-сопряженных рецепторов и белков клеточной адгезии. Было показано, что данный рецептор, кодируемый одним геном, состоит из двух субъединиц. В связи с этим, была поставлена отдельная задача по детальному изучению механизмов эндогенного протеолиза данного рецептора с целью определения участка расщепления и локализации клеточного отдела протеолитического процессинга.

В процессе исследования нами была разработана оригинальная методика и осуществлено выделение рецепторов латротоксина и ассоциированных с ними белков аффинной хроматографией. Впервые установлено, что латротоксин имеет три типа белковых рецепторов в нервных тканях: нейрексин или кальций-зависимый рецептор, CIRL (Calcium-Independent Receptor of Latrotoxin — кальций-независимый рецептор латротоксина), являющиеся ранее неизвестными белками, и тирозин-фосфатазу сигма РТР а. Интересно, что рецепторы латротоксина не имеют между собой заметной структурной гомологии и принадлежат к трем различным классам рецепторов поверхности клетки. Нейрексин является белком клеточной адгезии с одним трансмембранным сегментом, CIRL — G белок-сопряженным рецептором, а РТРа — мембранной тирозин-фосфатазой.

На основе информации о частичной аминокислотной последовательности осуществлено клонирование полноразмерной кДНК рецептора CIRL. По определенной нуклеотидной последовательности выведена аминокислотная последовательность состоящая из 1471 остатка. Клонированы также два близких гомолога CIRL — CIRL-2 и CIRL-3. Показано, что CIRL-1 и CIRL-3 экспрессируются преимущественно в нервной ткани, в то время как CIRL-2 встречается практически во всех тканях. Установлено, что рецепторы CIRL принадлежат семейству 11(B) G-белок-сопряженных рецепторов. В составе большой внеклеточной части CIRL идентифицированы домены характерные для белков клеточной адгезии: лектиновый, олфактомединовый и муциновый. Таким образом, CIRL является представителем нового семейства природных гибридов G белок-сопряженных рецепторов и белков клеточной адгезии.

Экспрессией CIRL и РТРо в эукариотических клеточных линиях и хромафинных клетках доказано, что клонированные CIRL и РТРа являются функционально-активными рецепторами латротоксина. Направленным мутагенезом определено расположение основных участков связывания латротоксина в CIRL и РТРо.

Впервые установлено, что CIRL, кодируемый одним геном, состоит из двух различных нековалентно связанных субъединиц — р120 и р85, что необычно для G-белок-сопряженных рецепторов. Обнаружена растворимая форма CIRL, представляющая собой комплекс внеклеточной субъединицы р120 и короткого пептидного N-концевого фрагмента р85. Показано, что двухсубъединичная структура CIRL является следствием эндогенного внутриклеточного протеолиза и определен сайт расщепления рецептора.

Установлено, что сайт протеолиза находится внутри цистеини триптофан-богатого домена содержащего ранее неизвестный структурный мотив, характерный для семейства природных гибридов G белок-сопряженных рецепторов и белков клеточной адгезии. Поскольку мутации в этом домене приводят к устойчивости CIRL к расщеплению, предложено присвоить данному мотиву наименование GPS (G protein-coupled receptor Proteolysis Site).

Полученные нами результаты имеют не только научное, но и прикладное значение. Основная масса широко используемых в настоящее время лекарств, в качестве мишеней, используют G белок-сопряженные рецепторы. Поэтому, каждый вновь открытый G белок-сопряженный рецептор представляет собой потенциальный объект для создания новых лекарств. Структурный и предварительный функциональный анализ CIRL позволяет предположить, что химические соединения, являющиеся его агонистами либо антагонистами, могут быть использованы для лечения неврологических и психических заболеваний, сопровождающихся нарушениями нейросекреции. Также возможно, что модуляция активности членов семейства рецепторов CERL позволит контролировать рост злокачественных опухолей. В связи с потенциальной практической значимостью рецептора CIRL на его открытие был получен патент.

140 ВЫВОДЫ.

1. Разработана оригинальная методика и осуществлено выделение нейрональных рецепторов пресинаптического нейротоксина латротоксина. Открыты два ранее неизвестных белка: нейрексин и CIRL (Calcium-Independent Receptor of Latrotoxin), являющиеся высокоаффинными рецепторами латротоксина. Впервые показано, что ранее известный белок тирозин-фосфатаза сигма (РТРо) также является рецептором латротоксина. Таким образом, латротоксин является уникальным примером природного токсина, имеющего три независимые и структурно отличные мишени, принадлежащие к трем различным классам рецепторов поверхности клетки.

2. Осуществлено клонирование полноразмерной кДНК рецептора CIRL, определена ее нуклеотидная последовательность и выведена полная аминокислотная последовательность рецептора CIRL из мозга крысы, состоящая из 1471 остатка.

3. Показано, что CIRL принадлежит к семейству 11(B) G белок-сопряженных рецепторов. В составе большой внеклеточной части CIRL обнаружены структурные домены, характерные для белков клеточной адгезии: лектиновый, олфактомединовый и муциновый. Таким образом, CIRL является представителем ранее неизученного класса природных гибридов G белок-сопряженных рецепторов и белков клеточной адгезии.

4. Клонированы кДНК и определены полные аминокислотные последовательности двух других рецепторов, высоко гомологичных CIRL — CIRL-2 и CIRL-3. Показано, что CIRL (CIRL-1) и CIRL-3 экспрессируются преимущественно в нервной ткани, в то время как CIRL-2 присутствует практически во всех тканях.

5. Осуществлена экспрессия CIRL в эукариотических клеточных линиях и хромафинных клетках. Анализом трансфецированных клеток доказано, что клонированный CIRL действительно является высокоаффинным рецептором латротоксина, в то время как CIRL-2 — низкоаффинным рецептором латротоксина. Функциональная экспрессия данных рецепторов в хромафинных клетках подтвердила, что взаимодействие с ними латротоксина приводит к стимуляции экзоцитоза.

6. Определено местоположение основного участка связывания латротоксина в районе 467 770 аминокислотных остатков N-концевой внеклеточной части CIRL.

7. Установлено, что CIRL состоит из двух нековалентно связанных субъединиц — р120 и р85, кодируемых одним геном. Показано, что двухсубъединичная структура CIRL является следствием эндогенного внутриклеточного протеолиза рецептора.

8. Определен участок протеолитического расщепления CIRL, находящийся в его внеклеточной части между остатками Leug37 и ТЬгюв. Компьютерным анализом показано, что данный сайт протеолиза находится внутри цистеини триптофан-богатого домена с ранее неизвестным структурным мотивом CX2WX6−16WX4CX10−22CXC, получившим наименование GPS (Q protein-coupled receptor Eroteolysis Site). Мутации в GPS домене приводят к устойчивости CIRL к протеолизу. Предложена гипотеза, что наличие GPS домена является ключевым фактором, определяющим эндогенный протеолиз и двух-субъединичную структуру гибридных G белок-сопряженных/адгезивных рецепторов.

9. Открыт новый секретируемый гликопротеин нейрексофилин, способный образовывать комплексы с нейрексином, и определена его полная аминокислотная последовательность по структуре кДНК крысы и быка. Структурные особенности нейрексофилина свидетельствуют о том, что он является эндогенным лигандом нейрексина.

10. Обнаружено взаимодействие рецепторов латротоксина с синаптотагмином и синтаксином, указывающее на то, что рецепторы латротоксина являются компонентами пресинаптических комплексов вовлеченных в экзоцитоз.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Осуществлению намеченных планов и завершению работы над диссертацией во многом способствовали плодотворные дискуссии с академиками РАН Вадимом Тихоновичем Ивановым и Анатолием Ивановичем Мирошниковым, членами Национальной Академии США Томасом Зюдофом и Йосифом Шлессенджером, а также с членами-корреспондентами РАН Евгением Васильевичем Гришиным и Александром Габйбовичем Габибовым, за что автор им искренне признателен.

Автор считает своим приятным долгом поблагодарить коллег и друзей, совместно с которыми были получены экспериментальные результаты, составившие основу данной работы: Валерия Красноперова, Константина Ищенко, Виктора Коваленко, Юрия Ушкарева и Олега Чепурного.

Работа выполнялась при поддержке Программы по Физико-Химической Биологии РАН, Национальных Институтов Здоровья (США) и Медицинского Института Говарда Хьюза (США).