Внецентросомные детерминанты организации микротрубочек в интерфазных клетках

Цитоскелет животных клеток, представленный микротрубочками, актиновыми микрофиламентами и промежуточными филаментами, обеспечивает внутриклеточный транспорт молекул и органелл, а также перемещение самих клеток.

Интерфазные микротрубочки в большинстве типов культивируемых клеток и в некоторых дифференцированных клетках in situ организованы в радиальную систему: к периферии клетки они отходят от центра организации, которым в большинстве случаев служит центросома. На центросоме начинается рост микротрубочек и заякориваюгся их «минус"-концы. Транспорт вдоль микротрубочек осуществляется при помощи моторных белков — специализированных механохимических АТФаз, относящихся к двум семействам: динеинам и кинезинам. Динеины перемещаются по направлению к «минус"-концу микротрубочек, а кинезины — к «плюс"-концу. Таким образом, радиальная организация микротрубочек обеспечивает направленность внутриклеточного транспорта. Однако радиальная система микротрубочек может образовываться и без участия центросомы. Такая система обнаружена, например, в бесцентриолярных фрагментах меланофоров рыб (Rodionov and Borisy, 1997; Cytrynbaum et al., 2004; Malikov et al., 2005), и организаторами этой системы служат меланосомы. В монослое клеток эпидермиса микротрубочки образуют радиально-подобную систему без выраженного центра, где микротрубочки отходят от околоядерной области в направлении к периферии (Lechter and Fuchs, 2007). Другие, помимо центросомы, центры организации системы микротрубочек изучены недостаточно. Центросома обычно является очень мощным, доминирующим центром организации микротрубочек и в ее присутствии остальные центры организации микротрубочек могут быть незаметны. Предполагают, что в организации системы микротрубочек в клетках млекопитающих участвуют динеин-динактиновые комплексы, связанные транспортными везикулами или органеллами аппарата секреторного транспорта. Сами везикулы могут организовывать микротрубочки, нуклеируя их, ассоциируясь с ними и передвигаясь по ним, подобно пигментным гранулам во фрагменте меланофора (Malikov et al., 2005). Роль мембран в организации системы микротрубочек практически не исследована, хотя в последнее время появились работы, свидетельствующие о том, что мембраны аппарат Гольджи содержат белковые комплексы, нуклеирующие микротрубочки (Efimov et al., 2007).

Очевидно также, что для поддержания радиальной структуры сети микротрубочек, помимо центра организации, важным условием (детерминантой) является остановка роста микротрубочек у клеточной границы. Иначе бы отдельная микротрубочка могла, достигнув мембраны, свернуть и продолжить свой рост в другом направлении, хаотизируя тем самым общую радиальную систему. Роль этого фактора в формировании системы микротрубочек пока остается малоизученной.

Мы исследовали организацию микротрубочек на экспериментальной модели цитопластов — безъядерных клеток, используя цитопласты, содержащие или не содержащие центросому. Полученные нами данные проясняют некоторые особенности в организации радиальной системы микротрубочек в клетке, а также свидетельствуют о наличии определенных внецентросомных факторов, влияющих на организацию микротрубочек. В частности, нам удалось установить роль компонентов везикулярного транспорта между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи в организации микротрубочек.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Строение микротрубочек.

Микротрубочки являются полярными биополимерами, полыми внутри с диаметром 25 нм. Структурными единицами микротрубочки являются гетеродимеры альфаи бета-тубулина, связанные с двумя молекулами ГТФ. ГТФ, связанный с а-субъединицей, не подвергается гидролизу, а связанный с ртубулином способен гидролизоваться до ГДФ после полимеризации миктротрубочки.

Структура микротрубочек поддерживается латеральными и продольными взаимодействиями между субъединицами тубулина. Продольные соединения, которые образуются в результате гидрофобных взаимодействий, формируют протофиламент, в котором мономеры соединены «голова к хвосту» и альфа-субъединицы чередуются с бета-субъединицами. За взаимодействие латеральных поверхностей субъединиц ответственны электростатические силы, которые соединяют протофиламенты в одномолекулярный слой, а последний сворачивается в цилиндр — микротрубочку. Схематично модель организации микротрубочки представлена на Рис. 1 (Song et al., 1993).

Саму микротрубочку формируют 13 протофиламентов, и микротрубочки обычно находятся в синглетном состоянии. Однако в некоторых специализированных структурах они функционируют в виде дублетов (реснички и жгутики) или триплетов (центриоли и базальные тела).

То, что мономером в построении микротрубочек является гетеродимер альфаи бета-тубулина, определяет полярность микротрубочки: аи р-тубулины располагаются на 5 минус" — и «плюс"-концах соответственно. Константы диссоциации тубулина различаются на двух концах: меньшая константа соответствует «плюс"-концу микротрубочки, т. е. на нем преимущественно идет рост микротрубочки. субъединица.

-*-> v альфа-туб" «» «^» -^улин протофипамент {(.

•21 иш.

Рис. 1. Схема строения микротрубочки (Song et al., 1993, с изменениями).

Микротрубочки in vivo находятся в динамическом равновесии со свободным тубулином. Существует интервал концентраций тубулина, в котором на «плюс"-конце микротрубочки идёт в основном присоединение субъединиц, а на «минус"-концепреимущественно отсоединение. При этом наблюдается псевдопередвижение микротрубочек — тредмиллинг, когда каждая точка микротрубочки неподвижна, но сама микротрубочка передвигается в направлении своего «плюс"-конца. При более низкой концентрации свободного тубулина наблюдается так называемая динамическая нестабильность микротрубочек — периодическая сборка и разборка, происходящие на «плюс"-конце. Нарастание «гопос"-концов микротрубочки, сменяющееся через 10−30 секунд их укорочением, а затем вновь нарастанием, является основным способом обмена микротрубочек практически во всех исследованных клетках, имеющих центросому (Waterman-Storer and Salmon, 1997).

Микротруб очки образуют систему в клетке, называемую микротрубочковый цитоскелет. Он представляет собой сеть, которая обеспечивает поддержание формы и создает упорядоченную систему движений внутриклеточных компонентов интерфазной и митотической клетки.

В интерфазных клетках микротрубочки часто организованы радиально: их «плюс"-концы находятся на периферии клетки, а «минус"-концы собраны в центре, образуя так называемый центр организации микротрубочек (МТОЦ), которым часто является специальная клеточная органелла — центросома, состоящая из центриолей и перицентриолярного материала. С микротрубочками могут взаимодействовать различные белки. Некоторые из них связываются с растущими «плюс"-концами, регулируя динамику самих микротрубочек, обеспечивая взаимодействия с белками мембранных везикул, с клеточным кортексом. Белки, находящиеся на «минус"-конце, обеспечивают его стабильность, не давая микротрубочки сразу же разобраться, и заякоривают ее в перицентриолярном материале. Белки, связывающиеся с микротрубочками по всей длине — латерально МАРы (microtubule associated proteins) — влияют на стабильность микротрубочек. К стабилизирующим белкам относят MAPI, МАР2, МАР4, тау, chTOG: их присоединение стимулирует сборку микротрубочек, стабилизирует их и иногда объединяет в пучки (Dehmelt et al., 2005). К дестабилизирующим микротрубочки относят белки Ор18/статмин и ХКСМ1 (Holmfeldt et al., 2009).

Ор18/статмин связывается с димерами тубулина, изменяя их конформацию и делая невозможным встраивание в растущую микротрубочку. ХКСМ1 увеличивает количество катастроф (разборки микротрубочек с «плюс"-конца). «Плюс"-концевые белки, например, ЕВ1 или CLIP 170, специфически связываются с растущим концом микротрубочки. Если миротрубочка прекращает рост, «плюс"-концевые белки тут же отделяются от нее. «Плюс"-концевые белки регулируют динамическую нестабильность микротрубочек и нередко опосредуют взаимодействие микротрубочек с везикулярными компонентами клеток.

Кроме того, с микротрубочками взаимодействуют и моторные белки, перевозящие молекулы и органеллы внутри клетки: кинезины и динеины.

Система микротрубочек с центром в центросоме Нуклсация миктротрубочек на центросоме.

При достижении в растворе определенной концентрации мономеров тубулина (критической концентрации) последние могут самопроизвольно полимеризоваться с образованием микротрубочек. Наблюдать за данным процессом in vitro можно, например, с помощью турбодиметрии (Рис. 2): при увеличении концентрации тубулина в растворе на кривой изменения светопоглощения по времени происходит излом, характеризующийся появлением растущих микротрубочек в растворе тубулина (Carlier et al., 1984). Первый этап полимеризации — нуклеация — в растворе чистого тубулина протекает с трудом, то есть критическая концентрация тубулина должна быть достаточно высока. Как же можно организовать микротрубочки в клетке? Существуют белковые комплексы, специализирующиеся на нуклеации микротрубочек. Располагаются такие комплексы в основном на центросоме, однако небольшое их число встречается на мембранных органеллах в цитоплазме. На данных комплексах полимеризация тубулина происходит при более низкой концентрации, чем в случае свободного тубулина, то есть центросома снижает критическую концентрацию тубулина для полимеризации, тем самым автоматически запрещается свободная полимеризация тубулина в растворе, так как концентрация свободного тубулина будет недостаточна для этого (Michson and Kirshner, 1986). f с E Q.

О <

— 0.5.

— 0.10.

— 0.154.

1 2 3.

3 4 5.

Tubulin Dimer Concentration, fM.

Рис. 2 Исследование полимеризации тубулина in vitro. При достижении определенной концентрации тубулина в растворе, называемой критической концентрацией (Сс) просходит полимеризация тубулина, что выражается в изломе на графике зависимость скорости изменения оптической плотности раствора от концентрации димеров тубулина (Carlier et al., 1984).

Исследовать нуклеацию микротрубочек в клетке можно несколькими способами. Так, разобрав микротрубочки нокодазолом, можно отмыть его, фиксировать клетки через определенные промежутки времени и окрашивать антителами к тубулину. Тогда сначала будет видна только центросома, потом — отрастающие от нее короткие микротрубочки в виде звезды, а далее — микротрубочки уже дорастут до периферии клетки. Если предварительно трансфицировать клетки GFP-тубулином, можно проводить подобные наблюдения прижизненно, наблюдая за ростом микротрубочек по флуоресценции GFP. Кроме того, о нуклеирующей активности центросомы можно судить по скорости и количеству отлетающих от нее «комет» флуоресцентно меченых «плюс"-концевых белков (например, ЕВ1 или CLIP 170). Эти белки специфически связываются с растущим концом микротрубочки и, по мере удлинения микротрубочки, удаляются от центросомы, напоминая летящую «комету».

Гамма-тубулин считается главным фактором для нуклеации микротрубочек. Он совместно с некоторыми другими белками образует кольцевой комплекс гамма-тубулина (уtubulin ring complex — уTuRC), прикрепляющийся к центросоме за счет перицентрина. Комплекс по форме напоминает шайбу, и размер его соответствует диаметру микротрубочки (Moritz et al., 1995; Dictenberg et al., 1998). Изолированные из ооцитов Xenopus’a уTuRC способны нуклеировать МТ in vitro (Zheng et al., 1995). Используя метод иммуноэлектронной микроскопии, можно показать наличие комплексов гамма-тубулина в основании растущих микротрубочек в клеточных экстрактах системе in vitro, лишенных центросом (Keating and Borisy, 2000).

Чтобы доставить на центросому белки, вовлеченные в нуклеацию и заякоривание микротрубочек, требуется работа «минус"-концевого мотора динеина. Это показано для у-тубулина, перицентрина (Young et al., 2000), найнеина (Mogensen et al., 2000) в интерфазе и для белков NuMa и динактина в митозе (Merdes et al., 1996, 2000). Роль динеина в организации микротрубочек не ограничивается доставкой центросомных белковсуществуют данные о непосредственном участии динеина в нуклеации и заякоривании микротрубочек (Malikov et al., 2005).

Заякоривание микротрубочек на центросоме.

После нуклеации на центросоме микротрубочки некоторое время остаются связанными с ней своими «минус"-концами. Возникает вопрос, как же микротрубочки остаются связанными (заякоренными) с центросомой?

Важным заякоривающим фактором является найнеин, фибриллярный белок, включающий в себя участки со структурой скрученной спирали (coiled-coil) и способный к олигомеризации с образованием макромолекулярных комплексов, локализованных в центросоме (Bouckson-Castaing et al., 1996; Mogensen et al., 2000). Он, вероятно, кэпирует «минус"-концы микротрубочек, защищая их от деполимеризации, хотя эта его функция пока экспериментально не доказана. Также, по-видимому, наряду с перицентрином найнеин вовлечен в удержание нуклеирующих кольцевых комплексов гамма-тубулина на центросоме (Delgehyr et al., 2005). Найнеин транспортируется на центросому динеином, связываясь с ним через белок семейства bicaudal BicD (Fumoto et al., 2006).

Белок 4.1R (Red-blood-cell protein 4.1) также участвует в заякоривании микротрубочек. Сам 4.1R был обнаружен как адаптерный между интегральными белками плазматической мембраны эритроцитов и подлежащей актин-спектриновой сетью филаментов. В неэритроидных клетках 4.1R также экспрессируется и обнаруживается в ядре и в области центросомы. Трансфекция клеток 4.1R приводит к хаотизации системы микротрубочек, но нуклеирующая активность центросомы при этом сохраняется (Perez-Ferreiro et al., 2004).

Еще одним белком, участвующим в организации микротрубочек, является Сер135. Его экспрессия или нокдаун приводят к дезорганизации системы микротрубочек в интерфазе и во время митоза (Ohta et al., 2002). Недавно был обнаружен молекулярный партнер Сер135 — им оказался компонент динактинового комплекса — динамитин р50. Своей центральной частью р50 взаимодействует с С-концом Сер 135. Динамитин, лишенный Сер135-связывающей области, перестает локализоваться на центросоме. Такой же эффект наблюдается и при нокдауне Сер135. При этом истощаются центросомные пулы гамма-тубулина и перицентрина, что свидетельствует о важности Сер 135 для рекрутирования основных центросомных белков (Uetake et al., 2004).

В заякоривании микротрубочек также принимает участие комплекс белков САР350 (centrosome-associated protein) и FOP (fibroblast growth factor receptor — 1 oncogene partner). CAP350 содержит консервативный микротрубочки-связывающий CAP-Gly домен и локализуется на центросоме. Своим С-концом он взаимодействует с белком FOP, который отвечает за центросомную локализацию ЕВ1, а также включает в себя LisH-мотив, встречающийся у белков, регулирующих динамику микротрубочек. Нокдаун САР350 или его партнера приводит к хаотизации микротрубочек (Yan et al., 2006). Третий партнер — белок ЕВ1 — больше известен как связывающийся с «плюс"-концами микротрубочек и регулирующий их динамику. Однако центросомная локализация позволяет предположить его участие в процессах организации микротрубочек. Действительно, дисфункция ЕВ1 приводит к хаотизации микротрубочек. Также известно, что ЕВ1 привлекает на центросому субъединицу динактинового комплекса pl50oiued (Askham et а1) 2002), которая вовлечена в заякоривание микротрубочек (Quintyne et al., 1999).

В динеин-зависимой доставке многих центросомных белков (динактина, Lisl, РСМ1) принимает участие белок материнской центриоли Nudel. Также, независимо от динеина, он обеспечивает центросомную локализацию перицентрина и гамма-тубулина. Нокдаун Nudel влечет за собой нарушение нуклеации микротрубочек и их заякоривания (Guo et al., 2006).

Системы микротрубочек, построенные без участия центросомы.

В большинстве фибробластоподобных клетках, культивируемых в культуре (Vero, СНО и др.) имеется радиальная сеть микротрубочек с довольно выраженным центром в центосоме, однако в клетках эпителиального происхождения, таких как HeLa система микротрубочек не имеет выраженного центра. Также в очень многих дифференцированных клетках организма система микротрубочек организуется без видимого участия центросомы. Интересно поэтому понять, как же образуются данные системы микротрубочек.

Поведение микротрубочек в эпителиальных культурах отличается от культур фибробластов (Pepperkok et al., 1990; Shelden and Wadsworth, 1993; Waterman-Shtorer et al., 2000). Наблюдаемая здесь скорость роста и разборки микротрубочек с плюс конца медленнее, а периоды колебаний в длине короче (Shelden and Wadsworth, 1993), свободные микротрубочки спонтанно возникают в цитоплазме и их поведение можно описать скорее как динамическую нестабильность, тогда как в фибробластах наблюдается тредмиллинг свободных микротрубочек (Rodionov et al., 1999). Интересно, что изменение параметров динамики микротрубочек зависит от экспрессии Е-кадгерина. При его экспрессии в клетках наблюдается стабилизация минус конца микротрубочки в клетке, что и изменяет динамику микротрубочек (Chansovsky et al., 2000, Shtutman et al., 2008).

Если рассматривать клетки поляризованного эпителия, например, MDCK1 или Сасо-2, то в разреженной культуре они имеют фибробластоподобный вид с радиальной системой микротрубочек. Однако при достижении монослоя система микротрубочек в клетке постепенно изменяется, в дифференцированном состоянии она становится нецентросомно организованной: минус-концы микротрубочек заякорены в районе апикальной части плазматической мембраны, а плюс-концы направлены к базолатеральной мембране (Meads and Schroer, 1995). Так образуется система полярно ориентированных микротрубочек, обеспечивающих направленный транспорт везикул от одной мембраны к другой. Причем эффективный сортинг везикул в поляризованных клетках зависит от наличия такой системы микротрубочек (Miinsh, 2004).

Похожем же образом организуется система микротрубочек у гепатоцитов, там апикальный кортекс, заякоривающий минус-концы микротрубочек, располагается в той части гепатоцита, которая обращена к желчному протоку (Ihrke et al., 1993).

В поляризованных эпителиальных клетках, кроме параллельных оси микротрубочек в толще клетки, также присутствуют микротрубочки в подмембранной области апикалькальной части базальной мембраны, где образуется специальная сеть из микротрубочек смешанной полярности (Bre et al., 1987). Данная система также далеко не случайна, а имеет отдельные области, где микротрубочки перекрещиваются, а также замедляется деполимеризация минус-конца микротрубочки. В результате образуется паутиноподобная сеть, где в свою очередь точки нуклеации не совпадают с узелками сети (Reilein et al., 2005).

В неполяризованных эпителиальных клетках можно наблюдать систему микротрубочек без выраженного центросомного центра организации (Grindstaff et al.,.

1997). Такая система микротрубочек близка к радиальной, однако микротрубочки здесь отходят от области ядра, где сконцентрированы их минус концы, подобную же картину можно наблюдать в кератиноцитах эпидермиса (Lechter and Fuchs, 2007).

Еще одним примером образования нецентросомной системы микротрубочек является дифференцировка миобластов в миотрубки, которая происходит при образовании мышечной ткани. В недифференцированных миобластах можно наблюдать характерную фибробластоподобную систему микротрубочек с центром, организованным центросомой (Pizon et al., 2005). Однако при дифференцировке миобласты начинают сливаться в миотрубки, при этом происходит перестройка системы микротрубочек в слитых клетках, активность центросомы исчезает, а микротрубочко-нуклеирующие белки перераспределяются с центросомы в околоядерную область (Fant ct al., 2009). Вследствие этого микротрубочки начинают тянуться по всей длине получившейся клетки (Pizon et al., 2005).

В нейронах также микротрубочки полимеризуются на центросоме, которая находится в теле нейрона. Однако в отростках представлены свободные микротрубочки, расположенные вдоль их оси (Signor and Scholey, 2000, Bartolini and Gundersen, 2006), Интересно, что полярность микротрубочек различна в аксоне и дендрите: в аксоне микротрубочки ориентированы минус-концами к телу нейрона, а плюс концы смотрят на периферию, а в дендритах присутствуют микротрубочки смешанной полярности (Baas et al., 1988). Это достигается путем направленного транспорта микротрубочек в дендриты.

Таким образом, можно видеть, что достаточно часто в интерфазе система микротрубочек организуется без участия центросомы. Интересно было бы определить, существуют ли в данном случае МТОЦ, или же это происходит по механизму самоорганизации.

Для изучения бесцентросомной организации сети микротрубочек удобно использовать модели, которые представляют собой безъядерные клетки — цитопласты. Для получения цитопластов обычно используют метод центрифугирования в присутствии нокодазола (разборка микротрубочек) и цитохалазина D или латранкулина В (разборка актиновых филаментов) (Karsenti et al., 1984). Причем в присутствии нокодазола и цитохалазина D (или латранкулина В) получаются как цитопласты, содержащие центросому, так и лишенные ее, а при добавлении в среду лишь цитохалазина В получаются только содержащие центросому цитопласты. В результате при использовании линии клеток мышиных фибробластов L 929 Karsenti с соавт. (1984) показали, что цитопласты с центросомой образовывали радиальную систему микротрубочек, а у бесцентросомных система микротрубочек была хаотической.

Другой способ получения цитопластов состоит в отрезании стеклянной иглой части цитоплазмы с ядром. Такие цитопласты получали из клеток культуры эпителия почки зеленой мартышки BSC-1, отделяя фрагмент, содержащий ядро (кариопласт), от участка цитоплазмы с центросомой (Maniotis and Schliwa, 1991). Далее при наблюдении за системой микротрубочек в полученных кариопласте и цитопласте оказалось, что при коротких интервалах инкубации (порядка 1 часа) после операции радиальную систему микротрубочек образовывал цитопласт с центром в центросоме, тогда как у кариопласта система микротрубочек становилась хаотической. Однако при длительном времени инкубирования (порядка 20 часов) ситуация менялась, и уже радиальную систему микротрубочек образовывал кариопласт (бесцентросомный), восстанавливавший нормальные размеры клетки, но не центросому. Впрочем, для некоторых видов клеток в более поздних работах показана возможность восстанавливать центросому de novo (La Terra et al., 2005). У цитопласта же система микротрубочек становилась хаотической. Можно было предположить, что в стареющем цитопласте теряла свою активность центросома.

Здесь мы видим некоторое отличие между цитопластами, полученными из культур эпителиальных клеток и фибробластов. Так, в статье (Rodionov et al., 1999) изучали иммунофлуоресцентным методом распределение микротрубочек и наличие центросомы в цитопластах фибробластов (СНО-К1) и эпителия (BSC-1). В цитопластах клеток СНО с центросомой наблюдалась радиальная система микротрубочек, а без центросомы хаотическая, причем в целых клетках центросома находилась в центре организации радиально расположенных микротрубочек. В цитопластах клеток BSC-1 радиальная система микротрубочек наблюдалась и в цитопластах с центросомой, и без нее. Было предположено, что радиальная система микротрубочек в цитопластах BSC-1 образовывалась с помощью аппарата Гольджи, как бы выполнявшего роль пигментных гранул во фрагменте меланофора (Malikov et al., 2005).

Динеин-зависимый транспорт молекул и органелл по микротрубочкам.

Основной транспорт мембранных везикул и органелл внутри клетки проходит с помощью микротрубочкового цитоскелета, по которому осуществляют движение молекулярные моторы — специализированные механо-химические АТФазы. Эти АТФазы, гидролизуя АТФ, меняют свою конформацию и могут перемещаться по микротрубочке. Различают два типа моторов по направлению, в котором они перемещаются по микротрубочке. Семейство кинезинов — плюс-концевые моторы, они перемещаются от минус-конца микротрубочек к их пшос-концу. Наоборот же к минус-концу транспортирует свои грузы динеин.

Структура динеин-динактинового комплекса.

В клетках имеется два вида динеинов: аксонемный и цитоплазматический.

Аксонемный динеин обеспечивает биение жгутиков, например, у сперматозоидов, и ресничек. Цитоплазматический динеин осуществляет транспорт различных грузов, органелл, а также участвует в формировании веретена делния в клетке.

Динеин относится к классу AAA-белков (ATPase Associated with diverse cellular Activities). В его моторном домене, входящем в состав тяжелой цепи, локализовано 6 AAA-доменов, четыре из которых способны гидролизовать АТФ. Эти домены образуют тороидальную структуру. Имеется также длинный тонкий выступ молекулы, связывающийся с тубулином микротрубочек. Гидролиз АТФ приводит к вращению тороидальной структуры и смещению выступа (King, 2000; Mallik and Gross, 2004).

Цитоплазматический динеин является мультисубъединичным комплексом с массой 1,2 MDa. В его состав входят две тяжелые цепи 530 kD, три промежуточных цепи 74 kD, четыре легкие промежуточные цепи 55 kD, а также несколько легких цепей 8−20 kD (Hirokawa et al., 1998). В геноме млекопитающих имеются гены для двух изоформ тяжелой цепи цитоплазматического динеина, но одна из них — DCHC1 — является мажорной и представлена повсеместно, а другая — DCHC2 — минорна и коррелирует с образованием первичных неподвижных ресничек. Для других субъединиц динеина известно по нескольку изоформ (Pfister et al., 2006, Palmer et al., 2009).

Динактин был открыт как активатор динеин-зависимого движения везикул по микротрубочкам (Schroer and Sheetz, 1991). Динактиновый комплекс состоит из двух структурных доменов: актиноподобного минифиламента («плеча») и подвижного домена, прикрепляющегося к микротрубочкам и моторному белку («руки») (Рис. 3). Минифиламент размером 10*40 нм состоит из октамера родственного актину белка Arpl. Важной особенностью этого белка является способность связываться с pill-спектрином. Один из концов минифиламента связан с CapZ (Conventional Actin-capping Protein Z), a другой — с белками p62 и Arpll. Arpll стабилизирует «минус"-конец филамента, а р62 стабилизирует взаимодействие между Arpl и Arpl 1.

Структуру подвижного домена динактинового комплекса формируют белки pl50Glued, динамитин р50 и р24/р22. между собой, с pl50Glued, и белками р24/р22 с участками со структурой скрученной спирали. Сверхэкспрессия р50 вызывает диссоциацию pl50Glucd и р24/р22 от динактинового комплекса (Schroer, 2004).

Динактин локализован на центросоме, в полюсах деления, на «плюс"-концах микротрубочек и на разнообразных мембранных органеллах: эндосомных пузырьках, мембранах аппарата Гольджи и др.

Взаимодействие микротрубочкого цитоскелета с мембранными органеллами.

Микротрубочки служат «рельсами» по которым проходит транспорт различных клеточных компонентов, в том числе мембранных везикул. Основной функцией микротрубочек является обеспечение активного транспорта различных клеточных компонентов при помощи моторных белков, принадлежащих к семействам кинезинов или динеинов (Kamal and Goldstein, 2000). От конфигурации сетей микротрубочек в клетках зависит эффективность внутриклеточного транспорта. В принципе, транспорт от начального к конечному пункту может происходить и в бесструктурных микротрубочковых сетях. Короткие быстрые пробежки вдоль микротрубочек заметно увеличивают среднюю скорость перемещения груза по сравнению с простой диффузией в цитоплазме (Kahana et al., 2008), что способствует доставке груза по назначению. Эффективное же перемещение грузов по эндоцитозному или эзоцитозному путям (антероградный и ретроградный транспорт) требует достаточно строгой организации микротрубочек (полярзованные клетки). Однако в литератере имеются данные и о том, что сами мембранные органеллы могут виять на организацию сетей микротрубочек в клетках.

Показательны бесцентросомные цитопласты, получаемые из меланоцитов рыбклеток, наполненных пигментными гранулами. В таких цитопластах пигментные гранулы распределены равномерно, и их микротрубочки хаотичны. При действии на цитопласты адреналина пигментные гранулы собираются к центру цитопластов, и сеть микротрубочек становится более густой и, кроме того, радиальной, с центром в скоплении пигментных гранул (Рис. 4) (Rodionov and Borisy, 1997, Vorobjev et al., 2001). Полагают, что в формировании радиальной сети микротрубочек в этом случае участвует динеин, находящийся на мембране пигментных гранул (Malikov et al., 2004). Он принимает участие в нуклеации и, возможно, заякоривании микротрубочек на гранулах. Свойство пигментных гранул нуклеировать микротрубочки способствует самоорганизации гранул и микротрубочек в радиальную систему (Cytrynbaum et al., 2004; Malikov et al., 2005). В интактных меланоцитах это же свойство, вероятно, позволяет клеткам ускорять агрегацию гранул, что может иметь адаптивное значение для животного. 5.

Рис. 4. Формирование радиальной системы микротрубочек во фрагменте меланофора, лишенном центросомы. (А) — фазово-контрастная фотография меланофора с диффузно распределенными пигментными гранулами. (В) -распределение пигментных гранул через 10 мин после воздействия адреналином. © -распределение микротрубочек в меланофоре с фотографии b (Vorobjev et al., 2001).

Большинство животных клеток пигментных гранул не имеет, однако и другие мебранные органеллы могут принимать участие в организации микротрубочек. Они должны содержать на своей мембране белки, которые способны вызывать нуклеацию микротрубочек и способствовать их заякориванию. Взаимодействуя с радиальной системой микротрубочек, организованной центросомой, микротрубочки, организованные другими органеллами, нарушают структуру сети или способствуют поддержанию ее упорядоченности, что служит регулированию внутриклеточного транспорта. В качестве органелл, участвующих в организации микротрубочек, могут выступать аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум (ЭР), аппарат везикулярного транспорта между ЭР и аппаратом Гольджи, эндосомы и т. д. Вероятнее всего, митохондрии, хотя и транспортируются по микротрубочкам, не принимают участия в их организации, во всяком случае, мы не обнаружили данных на этот счет. ЭР, как правило, равномерно заполняет значительную часть объема клетки, поэтому может организовывать только хаотичную сеть микротрубочек. Аппарат Гольджи обычно представляет собой достаточно компактную мембранную структуру, расположенную в центре клетки возле центросомы. Структурная целостность и расположение аппарата Гольджи в клетках зависят от микротрубочек: при разрушении микротрубочек аппарат Гольджи фрагментируется (Рис.4), и его отдельные фрагменты распределяются по всей клетке (Cole et al., 1996). Аналогичный фенотип наблюдается также при ингибировании клеточного динеина, т. е. при нарушении зависимого от динеина клеточного транспорта. Ингибирование динеина достигают путем экспрессии компонента динактинового комплекса белка р50, что приводит к разрушению динактинового комплекса (Burhard et al., 1996) или же при продукции в клетке фрагмента СС1 белка динактина pl50Glued, который также ингибирующе действует на активность динеинового мотора (Quintyne et al., 1999).

Рис 5 Модель диспергирования аппарата Гольджи после деполимеризации микротрубочек. В контрольных клетках происходит циркуляция хозяйских белков аппарата Гольджи между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи, вследствие их антероградного и ретроградного транспорта. Так как ретроградный транспорт белков аппарата Гольджи мало зависит от наличия микротрубочек, при воздействии нокодазола, разрушающего микротрубочки, происходит блокада в основном антероградного везикулярного транспорта. Вследствие этого, происходит перераспределение белков аппарата Гольджи сначала в эндолпзаматический ретикулум, а потом формируются мини-цистерны аппарата Гольджи возле ERES. (Cole et al., 1996).

Везикулярный транспорт между ЭР и аппаратом Гольджи происходит одновременно в двух направлениях: прямом (антероградном) от ЭР в аппарат Гольджи и обратном (ретроградном), причем в ретроградном направлении доставляются компоненты ЭР, либо рециклирующие, либо синтезированные в аппарате Гольджи. При транспорте происходит отпочковывание везикул от ЭР или от цистерн Гольджи, их перенос по цитоплазме и слияние с рецепиентной структурой. При прижизненных наблюдениях клеток отчетливо видны везикулы, перемещающиеся между ЭР и аппаратом Гольджи по микротрубочковым трекам (Presley et al., 1997). Образование везикул на ЭР происходит в специальных доменах, называемых endoplasmic reticulum exit sites (ERES). После отпочковывания происходит слияние везикул между собой с образованием ERGIC (ER Golgi intermediate carrier/compartment) (Hauri et al., 2000, Appenzeller-Herzog С and Hauri, 2006) или, по другой терминологии, VTC (vesicule tubule clusters) (Altan-Bonnet et al., 2004). Динамику последнего можно наблюдать, используя термочувствительный мутант control мтос вирусного белка VSV-Gts045 (Presley et al., 1997). Он не может покинуть ЭР при 40 °C, и процесс экспорта легко синхронизировать, проинкубировав клетки некоторое время при этой температуре. Если понизить температуру до 15 °C, VSV-G скапливается в кластерах возле ERES, которые при 32 °C начинают очень процессивно двигаться в область аппарата Гольджи по микротрубочкам (Presley et al., 1997). Белок ERGIC53, который является транспортным посредником для многих секретируемых белков (Appenzeller, 1999), постоянно мигрирует между ЭР, ERGIC и аппаратом Гольджи (Рис 6) (Klumperman et al., 1998). При экспрессии в клетках слитого с GFP ERGIC53 можно наблюдать, что он в основном локализован в относительно стационарных кластерах, находящихся возле ERES и в везикулах, быстро перемещающихся от одного кластера к другому (Ben-Tekaya et al., 2004). При разборке микротрубочек нокодазолом пул везикул исчезает (Ben-Tekaya et al., 2004).

Рис 6. Транспорт белков меэвду ЭР и промежуточным компартментом (ERGIC). Промежуточный компартмент образуется в результате слияния СОРИ-транспортных везикул, отпачковывающихся от мембран ЭР. Данный процесс ингибируется понижением температуры до 10 °C, осмотическим шоком клеток, окадаевой кислотой (OA) и смесью деоксиглюкозы с азидом натрия (DOG/azide). Транспорт везикул из промежуточного компартмента в ЭР и АГ проходит по COPI-зависимому механизму и ингибируется понижением температуры до 15 °C, брефелдином A (BFA), бафиломицином (Baf), 1,3-циклогексан-бис (метиламин) (СВМ), нординидрогвиаретовой кислотой (NDGA), монензином и тетрофтораллюминатом натрия (AlF)4″ (Hauri et al., 2000).

Почему происходит фрагментация аппарата Гольджи при нарушении зависимого от микротрубочек транспорта, в том числе при разрушении самих микротрубочек? Можно предположить, что при разрушении микротрубочек происходит «разъезжание» отдельных цистерн аппарата Гольджи по остаточным микротрубочкам при помощи кинезина-1 (Minin, 1997). Однако скорее всего механизм диспергирования аппарата Гольджи несколько иной. Дело в том, что ретроградный транспорт белков аппарата Гольджи мало зависит от наличия микротрубочек, поскольку везикула, покидающая аппарат Гольджи, легко находит ЭР в различных местах клетки. Везикула же, покидающая ЭР, с трудом может найти компактный аппарат Гольджи в объеме клетки, и ей нужны микротрубочки, чтобы следовать в нужном направлении. При воздействии нокодазола, разрушающего микротрубочки, происходит блокада в основном антероградного везикулярного транспорта (Cole et al., 1996). Везикулы, покидающие ЭР, мигрируют на небольшие расстояния, поэтому возле ERES формируются мини-цистерны аппарата Гольджи (Cole et al., 1996), а исходное скопление цистерн аппарата Гольджи в центре клетки рассасывается, поскольку из-за преобладания ретроградного транспорта происходит перераспределение белков аппарата Гольджи в ЭР (Рис. 5). Данный процесс ускоряется кинезином, работающим на стабильных к разборке нокодазолом микротрубочках, поэтому при ингибировании кинезина фрагментация аппарата Гольджи замедляется (Minin, 1997).

Транспорт между ЭР и аппаратом Гольджи тоже может проходить и без участия микротрубочек, хотя, вероятно, и с меньшей скоростью и эффективностью. Так, секреторные белки типа VSY-G или проколлагена секретируются клеткой и в отсутствие микротрубочек (Musch, 2004). В каждый конкретный момент мы видим некоторое стационарное состояние распределения органелл везикулярного пути, определяемого скоростями прямого и обратного транспорта, последние же напрямую зависят от микротрубочкового цитоскелета и активности моторов (Altan-Bonent et al., 2004). Микротрубочковые моторы, связываясь с определенными везикулами, определяют скорость и направление того или иного транспорта, регулируя при этом динамику общего процесса.

Сами цистерны ЭР «растягиваются» по клетке с помощью микротрубочек, и модель этого процесса можно наблюдать в экстрактах яиц Xenopus, в которые добавляют микротрубочки и мембраны ЭР, выделенные из печени (Allan and Vale, 1994). В такой системе при добавлении АТФ мембранные тубулы вытягиваются вдоль микротрубочек, сливаются, пересекаясь, и формируют двумерную сеть с Т-образными пересечениями (Allan, 1995), похожую на ЭР в клетке. Вытягивание тубул ЭР можно наблюдать и в клетках in vivo, причем это вытягивание зависит от микротрубочек (Vedrenne and Hauri, 2006). Для формирования ЭР необходимы кинезин-1 и динеин, причем кинезин должен содержать определенную форму легкой цепи — KLC1B (Wolzniak and Allan, 2006). Мембраны ЭР, кроме того, связаны со структурными белками, которые поддерживают ЭР в растянутом на микротрубочковой сети состоянии. Это белки СКАР4 (cytoskeleton-associated protein 4), известный также как CLIMP63, р22 и VAP (vesicle-associated.

20 membrane protein (VAMP)-associated protein) (Vedrenne and Hauri, 2006). Разрушение связи между ЭР и микротрубочками при ингибировании связывающих белков ведет к коллапсу ЭР в дезорганизованные мембранные листы в центре клетки и таюке к дезорганизации системы микротрубочек (Andrade et al., 2004). В ЭР различают несколько субдоменов: гладкий ЭР, шероховатый ЭР, ERES и домен контроля качества (ДКК-ЭР), где происходит деградация неверно сформированных секреторных или трансмембранных белков (Meusser et al., 2005) Белок Вар31, сопровождающий экспорт из ЭР трансмембранных белков и в норме распределенный по всему ЭР, при ингибировании протеасом перемещается в ДКК-ЭР, находящийся в околоядерной области. Это перемещение зависит от микротрубочек и от динеин-динактинового комплекса (Wakana et al., 2008).

Формирование транспортных контейнеров в ERES регулируется малой ГТФазой Sari. В ГТФ-форме, благодаря экспозиции гидрофобного участка, Sari связывается с мембраной эндоплазматического ретикулума (Hughes and Stephens, 2008), специфичность связывания достигается тем, что Sec 12, фактор обмена нуклеотида Sari, является резидентным белком эндоплазматического ретикулума (Weissman et al., 2001). Связавшись с мембраной ЭР, активированная Sari привлекает туда комплекс белков Sec23/Sec24 (Hughes and Stephens, 2008), причем последний может связывать различные транспортные белки (Wendeler, 2007). Далее присоединяется внешний слой COPII-окаймления, состоящий из белков Secl3-Sec31 (Hughes and Stephens, 2008). При ингибировании малой ГТФазой Sari, путем экспрессии в клетках ее мутантов: конститутивно-неактивного Sarla[T39N] и конститутивно-активного Sarla[H79G], СОРИ зависимый транспорт не проходит (Рис. 7) (Ward et al., 2001).

ERES достаточно равномерно распределяются в цитоплазме культивируемых клеток, но при этом они не мобильны, а претерпевают только короткие флуктуирующие движения, которые приводят к их медленной диффузии по цитоплазме (Hammond and Glick, 2000). При разрушении микротрубочек и эти движения ингибируются, и диффузия замедляется еще в несколько раз (Heinzer et al., 2008). Распределение ERES по цитоплазме зависит не только от микротрубочек, но и от молекулярных моторовдинеина и кинезина-1 (Gupta et al., 2008). Так, при нокдауне кинезина-1 в клетках HeLa наблюдается кластеризация ERES (Gupta et al., 2008), при этом нокдаун кинезина-2 не влияет на распределение ERES. При нокдауне цитоплазматического динеина не происходит заметного изменения морфологии ERES, однако увеличивается их мобильность, что может говорить о том, что динеин является заякоривающим фактором для ERES (Gupta et al., 2008). А.

СГА AriirnilN.

Sarl[T39NI unlrca' er.

• COI’I.

• COPI В.

DFA Artl[T3tN].

ER ergic С.

Z> ER ь I ¦ I.

Рис 7 Общая схема везикулярного транспорта менаду ЭР и аппаратом Гольджи и эффекты ингибирования COPI и СОРП транспортных механизмов.

А) В норме антероградный транспорт от ЭР в аппарат Гольджи проходит через промежуточный компартмент, и происходит последовательное чередование COPII и COPI транспортных везикул. Ретроградный транспорт из аппарата Гольджи в ЭР происходит с помощью COPI транспортных везикул. (В) При ингибировании COPI транспортного механизма действием BFA или неактивной формы Arf[T3 IN] происходит слияние мембран ЭР и АГ с исчезновением последнего, тогда как промежуточный компартмент (ERGIC) сохраняется. © При блокировании СОРП зависимого транспорта происходит последовательный переход компонентов аппарата Гольджи и ERGIC в ЭР с исчезновением данных компартментов (Ward et al., 2001).

О молекулярных механизмах направления моторов к ERES мало что известно, но при совместном иммунофлуоресцентном окрашивании можно наблюдать некоторую со-локализацию ERES с кинезином-1 (Gupta et al., 2008) и динеин-динактиновым комплексом (Watson and Stephens, 2006). Белок pl50Gued, который является компонентом динеин-динактинового комплекса, связывает белок Sec23A — компонент СОРП-окаймления (Watson et al., 2005). Нарушение данного взаимодействия замедляет транспорт модельного белка VSV-G к плазматической мембране (Watson et al., 2005). Динеин связывается с содержащими Sec23 ERES и непосредственно (Gupta et al., 2008).

Для прохождения транспорта из ЭР в аппарат Гольджи необходимо чередование СОРП и COPI окаймлений (Hughes and Stephens, 2008, Altan-Bonnet et al., 2004), причем адапторы для сборки COPI привлекаются уже тогда, когда начинается сборка COPII окаймления в ERES (Altan-Bonnet et al., 2004). Белок TRAPPI связывается с COPII окаймлением через белок Sec23 (Cai et al., 2007) и привлекает в комплекс малую ГТФазу.

Rabl, которая через белок р115 привлекает в комплекс компоненты COPI окаймления и гольджин GM130 (Hughes and Stephens, 2008, Altan-Bonnet et al., 2004). С COPI-окаймлением связывается динеин, причем для этого необходима активация ГТФазы Cdc42. Экспрессия в клетках конститутивно активного мутанта Cdc42[Q61L] препятствует рекластеризации диспергированного нокодазолом аппарата Гольджи после восстановления системы микротрубочек (Chen et al., 2005). В свою очередь, на активность Cdc42 влияет GM130, который взаимодействует с фактором обмена нуклеотида данной ГТФазы — Tuba, и тем самым может регулировать активность cdc42 (Kodani et al., 2009), a следовательно и активность динеина.

Подвижность ERGIC, то есть возможность движения по микротрубочкам, является, возможно, предметом регуляции при образовании секреторного контейнера. Так, при наблюдении за GFP-проколлагеном при его экспорте из ЭР, подвижные транспортные везикулы, содержащие его, лишены белка ERGIC-53 и компонентов COPI окаймления, и наоборот, везикулы, содержащие ERGIC-53, имеют в большинстве случаев COPI и не содержат проколлаген (Stephens and Pepperkok, 2002). При этом интересно то, что при ингибировании образования COPI-окаймления содержащие проколлаген везикулы становятся неподвижны и начинают окрашиваться на ERGIC-53. С течением времени число содержащих проколлаген везикул уменьшается, что может говорить о необходимости COPII-COPI сопряжения для образования данных подвижных везикул (Stephens and Pepperkok, 2002).

Рис 8. Модель активации Arf на мембранах аппарата Гольджи.

Фактор обмена GEF GBF1 (красный прямоугольник) и Arf-GDF (желтый треугольник) независимо связываются с мембраной АГ. Реакция обмена проходит через несколько коротко живущих интермедиатов, и GBF1 уходит из комплекса, давая возможность Arf связать эффекторную молекулу. BFA (синий треугольник) стабилизирует комплекс неактивный GBFl-Arf-GDP (Niu et al., 2004).

При ингибировании образования COPI-окаймления действием брефелдина A (BFA) происходит быстрый коллапс компонентов аппарата Гольджи в ЭР (Lippincott-Schwartz et al., 1989). BFA ингибирует функционирование малой ГТФ-азы ARF1, через связывание с ее фактором обмена нуклеотида GBF1 (Niu et al., 2004). В этих условиях останавливается ретроградный COPI-зависимый транспорт, которым управляет ARF1, и неактивный комплекс ARF1-GDP-GBF1-BFA стабилизируется на мембранах АГ (Niu et al., 2004). Это приводит к тому, что образующиеся в норме мембранные тубулы на аппарате Гольджи не могут открепиться, и при этом сам процесс образования тубул резко интенсифицируется при действии BFA (Рис. 8) (Sciaky et al., 1997). При встрече такой тубулы аппарата Гольджи с мембраной ЭР происходит их слияние и быстрое неспецифическое перетекание белков и липидов аппарата Гольджи в ЭР, причем данный процесс прямо не зависит от наличия микротрубочек, а лишь ускоряется ими (Sciaky et al., 1997). При этом ERGIC стабилен в отношении действия BFA и не претерпевает коллапс в ЭР, как аппарат Гольджи (Lippincott-Schwartz et al., 1990).

Возможно, что аппарат Гольджи может организовывать систему микротрубочек самостоятельно, обеспечивая себе «дорожки» для транспорта и поддержания своей компактной структуры. Действительно, было установлено, что цистерны аппарата.

Гольджи и сети цис-Гольджи и транс-Гольджи могут нуклеировать микротрубочки in vitro и in vivo. Выделенные из клеток мембраны аппарата Гольджи вызывают полимеризацию в микротрубочки раствора тубулина в тех условиях, когда тубулин не полимеризуется спонтанно (Chavrin-Brion et al., 2001). Тестом на способность нуклеировать микротрубочки in vivo обычно является восстановление сети микротрубочек после их разрушения действием холода или нокодазола. В этих условиях большая часть микротрубочек вырастает на центросоме, образуя характерную звезду, но в некоторых типах клеток появляются также мелкие многочисленные звезды из микротрубочек, расположение которых соответствует аппарату Гольджи (Efimov et al., 2007; Rivero et al.,.

2008). В нуклеации микротрубочек на мембранах аппарата Гольджи, как и в центросоме, участвует yTuRC. Этот комплекс рекрутируется на мембраны, преимущественно цис.

Гольджи, через крупные фибриллярные структурные белки: АКАР450 (Takahashi et al.,.

2002), GMAP210 (Rios et al., 2004), а также CLASP2 (Takahashi et al., 2002). Белок.

AKAP450 (другие названия: AKAP350, CG-NAP) в свою очередь привлекается на мембраны через специфический белок аппарата Гольджи гольджин — GM130 (Rivero et al.,.

2008). Помимо yTuRC, АКАР450 тесно связан с динеин-динактиновым комплексом (Kim et al., 2007), и при ингибировании активности динеина способность аппарата Гольджи нуклеировать микротрубочки утрачивается. Эта способность утрачивается и в отсутствие.

АКАР450. При нокдауне АКАР450 микротрубочки в районе аппарата Гольджи становятся более динамичными, т. е. АКАР450 частично стабилизирует микротрубочки. Интересно, что АКАР450 присутствует также в центросоме, т. е. механизмы организации сети микротрубочек центросомой и аппаратом Гольджи могут быть сходными (Rivero et al., 2008). При разборке аппарата Гольджи под действием BFA нуклеация микротрубочек переходит в ERES, где в данных условиях и накапливается АКАР450 (Rivero и др 2009).

Белок GMAP210 может закреплять минус-концы микротрубочек и удерживать нуклеированные микротрубочки возле мембран, причем это также происходит при участии динеина и динактинового комплекса (Takahashi et al., 2002). CLASP2 рекрутируется на мембраны через ассоциированный с транс-сетью аппарата Гольджи белок GCC185. Помимо участия в нуклеации микротрубочек, CLASP2 декорирует и стабилизирует новообразованные микротрубочки. Нокдаун белка CLASP2 блокирует внецентросомную нуклеацию микротрубочек на мембранах аппарата Гольджи (Efimov et al., 2007). В таких клетках образуется совершенная радиальная сеть микротрубочек с центром в центросоме. Белок WHAMM (WASP homolog associated with actin, membranes, and microtubules) локализуется в цис-Гольджи и в промежуточном тубуло-везикулярном компартменте. Этот белок взаимодействует с микротрубочками и с актином, и он необходим для поддержания структуры аппарата Гольджи, особенно для правильного формирования мембранных тубул (Campellone et al., 2008). Многие этапы везикулярного транспорта зависят от динеина и связанного с ним динактинового комплекса. При этом специфичность взаимодействия динеина с везикулами зависит не только от адапторных белков, но и от гетерогенности молекул самого динеина, которые могут содержать различные легкие (LC) и легкие промежуточные цепи (LIC). Так, транспорт от ЭР к аппарату Гольджи, структура последнего и структура ERGIC зависят от LIC1, в то время как транспорт эндосом зависит от LIC2. Целостность структуры аппарата Гольджи зависит также от легких цепей динеина Roadblockl и Tctexl, в то время как транспорт ЭР-аппарат Гольджи зависит от Tctexl и LC8, а структура ERGIC не зависит от легких цепей динеина (Palmer et al., 2008).

Таким образом, клеточные мембранные органеллы, относящиеся к транспортному пути, тесно взаимодействуют с микротрубочками, через моторные и через структурные белки. Это приводит как к регуляции динамики мембранных органелл, так и к регуляции структуры сети микротрубочек.

Взаимодействие микротрубочек с клеточным кортексом.

Для радиальной организации клеточных микротрубочек необходимо их взаимодействие с краем клеток. В большинстве случае растущие микротрубочки дорастают до края клеток, а затем их рост останавливается, и происходит катастрофа. Катастрофы значительно реже случаются в глубине цитоплазмы, чем на краю клеток (Komarova et. al., 2002). Редко случается, чтобы микротрубочка изгибалась, коснувшись края клетки, чтобы расти вглубь цитоплазмы, чаще микротрубочка останавливается в росте и затем разбирается (Kodama et al., 2003). Не ясно, является ли это следствием простого взаимодействия растущей микротрубочки с ограничивающим рост барьером или же работой специальных механизмов, разрушающих микротрубочку. При экспериментальном возведении барьеров на пути растущих микротрубочек in vitro большинство из них после соприкосновения с барьером либо изгибалось и продолжало удлиняться, скользя вдоль препятствия, остальные деполимеризовались (Dogterom et al., 1997). Вероятность разборки микротрубочки с плюс-конца зависела в данном случае от величины противодействия барьера, оказавшегося на пути микротрубочки (Janson et al 2003). Т. е. in vitro взаимодействие микротрубочки с краем — чисто механическое. In vivo при достижении микротрубочкой края клетки наблюдается переход от стадии роста к стадии паузы между ростом и разборкой микротрубочки (Komarova et al, 2002). Это может косвенно указывать на наличие на периферии клетки — специфических белков, ответственных за деполимеризацию или, по крайней мере, за прекращение роста микротрубочек.

В настоящее время в литературе описан ряд белков, влияющих на динамику микротрубочек на краю клетки, такие как CLASP (Mimori-Kiyosue et al., 2004), АРС (Nathke et al., 1996), ACF7/MACF1 (Kodama et al., 2003).

Белок ACF7 (MACF1- microtubule actin crosslinking factor) — это довольно крупный белок, из семейства плакинов, который имеет как актин связывающий домен, так и микротрубочко-связывающий участок и может соединять эти два вида цитоскелетов, а также обладает АТФ-азной активностью (Kodama et al., 2003, Wu el al., 2008, Sonnenberg and Liem, 2007). Так, при удалении данного белка из клетки теряется связь микротрубочек с клеточным кортексом и они начинают изгибаться, достигая его (Kodama et al., 2003). Присутствие белков CLASP-1 и CLASP-2 необходимо для локальной стабилизации микротрубочки в непосредственной близости от клеточной мембраны (Mimori-Kiyosue et al., 2005).

При построении радиальной системы микротрубочек необходимо, чтобы центросома, как центр организации микротрубочек, находилась в геометрическом центре клеток. Механизм центровки центросомы до сих пор остается неизвестным. Важную роль здесь играет минус-концевой мотор динеин со своими кофакторами динактином и белком LIS1 (Faulkner et al., 2000; Dujardin andVallee, 2002). Динеин, заякоренный в клеточном кортексе, может натягивать микротрубочки, так как он будет пытаться передвигаться по ним к минус-концу, а сам кортекс достаточно прочен и мотор будет оставаться на месте, натягивая микротрубочку. Натягивание клеточных микротрубочек — важная функция динеина. В клеточном кортексе у дрожжей находится динеин, где он тянет на себя микротрубочки, связанные с ядром, и тем самым втягивает делящееся ядро в почку во время митоза (Kahana et al., 1998; Adams and Cooper, 2000). Роль активатора в данном процессе играет аналог LIS1 — белок Pad (Lee et al., 2003). Обнаружен динеин в кортексе ооцитов и неклеточной (бластодермальной) стадии эмбрионов Drosophila (Li et al., 1994; Sharp et al., 2000), а также в кортексе ранних эмбрионов Caenorhabditis elegans (Skop and White, 1998;Gonczy et al., 1999; Schmidt et al., 2005). Здесь он также определяет позицию центросомы и митотических веретен (Schmidt et al., 2005), вероятно, натягивая астральные микротрубочки.

На ведущем краю движущихся фибробластов и в кортексе митотических эпителиальных клеток (Busson et al., 1998) также локализуется динеин-динактиновый комплекс (Dujardin et al., 2003; Dujardin and Vallee, 2002). При этом он, вероятно, тянет на себя микротрубочки, доходящие до кортекса, и таким образом, ориентирует всю систему микротрубочек вместе с прикреплёнными центросомой, ядром или митотическим веретеном и прочими структурами. Роль динеина во взаимодействии с микротрубочками на краю клетки, также проверялась в системе in vitro, была использована уже описанная выше модель встречи микротрубочки с искусственным барьером, однако в данном случае к барьеру была пришита тяжелая цепь динеина (Laan et al., 2008), однако, что интересно в системе можно было наблюдать изменение динамики микротрубочки при достижении барьера, она не начанала изгибаться и поворачивать, а останавливалась в паузе у барьера, что несколько удивило авторов, которые рассчитывали на быструю деполимеризацию микрорубочки после касания, так как движущийся динеиновый мотор создает дополнительную силу для деполимеризации микротрубочек.

Удобной экспериментальной моделью для изучения роли динеина в центровке центросомы являются клетки Dictyostelium (Koonce et al., 1999; Ma et al., 1999). При перемещении амебы позиция центросомы постоянно изменяется, следуя за выдвижением псевдоподий (Ueda et al., 1997). При ингибировании динеина центросома не утрачивает.

27 связи с микротрубочками, но смещается из своего центрального положения в клетке к периферии и начинает кругами перемещаться по клетке. При этом за ней тянется шлейф микротрубочек, напоминающий хвост кометы (Koonce et al., 1999). Похожую картину можно наблюдать и в клетках млекопитающих на ранних сроках после ингибирования динеина (Burakov et al., 2003).

Равномерное распределение кортикального динеина гарантирует сбалансированность сил, воздействующих на микротрубочки со стороны клеточного кортекса. Были предложены две модели, объясняющие, каким образом клетка отыскивает свой центр (Valee and Stehman, 2005). Одна схема предполагает взаимодействие динеина с дистальными плюс-концами микротрубочек (Рис. 9 А, С). Согласно данной модели, все микротрубочки имеют одинаковые шансы провзаимодействовать с равномерно распределённым по кортексу динеином. При этом количество молекул динеина, ассоциированных с концом микротрубочки, может изменяться в относительно узких пределах. Такая модель объясняла смещение центросомы при локальной деполимеризации микротрубочек у одного из краев клетки (Burakov et al., 2003), но имеет очевидные ограничения при попытках объяснить поведение центросомы в асимметричных клетках, со сложной формой края или при перемещении клеток.

Другое решение проблемы центрирования предполагает существование механизма, при котором продуцируемая динеином сила пропорциональна длине микротрубочки (Рис. 9 В, D). Чтобы продуцируемая динеином сила была пропорциональна длине микротрубочки, необходимы не только плюс-концевые, но и латеральные взаимодействия микротрубочки с динеином кортекса клетки, такой механизм может объяснять центровку центросомы при перемещении клеток, а также если клетки имеют сложную форму (Vallee and Stehman, 2005).

Рис 9. Возможные механизмы центровки центоеомы. (а, Ь) Модель I — к плюс концу микротрубочки приложено тянущее усилие кортикально ассоциированых динеиновых комплексов. (c, d) Модель II — тянущее усилие цитоплазматических динеиновых моторов распределено вдоль микротрубочки и тем самым зависит от ее длины. (Vallee and Stehman, 2005). а) с).

Таким образом, цитоплазматический динеин, заякоренный в клеточном кортексе, отвечает за один из наиболее фундаментальных аспектов поляризации клеткиопределяет клеточный центр путём позиционирования центросомы и системы микротрубочек в целом. Сходные механизмы обеспечиваются им при позиционировании веретена деления в митозе и при перемещениях клеток. Здесь следует отметить, что способы взаимодействия динеина с кортексом клетки до сих пор не изучены.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

.

Целью работы было определение внецентросомных факторов (детерминант), влияющих на организацию системы микротрубочек в культивируемых клетках млекопитающих.

Для этого были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Определить, сохраняется ли активность центросомы при разрушении радиальной системы микротрубочек в стареющих цитопластах.

2. Сравнить взаимодействие микротрубочек с клеточным кортексом в свежеполученных и в стареющих цитопластах.

3. Выявить, сохраняется ли в стареющих цитопластах активность динеин-динактинового комплекса.

3. Установить, влияет ли отсутствие взаимодействия микротрубочек с клеточным кортексом на центральное расположение центросомы в стареющих цитопластах.

4. Определить роль аппарата Гольджи и аппарата раннего везикулярного транспорта в организации бесцентросомной радиальной системы микротрубочек в цитопластах путем воздействия брефелдином, А и окадаевой кислотой для их ингибирования.

5. Определить роль аппарата раннего везикулярного транспорта в организации бесцентросомной радиальной системы микротрубочек путем экспрессии в клетках мутантов ГТФ-азы Sari а.

6. Установить роль микротрубочек в образовании центральных скоплений ERES при экспрессии конститутивноактивного мутанта ГТФ-азы Sarla[H79G].

8. Установить роль динеин-динактинового комплекса в образовании центральных скоплений ERES при экспрессии конститутивно-активного мутанта ГТФ-азы Sarla[H79G].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Молекулярное клонирование.

Таблица 1. Список использованных в работе ДНК-конструкций.

Название Источник Что кодирует.

1 pEGFPNl-Sec23a получен в данной работе Белок Sec23a, слитый с EGFP на С-конце.

2 pcDNA-3HA-Sarla[H79G] получен в данной работе Белок Sarla[H79G], слитый с НА-тэгом.

3 pEGFPNl-Sarla получен в данной работе Белок Sarla, слитый с EGFP на С-конце.

4 pEGFPNl-Sarla[T39N] получен в данной работе Белок Sarla[T39N], слитый с EGFP на С-конце.

5 pEGFPNl-Sarla[H79G] получен в данной работе Белок Sarla[H79G], слитый с EGFP на С-конце.

6 pmCherryN 1 -Sarla[H79G] получен в данной работе Белок Sarla[H79G], слитый с mCherry на С-конце.

7 pEGFPC2- Q-pGlued получен в данной работе Фрагмент СТ (а.о. 938−1254) белка pl50Glued, слитый с EGFP на N-конце.

8 pEGFPC2-CClG, ued любезно предоставлен О. Жаппаровой Фрагмент СС1 (а.о. 217−548) белка pl50Glued, слитый с EGFP на N-конце.

9 pEGFPC2- MDGIued любезно предоставлен О. Жаппаровой Фрагмент MD (а.о. 550−932) белка pl50Glued, слитый с EGFP на N-конце.

10 pEGFPC2-MDQyGlued получен в данной работе Фрагмент MD-CT (а.о. 550−1254) белка pl50Glued, слитый с EGFP на N-конце.

11 pEGFPC2-pl50-head получен в данной работе Фрагмент head (а.о. 1−157) белка pl50Glued, слитый с EGFP на N-конце.

12 pEGFPC2-pl50-deltahead любезно предоставлен О. Жаппаровой Фрагмент delta-head (а.о. 151−1277) белка pl50Glued, слитый с EGFP на N-конце.

13 pEGFPC2-pl50 любезно предоставлен О. Жаппаровой Полноразмерный белок pl50Glued, слитый с EGFP на N-конце.

14 pEGFPC2-p50- любезно Полноразмерный динамитин (р50), слитый с dynamitin предоставлен О. Жаппаровой EGFP на N-конце.

15 pEGFPCl-GFP-tubulin любезно предоставлен Е. Корниловой Альфа-тубулин, слитый с GFP на N-конце.

16 pEGFPCl-YFP-CLIP170 любезно предоставлен А. Ахмановой Полноразмерный CLIP 170, слитый с YFP на N-конце.

17 pEGFPCl-GFP-PRL-ERGIC53 любезно предоставлен Н. Hauri белок ERGIC-53 — маркер промежуточного компартмента, слитый с GFP на N-конце, сигнальная последовательность эндогенного белка, заменена на сигнальную последовательность пролактина.

В настоящей работе использовали ДНК-конструкции, полученные с использованием векторов pEGFP-Cl, pEGFP-C2, pmCherry-Nl (Clontech, США) и pcDNA-3 (Invitrogen, США). Полоноразмерная кДНК динамитина р50 мыши (NCBI Accession ВС4 613) и Sec23a (NCBI Accession NM006364) были приобретены у фирмы АТСС (США) — кДНК pl50Glued человека была любезно предоставлена проф. В. Штеффеном (Германия), кДНК белка Sari, а была синтезирована с применением метода обратной транскрипции на основе РНК, выделенной из клеток культуры HeLa.

Все реакции молекулярного клонирования проводили, используя реактивы фирмы Fermentas (Литва). Праймеры были синтезированы фирмой Синтол (Россия). Для выделения плазмидной ДНК и экстракции ДНК из агарозного геля (Biorad) использовали наборы реактивов фирмы Qiagen (США).

В большинстве случаев для клонирования проводили ПЦР нужного фрагмента кДНК с праймерами, несущими на конце сайты для эндонуклеаз рестрикции. Для ПЦР использовали наборы реактивов PCR High Fidelity Enzyme Mix (Fermentas, Литва). ПЦР-продукт и вектор обрабатывали соответствующими эндонуклеазами, полученные продукты лигировали. Правильность всех полученных ДНК-конструктов проверяли автоматическим секвенированием, а молекулярную массу синтезирующихся белковВестерн-блотингом.

Для клонирования и размножения плазмид использовали штамм E. coli DH5a. Для получения компетентных клеток для химической трансформации выращивали культуру E. coli в 50 мл среды LB в течение 18−20 часов при 22 °C. После этого в суспензию клеток добавляли 150 мл SOB и растили бактерии при 22 °C до ODeoo = 0.6. Далее клетки охлаждали в ледяной бане и осаждали при 3.500 об/мин (JA-20, Beckman) 10 мин при 4 °C. Осадки ресуспендировали в 16 мл ледяного ТВ, инкубировали на льду 10 мин. После чего повторно центрифугировали при тех же условиях и ресуспендировали клетки в 4 мл ТВ.

Добавили DMSO до концентрации 7%, инкубировали на ледяной бане 10 мин. Аликвоты клеток замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С. Для трансформации к 50 мкл компетентных клеток добавляли 100 нг плазмидной ДНК или 10 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду 20 мин, затем 1,5 мин при 42 °C, снова 2 мин на льду, а затем добавляли 400 мкл среды LB и инкубировали на шейкере 1 час при 37 °C. Затем 50 мкл бактериальной суспензии растирали по агаризованной LB с добавлением антибиотика и инкубировали ночь при 37 °C.

Для трансфекции культивируемых эукариотических клеток плазмидную ДНК выделяли с помощью набора реактивов Miniprep (Qiagen), а также с помощью наборов Endo-Free Midiprep и Endo-Free Maxiprep (Qiagen).

RT-PCR и сайт-направленный мутагенез.

Тотальную РНК из культуры клеток HeLa выделяли набором реактивов RNeasy kit (Qiagen). кДНК синтезировали с помощью набора First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) или с обратной транскриптазой SuperScript II (Invitrogen), в обоих случаях используя случайные гексануклеотидные праймеры. Для амплификации кДНК Sari, а использовали следующие праймеры прямой — atgtctttcatctttgagtggatctacaat и обратный tcagtcaatatactgggagagccagcggaa.

Сайт-направленный мутагенез проводили с помощью набора QuikChange® XL Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene, США) в соответствии с инструкцией производителя. Для получения мутанта Sarla[H79G] использовали следующие праймеры: прямой — TTGATCTTGGTGGGGGCGAGCAAGCACGTCG, обратный.

CGACGTGCTTGCTCGCCCCCACCAAGATCAA. Для получения мутанта Sarla[T39N] использовали праймеры: прямой.

GGATAATGCAGGCAAAAACACTCTTCTTCACATGCTC, обратный.

GAGCATGTGAAGAAGAGTGTTTTTGCCTGCATTATCC.

ПЦР проводили с помощью набора реагентов GenePak PCR Core (Изоген, Россия).

Антитела.

В работе были использованы следующие первичные антитела: поликлональные кроличьи антитела к маннозидазе II (ab12277, Abeam), найнеину (ab4447, Abeam), у-тубулину (любезно предоставленные Р. Узбековым, НИИ ФХБ им. Белоозерского) — ERGIC-53 (любезно предоставленные R. Petterson, Ludwig Institute for Cancer Research, Stockholm), моноклональные мышиные антитела к а-тубулину DM-1A (Т9026, Sigma), динамитину р50 (BD Transduction Laboratories), pl50OIued (clone 1, BD Transduction.

Laboratories), НА-тэгу (Convance, MMS-101R), ацетилированному тубулину (BD Transduction Laboratories), моноклональные крысиные антитела к а-тубулину (ab6161, Abeam). В качестве вторичных антител использовали: козьи или ослиные антитела к иммуноглобулинам мыши, кролика или крысы, конъюгированные с FITC, TRITC или Су5 (квалификация ML, Jackson Immunoresearch).

Культивирование клеток.

Клеточные культуры Vero (фибробласты почки зеленой мартышки), HeLa (карцинома шейки матки человека) и BSC-1 (эпителий почки зеленой мартышки) выращивали при температуре 37 °C, содержании углекислого газа 5%, на среде, состоящей из 50% DMEM (Dulbecco's modified Eagle’s medium) и 50% среды F12 (Панэко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Панэко) и 80 мкг/мл гентамицина (Sigma).

Для липосомной трансфекции клеток использовали Lipofectamine™2000 (Invitrogen) или TransIT®-LTl (Mirus) согласно рекомендациям производителя. Результаты трансфекции наблюдали через 24 ч.

Применяли несколько протоколов фиксации клеток. Клетки фиксировали абсолютным метанолом при -20°С 5 мин, затем переносили в 3% параформальдегид при +4° на 15 минили фиксировали 3% параформальдегидом при комнатной температуре 15 мин, а затем инкубировали в 0,1% Triton Х-100 5 минили использовали 0,5% глутаровый альдегид 15 мин при комнатной температуре с последующей отмывкой 0,5% боргидридом натрия 2 раза по 15 мин. В некоторых случаях перед фиксацией проводили обработку моделящим раствором.

Состав используемых буферов и растворов:

3% параформальдегид (Serva) на PBS- 0,5% глутаровый альдерид (Рапгеас) на PBS- 0,5% боргидрид натрия (Диа-М, Россия) на PBS- 0,1% Тритон Х-100 на PBS.

Буфер М: 50 шМ imidazole рН 6.8, 50 mM КС1, 1 тМ MgCl2, 1 тМ EGTA, 0.1 тМ EDTA, 0.1% p-mercaptoethanol.

Моделящий раствор: на буфере М, 0,5% Тритон Х-100, 30% глицерин, 0,0015% [3-меркаптоэтанол.

Нокодазол 3 мг/мл на DMSO (рабочая концентрация 3 мкг/мл, 3 часа при 37°С) — цитохалазин D на DMSO 5 мг/мл (рабочая концентрация 5 мкг/мл) — брефелдин, А 1 мг/мл на метаноле (рабочая концентрация 2 мкг/мл, 1 час при 37°С), окадаевая кислота 1 мМ на DMSO (рабочая концентрация 2 мкМ).

Получение цитопластов.

Для получения цитопластов клетки рассаживали на специально подготовленные подложки, которые представляли собой кусочки покровных стекол, приклеенных с помощью расплавленного парафильма к пластиковому кружку, с диаметром, равным внутреннему диаметру эппендорфовской пробирки на 1,5 мл. На следующий день в среду добавляли цитохалазин В (5 мкг/мл), а для получения бесцентросомных цитопластов также добавляли носодазол (3 мкг/мл) на 2 час. В эппендорфовскую пробирку помещали пластиковое кольцо, наливали среду с химическими агентами и помещали вниз стеклом подложку с клетками. Центрифугирование проводили 5−10 мин при 16000g при температуре 35−37 °С, предварительно нагревая центрифугу во время холостого хода феном. После центрифугирования стекла отмывали от добавленных реагентов в среде культивирования и инкубировали со свежей средой культивирования в течение 1 или 17 часов при 37 °C.

Для прижизненного наблюдения за цитопластами сразу после процедуры центрифугирования их пересаживали с помощью на чашку Петри со стеклянным дном. После инкубирования в термостате в течение 1−17 часов проводили прижизненное наблюдение. В экспериментах по деполимеризации микротрубочек 17-ти часовые цитопласты инкубировали в ледяной бане 60 мин, а далее помещали в обратно в термостат на 5, 10, 15, 30, 60 или 120 мин для восстановления микротрубочек.

Микроскопия.

Результаты иммунофлуоресцентного окрашивания наблюдали, используя микроскоп Axiophot (Carl Zeiss, Германия), снабженный 12-битной 1 MHz CCD MicroMax камерой (Roper Scientific, США) и программным обеспечением WinView 32 software (Princeton Instruments, CIIIA). Также использовали инвертированный микроскоп Carl Zeiss Axiovert 200M, снабженный 12-битной камерой AxioCamHR и программным обеспечением Axiovision (Carl Zeiss). Прижизненные наблюдения проводили на Axiovert 200 М.

Анализ изображений.

Для оценки радиальности системы микротрубочек в цитопластах Vero, содержащих центросому, проводили анализ количества тубулина по интенсивности флуоресценции после иммунофлуоресцентного окрашивания на фиксированных препаратах с помощью программы Scion Image (Scion Corporation) и ImageJ (Wayne Rasband, NIH). Измеряли интенсивность флуоресценции в радиально расположенной полосе шириной 1,3 мкм, причем начало полосы совпадало с центросомой (Смурова и др., 2002). При радиальной системе микротрубочек наблюдался спад интенсивности флуоресценции от центра к переферии, а при хаотическом расположение микротрубочек интенсивность флуоресценции была примерно одинаковой вдоль радиуса.

Для оценки радиальности системы микротрубочек в цитопластах не содержащих центросому применяли эмпирически полученный параметр равный отношению радиуса микротрубочко-организующего центра цитопласта к радиусу всего цитопласта, если данный параметр был менее 0,6 то система микротрубочек считалась радиально-подобной, если же более 0,6 то хаотической.

Для оценки общей интенсивности флуоресценции полимеризованного тубулина измеряли разность плотности флуоресценции (отношение общей флуоресценция к площади участка) и фонового значения флуоресценции. Для определения отклонения роста микротрубочки от радиального направления измеряли угол отклонения плюс-концевой кометы YFP-CLIP170 от радиуса, проведенного из центра клетки или цитопласта.

Для анализа распределения частиц использовали опции Threshold и Particle analysis программы ImageJ для определения площади и координат частицы. Для определения плотности распределения частиц, цитопласт разбивали на круги с шагом 0,1 от радиуса цитопласта и считали суммарную площадь везикулярных структур в данных кольцах. Плотность равнялась суммарной площади везикулярных структур, деленная на общую площадь кольца.

Для определения геометрического центра цитопластов и клеток использовали программу Autodesk Inventor 9 (Autodesk). Построение графиков и диаграмм производили в программе Sigma Plot 7.0 (SPSS Inc.), на графиках указаны стандартные отклонения. Обработку изображений проводили в программе Photoshop 7.0 (Adobe).

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Система микротрубочек в стареющих цитопластах постепенно утрачивает радиальный характер

В данной части работы для получения цитопластов использовали клетки линии Vero (фибробласты почки зелёной мартышки). Около 99% полученных с помощью центрифугирования в цитохалазине В цитопластов содержали центросому, визуализирующуюся с помощью иммунофлуресцентного окрашивания на гамма-тубулин. Через 2 ч после получения большинство цитопластов содержали радиальную систему микротрубочек, как и исходные контрольные клетки (Рис 10 А, Б). С увеличением времени инкубации после энуклеации увеличивался процент цитопластов с хаотическим расположением микротрубочек, хотя окрашивание центросомы антителами к гамма-тубулину сохранялось. При этом система микротрубочек в клетках после процедуры энуклеации, не изменялась (Рис. 10 О). Через 17 ч после энуклеации в большинстве цитопластов структура сети микротрубочек становилась хаотичной, запутанной (Рис. 10 В, Г). В околоцентросомной области цитопластов, однако, можно было проследить некоторую радиальность микротрубочек с центром в центросоме. Для точной оценки радиальности системы микротрубочек мы построили диаграммы распределения флуоресценции по длине радиуса клеток Vero, свежеполученных (здесь и далее — 1−2 ч после центрифугирования) цитопластов или стареющих (здесь и далее — 17 ч после центрифугирования). В клетках Vero или в свежеполученных цитопластах количество тубулина убывает от центра клетки к периферии практически линейно (Рис. 10 Е, Ж), что соответствует радиальному расположению микротрубочек (Смурова и др., 2003). В стареющих же цитопластах этот график выходит на плато (Рис. 10 3), что соответствует случайному, хаотическому распределению микротрубочек в цитоплазме (Смурова и др., 2003).

Причинами нарушения радиальности системы микротрубочек в цитопластах могут быть потеря центросомой способности нуклеировать и/или заякоривать новые микротрубочки или нарушение динамики сборки/разборки самих микротрубочек, поскольку стабилизация микротрубочек ведет к потере их связи с центросомой.

Хаотизация микротрубочек цитопласта не связана с утратой активности центросомы.

Для выяснения причин утраты радиальности микротрубочек в цитопластах мы исследовали активность в них центросомы. Цитопласты охлаждали при 0 °C в течение 1.

36 часа, чтобы разобрать микротрубочки, а затем вновь помещали их в термостат для восстановления микротрубочек.

Рис. 10 Система микротрубочек в клетках Vero и цитопластах. (А, Б, И-М) иммунофлуоресцентное окрашивание на а-тубулин, (Б, Г) иммунофлуоресцентное окрашивание на у-тубулин. (А, Б) — клетка и цитопласт через 2 часа после процедуры энуклеации- (В, Г) — клетка и цитопласты через 17 часов после процедуры энуклеации. Стрелками отмечено положение центросомы, а перекрестье обозначает геометрический центр. Можно заметить хаотизацию системы микротрубочек через 17 часов в цитопласте. (Е, Ж, 3) — графики изменения интенсивности флуоресценции вдоль радиуса у клеток Vero, 2-х и 17-ти часовых цитопластов соответственно. (И-М) — восстановление микротрубочек после деполимеризации на холоду (1 час на льду с последующим нагреванием на 37 °С) при — 5, 15, 60 и 120-ти минутах восстановления.

Можно заметить, что происходит восстановление звезды микротрубочек после их деполимеризации. (Н) — графики интенсивностей флуоресценции вдоль радиуса при иммунофлуоресцентном окрашивание цитопластов а-тубулин при восстановление микротрубочек при их восстановлении. (О) — доля (%) клеток и цитопластов с радиальной системой микротрубочек, при различном времени регенерации после энуклеации. Во всех графиков показано стандартное отклонение (±SD). Масштабная линейка 10 мкм.

Через различные промежутки времени цитопласты фиксировали и выявляли микротрубочки по иммунофлуоресцентному окрашиванию (Рис. 10 И-М). Спустя 5 -10 мин от начала прогрева в термостате вокруг центросом стареющих цитопластов наблюдали отчетливо выраженную звезду из микротрубочек, такую же, как в контрольных клетках или в свежеполученных цитопластах (Рис. 10 И, К). Таким образом, центросома в стареющих цитопластах сохранила свою нуклеирующую активность, и предшествовавшая постепенная хаотизация микротрубочек в цитопластах не была вызвана нарушением нуклеации на центросомах.

Было сделано предположение, что после разборки и последующего восстановления система микротрубочек в таких цитопластах будет вновь стремиться к хаотизации. Оказалось, что в стареющих цитопластах радиальная система микротрубочек вначале восстанавливается, а потом постепенно становится хаотичной (Рис. 10 JI, М). На диаграммах распределения флуоресценции по длине радиуса цитопласта видно, что через 5−10 мин восстановления разрушенной системы микротрубочек, когда в цитопластах наблюдается радиальная система микротрубочек, интенсивность флуоресценции падает линейно от центра к периферии. Через некоторое время начинается хаотизация системы микротрубочек, причем не в области центросомы, а на краю цитопласта — на графике это выражается в виде появления плато (Рис. 10 Н). В области же центросомы достаточно долго сохраняется радиальное расположение микротрубочек, т. е. линейное падение интенсивности флуоресценции. Данные наблюдения могут свидетельствовать о том, что и заякоривающая способность центросомы также не претерпевает в стареющих цитопластах серьезных изменений. ->

В стареющих цитопластах не происходит стабилизации микротрубочек.

Стабилизация цитоплазматических микротрубочек обычно сопровождается ацетилированием тубулина (Piperno et al., 1987). Для того чтобы выяснить, изменяется ли заметным образом с течением времени динамика микротрубочек в цитопластах, мы проводили иммунофлуоресцентное окрашивание цитопластов антителами к ацетилированному тубулину.

Рис. 11. Стабильные микротрубочки и аппарат Гольджи в клетках Vero и цитопластах. (А, Г) — фазовый контраст, (Б, Д) — иммунофлуоресцентное окрашивание на ацетилированный тубулин, (В, Е) — иммунофлуоресцентное окрашивание на маннозидазу II, (Ж — К) — иммунофлуоресцентное окрашивание на а-тубулин. (А-В) — клетка Vero и цитопласты через 2 часа после энуклеации видно, что ацетилированные микротрубочки сконцентрированы в центре цитопласта/клетке, где локализован аппарат Гольджи. (Г-Е) — 17-ти часовые цитопласты, ацетилированные микротрубочки перераспределены к периферии цитопласта. Аппарат Гольджи сохраняет свое центральное положение, сигнализируя о том, что динеиновый мотор сохраняет свою активность. (Ж-К) Деполимеризация микротрубочек нокодазолом (1 мкг/мл) в течение 5 минут (Ж, И) или 30 минут (3, К) у 2-х и 17-ти часовых цитопластов соответственно. (JI) — количество ацетилированного тубулина в цитопластах и клетках. Интенсивность флуоресценции при иммунофлуоресцентном окрашивании. (М) — динамика деполимеризации микротрубочек нокодазолом (1 мкг/мл). Стрелкой указаны места загиба ассоциированных с центросомой микротрубочек у края цитопласта. Масштабная линейка 10 мкм.

Выяснилось, что количество ацетилированных, то есть стабильных, микротрубочек заметно не отличалось у свежеполученных (Рис. 11 А-В) и у стареющих цитопластов (Рис. 11 В-Г), но было несколько больше, чем в клетках Vero (Рис. 11 JI).

При этом у стареющих цитопластов все ацетилированные микротрубочки оказались достаточно равномерно распределены по цитоплазме, в то время как в клетках, и свежеполученных цитопластах ацетилированные микротрубочки собраны в центральной области, где локализуется аппарат Гольджи (Рис 11 В).

В принципе, стареющие цитопласты могли потерять ацетилазу тубулина. Чтобы подтвердить отсутствие стабилизации микротрубочек в стареющих цитопластах по сравнению со свежеполученными и с контрольными клетками, микротрубочки разбирали действием нокодазола в концентрации 1 мкг/мл в течение 30 минут у свежеполученных (Рис. 11 Ж, 3) и стареющих цитопластов (Рис. 11 И, К). Динамику деполимеризации оценивали по количеству оставшихся микротрубочек, количество которых оказалось примерно одинаковым у двух видов цитопластов (Рис. 11 М). Это подтверждает вывод о том, что с течением времени в цитопластах заметной стабилизации микротрубочек (увеличения их резистентности к нокодазолу) не происходит. Поскольку по сравнению с контрольными клетками Vero у обоих видов цитопластов число стабильных ацетилированных микротрубочек увеличено, можно предположить, что если некоторое изменение динамики микротрубочек и имеет место, то это происходит непосредственно после потери ядра клеткой и не сказывается на строении системы микротрубочек.

Интересно отметить, что, несмотря на примерно одинаковую плотность оставшейся после деполимеризации сети микротрубочек, у стареющих цитопластов некоторые отходящие от центросомы микротрубочки доходят до периферии цитопласта, загибаются и продолжаются далее (Рис 11 К, показано стрелками), а у клеток и свежеполученных цитопластов подобное можно наблюдать только для свободных цитоплазматических микротрубочек (Рис 113).

Растущие в стареющих цитопластах микротрубочки не прекращают свой рост возле края цитопласта.

Существование в 17-часовых цитопластах микротрубочек, длина которых намного превышает расстояние от центросомы до клеточной мембраны, говорит о том, что рост микротрубочек в этих цитопластах продолжается и после достижения ими края клетки.

Чтобы проверить это предположение, клетки Vero были трансфицированы плазмидой кодирующей GFP-tubulin, для прижизненного наблюдения за микротрубочками. Полученные из данных клеток цитопласты содержали GFP-меченные микротрубочки.

В свежеполученных цитопластах микротрубочка при достижении края прекращала свой рост и деполимеризовалась, тогда как в стареющих цитопластах микротрубочки после достижения края могут продолжить свой рост (Рис. 12 А, Б).

Ацитопласт 2 ч цитопласт 17ч Б.

10 20 30 время (секунды).

Рис. 12 Разное поведение микротрубочек вблизи края у цитопластов Vero.

А) Наблюдение за концом микротрубочки у 2-х (левая панель) и 17-ти часового цитопласта (правая панель) вблизи края. В только что полученных цитопластах (2ч) микротрубочки при достижение края притерпевают катастрофу, а в стареющих цитопластах (17 ч) микротрубочки продолжают свой рост и после достижения мембраны. (Б) — график длины микротрубочек представленных на (А) белой стрелкой. Стрелкой показан момент достижения края микротрубочкой. Время в секундах. Масштабная линейка 1 мкм.

Растущие микротрубочки в стареющих цитопластах не взаимодействуют клеточным кортексом.

Возможно, отсутствие деполимеризации микротрубочек на краю происходит благодаря скольжению растущего плюс-конца микротрубочки вдоль клеточного кортекса. Для того, чтобы оценить возможность потери взаимодействия плюс концов микротрубочек с кортексом, цитопласты иммунофлуоресцентно окрашивали на белок pl50Glued (рис специфически связывающийся как с центросомой, так и с растущим плюс-концом микротрубочки (Tirnauer and Bierer, 2000). В интактных клетках Vero микротрубочка при достижении периферии остановливается и начинает флуктуировать возле мембраны клетки (Komarova et al., 2002). р50/актин.

Рис. 13. Распределение белков динактинового комплекса в цитопластах Vero. (А-Г) — Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание на а-тубулин (красный) и pl50-Glued (зеленый). (А) — клетка Vero, (Б, Г) — 17-ти часовые цитоласты (В) — 2-х часовой цитопласт, Стрелками указаны кометы динактина на концах микротрубочек. В (Б) микротрубочки были деполимеризованны на холоду и восстановлены в течение 15-ти минут при 37 °C. (Д-К) двойное иммунофлуоресцентное окрашивание TRITC-фаллоидин (красный) (Е, И) и анти-динамитин (зеленый) (Д, 3), (Ж, К) — наложение. (Д-Ж) — свежеполученные цитопласты. (3-К) — стареющие цитопласты. (JI) — отношение флуоресценции р50/актин в районе ламеллы. Масштабная линейка 10 мкм.

При этом плюс-концевые «кометы» часто расположены в непосредственной близости к плазматической мембране (Рис 13 А), такая же картина наблюдается и у только что полученных цитопластов (Рис 13 В). В стареющих цитопластах плюс-концевые кометы pl50-Glued отсутствуют в околомембранной области, и общее их количество резко снижено (Рис. 13 Г). Однако это не является следствием деградации динактина: при восстановлении микротрубочек после их деполимеризации появляются «кометы» нормального вида, вскоре пропадающие (Рис 13 Б).

Это может говорить о том, что микротрубочки в стареющих цитопластах не останавливаются у мембраны.

Для прижизненного наблюдения за плюс концевыми кометами в цитопластах, клетки трансфицировали плазмидой, кодирующей YFP-CLIP170, и получали цитопласты.

В клетках Vero и в только что полученных цитопластах кометы CLIP-170 исчезали, достигая края клетки (Рис. 14 А). В стареющих цитопластах сами кометы были значительно меньше, а иногда можно было наблюдать длинные стационарные тяжи из CLIP 170. Часто можно было наблюдать, что при достижении клеточного края комета не исчезала, а заворачивала обратно в цитоплазму (Рис. 14 Б).

По-видимому, в стареющих цитопластах свойства кортекса в них изменены. При окрашивании клеток и свежеполученных цитопластов Vero (Рис. 13 Д-Ж) на другой белок динактинового комплекса — р50 динамитин — также выявляется и его кортикальный пул в области ламеллы, визуализированной по актину с помощью TRITC меченного фаллоидина (Рис. 13 Д-Ж). Мы обнаружили, что в стареющих цитопластах кортикальное окрашивание р50 сильно ослабевает по сравнению с окрашиванием на актин (Рис. 13 3-К), в то же время, р50 сохраняет свое присутствие на центросоме (не показано). Для количественной оценки уменьшения содержания р50 в кортексе измеряли отношение флуоресценции кортикального р50 к флуоресценции актина при иммунофлуоресцентном окрашивании, что показало снижение его присутствия в кортикальной области (Рис. 13 JI).

Находится ли центросома (МТОЦ) цитопластов в их геометрическом центре?

Направление роста плюс концевых комет является одним из факторов, по которым можно судить об общей системе микротрубочек, так при радиальной системе микротрубочек их полимеризация происходит из единого центра и идет вдоль радиуса.

При измерении углов между кометами CLIP-170 и радиусом клеток (Рис. 14 В) оказалось, что направление роста микротрубочек в контрольных клетках радиально, то есть совпадает с радиусом клетки, проведённым от её геометрического центра к периферии, и угол отклонения от радиуса имеет значения, близкие к нулевым. У свежеполученных цитопластов направление большинства комет было также близко к радиальному. В то же время, у 17-часовых цитопластов угол отклонения комет был значительным, т. е. направление роста микротрубочек сильно отличалось от радиального.

Теоретически отклонение роста микротрубочек от радиуса может быть следствием двух причин. Первая заключается в том, что расположение самой центросомы не совпадает с расположением геометрического центра цитопласта, из которого проводился радиус. Очевидно, что чем больше будет расстояние между центром и центросомой, тем больше плюс-концевые кометы должны отклоняться от радиального направления.

Jf t. 1.

12 A f.

Jr.

30 *.

42 ч.

84 • i т>

О 40 80 120 160.

0 40 80 120 160 отклонение от радиуса, град.

Рис. 14 Наравление движения комет YFP-CLIP170 различно у двух видов цитопластов. (А) — кометы YFP-CLIP170 исчезают при достижении края у 2-х часовых цитопластов. (Б) — кометы продолжают свое движение после достижения края, изменяя направления роста у стареющих цитопластов. (С) — распределение направлений движения комет, выраженных в углах отклонения от радиуса в клетках, у только что полученных и стареющих цитопластах. Масштабная линейка 10 мкм.

Чтобы проверить данную версию, измеряли расстояние между центросомой и геометрическим центром цитопластов. Оно оказалось примерно одинаковым для свежеполученных (Рис. 10 А, Б) и стареющих (Рис. 10 В, Г) цитопластов и равнялось приблизительно 4 мкм (Рис. 15 Б). В качестве контроля использовали деполимеризацию микротрубочек в цитопластах нокодазолом в течение 17 часов, в этих условиях происходит смещение центросомы из области центра на периферию (Рис. 15 А, Б). Так как смещения центросомы из центра цитопластов не происходит, это не может служить причиной изменения направления роста плюс-концов микротрубочек. Повидимому основной причиной нарушения раиальной системы микротрубочек является продолжение роста микротрубочки, и после достижения края цитопласта.

Рис. 15. Центросома сохраняет свое центральное положение в 17-ти часовых цитопластах, но смещается при деполимеризации микротрубочек. (А) цитопласты после 1 час деполимеризации на холоду и 15-ти часах деполимеризации нокодазолом (1 мкг/мл). (Б) — Столбчатая диаграмма расстояния между положением центросомы и геометрическим центром в цитопластах Vero±SD. Стрелкой указано положение центросомы, перекрестьем — положение геометрического центра. Масштабная линейка 10 мкм.

Разрушение динеин-динактинового комплекса ведет к хаотизации системы микротрубочек в клетках BSC-1 и HeLa.

Для исследования механизмов образования бесцентросомной радиальной системы микротрубочек мы получили бесцентросомные цитопласты из клеток BSC-1 и HeLa.

Бесцентросомные цитопласты, полученные из этих культур, эффективно образуют радиальную систему микротрубочек (Rodionov et al., 1998), и наши данные это подтвердили (Рис. 16 А-В). В клетках и в содержащих центросому цитопластах BSC-1 система микротрубочек практически не отличается, причем она четко радиальная (Рис. 7А-Б). В бесцентросомных цитопластах BSC-1 и HeLa виден достаточно обширный рыхлый центр со спутанными микротрубочками, и микротрубочки выходят из этого центра радиально на периферию цитопласта (Рис. 16 В). Ранее было обнаружено, что при нарушении функции динеина, например, избытком фрагмента СС1 белка pl50Glued (Quintyne et al., 1999) в клетках нарушается радиальная система микротрубочек. Полагают, что это связано с ингибированием заякоривающей активности центросомы. Однако, например, в клетках HeLa наблюдается достаточно низкая активность центросомы и в контроле (Жаппарова, 2008), что хорошо заметно при наблюдении за восстановлением разрушенной системы микротрубочек. В связи с этим можно было бы предположить, что инактивация центросомы действием CCl-pl50Glued существенно не повлияет на общую радиальную систему в данных клетках. Однако подобного не происходит, и при продукции CCl-pl50Glued фрагмента в бесцентросомных цитопластах наблюдается разрушение радиальной системы микротрубочек (Рис. 16 Г, Рис. 19 Б).

Рис. 16. Влияние ингибирования динеин-динактинового комплекса не организацию радиальной бесцентросомной системы микротрубочек в цитопластах BSC-1. Иммунофлуоресцентное окрашивание на а-тубулин клетки BSC-1 (А), цитопласта, содержащего центросому (Б), бесцентросомного цитопласта (В) и бесцентросомного цитопласта, трансфицированного GFP-pl50-CCl. На нижней панели показан увеличенный фрагмент выделенный белой рамкой, а также иммунофлуоресцентное окрашивания на у-тубулин данного фрагмента, для визуализации центросомы.

Следовательно, можно предположить, что для «бесцентросомного» образования радиальной системы микротрубочек необходима активность динеин-динактинового комплекса.

В бесцентросомных цитопластах микротрубочки иуклеируются преимущественно в центральной области.

Зависимость от динеина в формировании бесцентросомной радиальной сети микротрубочек может указывать на его вовлечение в состав определенных органелл, обеспечивающих данный процесс. Действительно, после процедуры энуклеации в среде с нокодазолом у получившегося бесцентросомного цитопласта аппарат Гольджи находится в дипергированной форме. В процессе последующего инкубирования в среде без нокодазола происходит восстановление компактной структуры аппарата Гольджи. Данный процесс внешне напоминает агрегацию пигментных гранул в меланоците тернеции, в которой участвуют динеиновые моторы. Существует предположение, что аппарат Гольджи может быть движущей силой образования радиальной сети микротрубочек без участия центросомы (Malikov et al., 2005, Efimov et al., 2007).

При агрегации пигментных гранул во фрагметах меланофоров микротрубочки образуются в агрегатах (Vorobjev et al., 2001). Мы проверили, где в цитопластах иуклеируются микротрубочки, проследив за возникновением комет CLIP-170. Оказалось, что в цитопластах наблюдается два варианта нуклеаций микротрубочек: микротрубочки иуклеируются в точечной области (Рис 17 А, Б), скорее всего, на центросоме, или микротрубочки иуклеируются преимущественно в центральной области цитопласта (Рис 17 В), что, скорее всего, соответствует бесцентросомному цитопласту. Во втором случае область появления комет несколько шире, чем в содержащих центросому цитопластах и клетках BSC-1, что соответствует тому, что сам микротрубочко-организующий центр в бесцентросомных цитопластах значительно обширнее, чем центросома. Этот центр примерно соответствует району расположения аппарата Гольджи и других везикулярных структур.

Рис. 17. Характер нуклеации микротрубочек в цитопластах BSC-1.

Экспрессия YFP-CLIP-170 в клетке BSC-1 (А), цитопласте с выраженной центросомной нуклеацией (Б) и в цитопласте без выраженной центросомной нуклеации комет (В). Линиями показаны треки индивидуальных комет, за 50−60 сек. (7−9 кадров).

Аппарат Гольджи и COPI зависимый транспорт не участвуют в формировании радиальной системы микротрубочек.

Чтобы проверить роль аппарата Гольджи в организации бесцентросомной радиальной системы микротрубочек, мы после процесса энуклеации добавляли в среду брефелдин, А (2 мкг/мл 2 ч.).

А тубулин p150Glued маннозидаза II совмещение jO С, а н т о se i со ф: ¦ Контроль г / - ф Лг ISv Щг Ш BFA.

GFP-ERGIC53.

GFP-ERGIC53.

GFP-Sec23.

BFA.

О 0.2 0.4 О. е 0.8 1.0 расстояние (отн ед.).

ERGIC.

ERES.

Рис 18. Аппарат Гольджи и COPI зависимый транспорт не участвуют в бесцентросомном механизме образования радиальной системы микротрубочек.

А) Окрашивание антителами к а-тубулину — микротрубочки (красный), к pl50-Glued — центросома (зеленый) и Manll — аппарат Гольджи (синий) клеток BSC-1 выявляет образование радиальной системы микротрубочек как у цитопластов, содержащих центросому, так и у бесцентросомных, причем у обоих видов происходит образование компактного аппарата Гольджи в центральной области цитопласта. При добавлении в среду брефелдина, А (2 мкг/мл) — ингибитора COPIзависимого транспортапроисходит слияние мембран ЭР и АГ с полным переходом компонентов последнего в ЭР, однако данное воздействие не влияет на бесцентросомное образование радиальной системы микротрубочек. (Б) При действии брефельдина, А сохраняется ERGIC (визуализированного про белку-маркеру ERGIC-53, при действии брефельдина, А исчезает только пул белка в аппарате Гольджи), и ERES (визуализированный по белку-маркеру Sec23). (В) Распределение ERGIC и ERES при действии брефельдина, А в цитопластах HeLa, распределение рассчитывалось как зависимость плотности данных везикулярных структур от расстояния до центра цитопласта (см. материалы и методы. Вертикальной линией показан средний радиус микротрубочко-организующего центра в цитопластах HeLa. Масштабная линейка — J0 мкм.

Под действием брефелдина, А происходит ингибирование малой ГТФазы ARF1 и происходит разрушение компактной структуры аппарата Гольджи с полным слиянием мембран аппарата Гольджи и ЭР, маркерный белок аппарата Гольджи — маннозидаза II (Mann II) выявляется диффузно по всей цитоплазме (Рис. 18 А). Однако даже в этих условиях происходит эффективное образование радиальной системы микротрубочек у бесцентросомных цитопластов, как и в отсутствии брефелдина, А (Рис. 18 А, Рис. 19 Б). Данный факт свидетельствует о том, что и без аппарата Гольджи может образовываться радиальная система микротрубочек.

Окадаевая кислота эффективно блокирует формирование радиальной системы микротрубочек у бесцентросомных цитопластов.

Так как нарушение функции ARF ГТФазы, управляющей COPI транспортной системой, не оказало действия на систему микротрубочек, мы предположили, что на нее может влиять COPII-зависимый транспорт, который сохраняется в присутствии брефелдина А. Это можно видеть по присутствию окаймления на ERES, выявленного при экспрессии белка окаймления GFP-Sec23, а также наличию промежуточного компартмента ERGIC, выявленного при экспрессии GFP-ERGIC53 (Рис. 18 Б). При этом данные органеллы хотя и не образуют компактной структуры, как аппарат Гольджи, располагаются в цитоплазме градиентно (Рис. 18 В), то есть имеют тенденцию скапливаться в центре цитопласта.

Для проверки предположения о влиянии на систему микротрубочек COPII-зависимого транспорта была использована окадаевая кислота (2 мкМ/мл 2 ч), которая блокирует COPII-экспортный механизм из ЭР (Pryde et al., 1998). В результате действия данного агента не образовывалась радиальная система микротрубочек в бесцентросомных цитопластах BSC-1, тогда как в цитопластах BSC-1, содержащих центросому, система микротрубочек оставалась радиальной (Рис. 19 А, Б). В условиях, когда блокирован СОРИ-транспортный механизм, происходит полная потеря АГ, а также промежуточного компартмента (ERGIC), компоненты которых переходят в ЭР по COPI зависимому механизму (Рис. 19 А). При этом также нарушается система экспорта белков из ЭР, которая происходит в ERES.

Так как окадаевая кислота блокирует образование радиальной системы микротрубочек в бесцентросомных цитопластах, то можно предположить, что для образования этой системы необходимы ERGIC и ERES, активно генерирующий СОРИ везикулы. Для того, чтобы определить важность присутствия ERGIC, в среду инкубирования после энуклеации, кроме окадаевой кислоты, также добавляли брефелдин А, действие которого блокирует потерю ERGIC. В данных условиях цитопласты BSC-1 и HeLa (не показано) образуют радиальную систему микротрубочек по бссцентросомному механизму (Рис. 19 А, Б).

Ингибирование образования СОРИ окаймления эффективно блокирует образование бесцентросомной радиальной системы микротрубочек.

Для более специфической проверки действия окадаевой кислоты на радиальную систему микротрубочек мы ингибировали образование СОРИ окаймления с помощью действия мутантов малой ГТФ-азы Sari а, экспрессируя их в клетках слитыми с зеленым флуоресцентным белком. Sari, а инициирует образование СОРИ окаймления в ERES. При экспрессии в клетках неактивного (доминантно-негативного) мутанта Sarla[T39N], который постоянно находится в ГДФ-форме, происходит ингибирование образования COPII окаймления и исчезновение, как аппарата Гольджи, так и промежуточного компартмента. В этих условиях в бесцентросомных цитопластах BSC-1 затруднено образование радиальной системы микротрубочек по сравнению с цитоиластами, экспрессирующими Sari, а дикого типа (Рис. 20 А, Б).

Интересно также отметить, что при экспрессии конститутивно-активного мутанта Sarla[H79G] также возможно образование радиальной системы микротрубочек у бесцентросомных цитопластов (Рис. 20 А, Б). Этот факт интересен тем, что в этих условиях также ингибируется отпочковывание СОРИ-окаймленных везикул, но при этом окаймление как бы остается замороженным на мембранах ERES, и они образуют скопления в центре клетки (Рис. 20 А). Белки-маркеры ERGIC колокализуются с данными скоплениями. Так как здесь отсутствуют другие органеллы раннего везикулярного транспорта, по-видимому, сборка скоплений ERES/ERGIC является движущей силой образования радиальной системы микротрубочек без участия центросомы в данных условиях. у-тубулин.

ERGIC53.

Рис 19. Окадаевая кислота ингибирует образование радиальной системы микротрубочек у бесцентросомных цитопластов, а брефелдин, А блокирует данное действие окадаевой кислоты. (А) При окрашивании антителами к а-тубулину (красный) и к у-тубулину (зеленый) видно, что бесцентросомные цитопласты BSC-1 в контроле образуют радиальную систему микротрубочек. Окадаевая кислота (2 мкМ/мл) специфически блокирует бесцентросомный механизм образования радиальной системы микротрубочек, тогда как цитопласты, содержащие центросому, сохраняют способность к построению радиальной сети микротрубочек. Брефелдин, А (2 мкг/мл) ингибирует действие окадаевой кислоты на систему микротрубочек в бесцентросомных цитопластах. Также показано морфология промежуточного компартмента при данных воздействиях, путем иммунофлуоресцентного окрашивания к белку ERGIC-53. (Б) Подсчет эффектов брефельдина А, окадаевой кислоты, а также сверхэкспрессии р150-СС1 на образование бесцентросомной радиальной системы микротрубочек. Масштабная линейка — 10 мкм.

Поняв молекулярные механизмы сборки данных скоплений, впоследствии их можно применить для исследования роли в построении бесцентросомной радиальной системы микротрубочек.

Л флуоресц. GFP найнеин а-тубулин совмещение со.

I— го Л.

О) 00 н го го со о.

СУ> г-X го 1—. го С/3 Р.

• ш ' вя f. 'V"*.

4vv.

Рис. 20. При иигибироваиии COPII-зависимого транспорта в отсутствие центросомы не образуется радиальная система микротрубочек. (А) — верхняя панель экспрессия в цитопласте ГТФ-азы Sari а, средняя панель экспрессия в цитопласте доминантно-негативного мутанта ГТФ-азы Sarla[T39N], нижняя панельэкспрессия в цитопласте конститутивно-активного мутанта ГТФ-азы Sarla[H79G]. (Б) — подсчет эффекта экспрессии мутантов Sari, а на образование радиальной системы микротрубочек в бесцентросомных цитопластах.

Кластеризация ERES при сверхэкспрессии конститутивно-активного мутанта Sarla[H79G] происходит только при наличии микротрубочек.

Зависит ли кластеризация ERES под влиянием Sarla[H79G] от присутствия микротрубочек? Для проверки этого мы разобрали микротрубочки нокодазолом. В отсутствие микротрубочек скопление ERGIC диспергируется по всей клетке (Рис. 21 А, Б) Интересно было посмотреть, является ли этот переход следствием прямого расхождения частиц из кластера, или же это псевдодиспергирование, как в случае с аппаратом Гольджи, когда его мелкие цистерны появляются de novo.

GFP-a-тубулин Sari a[H79G]-mCherry совмещение л с о о.

II 2 с 0 со СО 1 о X.

•. L — V. ¦

Б Распределение ERES различного размера по радиусу клеток.

О 5 10 15 20 25 30 расстояние от центра клетки, мкм «контроль • нокодазол.

Рис. 21. Разрушение микротрубочек приводит к диспергированию кластеров ERES, образовавшихся при экспрессии Sarla[H79G], (А).

Коэкспрессия в клетках слитого с GFP альфа-тубулина и слитым с mCherry Sarla[H79G]. Нижний ряд — в среду добавлен нокодазол. (Б) — диаграмма распределения частиц ERES в клетках. Видно, что в присутствии нокодазола зона распределения ERES по клетке расширена.

Мы провели прижизненное наблюдение за клетками, экспрессирующими GFP-Sarla[H79G], с добавлением или отмывкой нокадозола. При добавлении нокодазола наблюдали динамику «расползания» кластера, и обнаружили, что его частички напрямую передвигаются на периферию клетки (Рис. 22, верхняя панель). При отмывке нокодазола, напротив, наблюдали прямое схождение к центру отдельных везикул. Это говорит о том, что процесс образования агрегата является следствием прямого схождения к центру отдельных ERES (Рис. 22, нижняя панель). При этом центр агрегата колокализуется с центром организации микротрубочек, где находятся их минус концы. Логично было предположить, что движение везикул в сторону кластера опосредовано активностью минус-концевого мотора динеина и его кофактора динактина.

НОКОДЗЗОЛ ' «Г,» .

Рис. 22. Прижизненное наблюдение за процессами образования и диспергирования кластера ERES при экспрессии GFP-Sarla[H79G]. Верхняя панель в среду добавляли нокодазол и проводили видеомикроскопию. Нижняя панельклетки отмывали от нокодазола. Указано время в минутах.

Кластеризация ERES при сверхэксперссии конститутивно активного мутанта зависит от активности динеин-динактинового комплекса.

Для определения роли динеин-динактинового комплекса мы котрансфецировали клетки ДНК-конструкциями, кодирующими конститутивно-активный мутант Sar[H79G] и различные фрагменты белка р150 Glued, полноразмерный р150 или р50-динамитин (Рис. 23).

При коэкспрессии фрагмента р150-СС1, который ингибирует активность динеинового мотора, кластер ERES не образовывался, а находился в диспергированном состоянии (Рис 23 Б, Рис.24).

Можно предположить, что кластеризация ERES зависит ох активности динеина, и что динеин неким образом связан с мембранами ERES. Возможно, это связывание происходит через белок pl50Glued, который часто играет роль посредника в сязывании динеинового мотора с мембранной везикулой, и ингибирующее действие СС1 фрагмента состоит в ингибировании связывания динактина с динеином (Schroer, 2004). А.

СС1 я.

GC2.

§ с Б md СС1 ст md+ct р150-Ahead head р150*.

Sar1a[H79G].

Рис. 23. Влияние экспрессии различных фрагментов белка динактина pl50Glued и белка динактина р50 (динамитина) на морфологию кластеров ERES, индуцированных экспрессией Sarla[H79G]. (А) — схема использованных в работе слитых с GFP фрагментов белка pl50Glued- (Б) — подсчет числа частиц ERES в клетке при коэкспрессии конститутивно-активного мутанта Sarla[H79G] и фрагментов белка р150, а также полноразмерных pl50Glued и р50 динамитина.

Интересно было бы установить, какой фрагмент р150 ответственен за это связывание. Связь С-концевого фрагмента pi50 (СТ) с белком СОРИ окаймления Sec23 была показана ранее другими авторами (Watson et al., 2005), и мы предположили, что экспрессия такого фрагмента может иметь доминантно-негативный эффект.

Рис. 24. Коэкспрессия фрагментов белка pl50Glued, а также полноразмерных pl50Glued и р50 динамитин с конститутивно активным мутантом ГТФ-азы Sarla[H79G]. Объяснение см. текст.

Однако в условиях коэкспрессии мутанта Sarl[H79G] с СТ-фрагментом pl50Glued кластер ERES присутствовал в клетках, причем СТ колокализовался с кластером (Рис 25, Рис 23 Б). Такой же эффект наблюдался и при соэкспрессии с междоменным участком (MD), схожий эффект давала коэкспрессия слитых этих фрагментов (CT-MD) (Рис 25, Рис 23 Б). Но при коэкспрессии с фрагментом р150, у которого отсутствовал N-концевой участок, ERES находился в диспергированном состоянии, что может говорить важности N-концевого участка (Рис 24, Рис 23 Б). Однако кластер присутствовал с отдельно коэкспрессируемым N-концевым участком pl50Glued (head) (данные не показаны).

Рис. 25. Коэксирессия фрагментов белка pl50Glued с конститутивно активным мутантом ГТФ-азы Sarla[H79G]. Объяснение см. текст.

Данный факт можно объяснить двумя способами, что-либо само присутствие СС1 имеет ингибирующее действие на активность динеинового мотора, либо N-концевой участок играет некую регуляторную роль в активности белка р150. Интересно, что белок р50 динамитин также не влияет на образование агрегата ERES (Рис 24, Рис 23 Б), что несколько необычно, так как в работах других авторов было показано его ингибирующее действие на динеин-динактиновый комплекс и систему микротрубочек в целом (Burkhard et al., 1997, Melkonian et al., 2007).

Общий подсчет результатов данных воздействий на образование кластера ERES, выраженный в числе везикулярных структур, выявляемых по иммунофлуоресцентному окрашиванию Sarla[H79G]/ERGIC-53, представлен на Рис. 23 Б.

ОБСУЖДЕНИЕ.

Цитопласты лишены ядра, и в них происходит постепенная деградация РНК и белков. В цитопластах довольно скоро, через несколько часов после их получения, прекращается биосинтез белка. Тем не менее, цитопласты сохраняют жизнеспособность в течение достаточно длительного времени, иногда до 48 ч. (Karsenti et al., 1984). Очевидно, что первыми из цитопластов пропадают белки, которые имеют короткое время жизни, а длительно живущие белки сохраняются. Поэтому цитопласт представляет собой неплохую систему для анализа сложных клеточных функций, для которых еще не известны участвующие в них белки, которые можно было бы заингибировать специфически, с помощью доминантно-негативных конструкций или РНК-интерференции.

Одной из таких систем являются клеточные микротрубочки, тесно связанные с центросомой. Один из вопросов, обращенных к клеточным микротрубочкам — это механизмы формирования их радиальной сети. В настоящей работе мы показали, что в стареющих цитопластах клеток Vero система микротрубочек из радиальной становится хаотической, хотя активность центросомы не меняется. Хаотичность микротрубочек мы наблюдали непосредственно, а также оценивали количественно по измерениям интенсивности флуоресценции тубулина вдоль радиуса клетки. Ранее было обнаружено, что с течением времени в цитопластах клеток BSC-1 микротрубочки также становятся хаотичными (Maniotis and Schliwa, 1991), хотя в цитопластах L-клеток они сохраняли радиальность (Moskalewski and Thyberg, 1988; Gorgidze and Vorobjev, 1995). Вероятно, эти отличия обусловлены типом клеток. Мы исследовали активность центросом в цитопластах и обнаружили, что они сохраняют способность и нуклеировать, и заякоривать микротрубочки, т. е. вполне активны. Это означает, что белки, участвующие в активности центросом, имеют значительное время жизни, и что микротрубочки могут быть хаотичны и при работающей центросоме.

Из данных, полученных в настоящей работе, следует, что в стареющих цитопластах Vero микротрубочки теряют связь с клеточным кортексом, хотя сохраняют динамичность. Мы обнаружили, что микротрубочки в цитопластах становятся несколько более стабильными, т. е. накапливают ацетилированный тубулин немедленно после энуклеации, но не делаются более резистентными к действию нокодазола. Тем не менее, в свежеполученных цитопластах система микротрубочек по своей морфологии неотличима от клеточной, т. е. небольшая стабилизация микротрубочек не влияет на общие свойства их системы (радиальная организация вокруг центросомы, концы находятся у периферии клеток).

В настоящей работе мы обнаружили, что в стареющих цитопластах изменены свойства клеточного кортекса и микротрубочки не взаимодействуют с ним — они изгибаются и уходят назад в цитоплазму, достигнув края клетки. Также отсутствуют плюс концевые кометы белка pl50Glued у края клетки, что может свидетельствовать об отсутствии динамической нестабильности — осцилляции микротрубочки после достижения ей клеточного кортекса. При экспрессии белка CLIP170-YFP часто наблюдались плюс-концевые кометы, которые не исчезали после достижения края, а изменяли свое направление роста и продолжали рости далее.

Из наших данных следует, что изменение динамики микротрубочек у края клетки вызвано не просто механическим препятствием, но активным взаимодействием микротрубочки и кортекса. Исходя из полученных данных, можно предложить следующую модель хаотизации микротрубочек в цитопласте с течением времени. Предположим в кортексе, имеется специфический фактор, ответственный за остановку роста микротрубочки у края. Данный фактор пока остается неизвестным, хотя в настоящее время в литературе описаны ряд белков, которые могут влиять на динамику плюс конца вблизи края клетки, например, это белки Clasp (Mimori-Kiyosue et al., 2004), APC (Nathke et al., 1996), ACF7/MACF1 (Kodama et al., 2003) и другие. В присутствии данного деполимеризующего фактора клеточный кортекс является активным деполимеризатором миротрубочек. При предположении, что число сайтов нуклеации на центросоме конечно, отрастающие от центросомы микротрубочки не могут исчерпать весь пул димеров тубулина, потому что, дорастая до кортекса, они не могут расти далее. Ситуация меняется, когда цитопласт теряет деполимеризующий фактор. В этом случае микротрубочки могут расти и после достижения ими кортекса, меняя направление своего роста. Теперь они конкурируют между собой за димеры тубулина, и преимущество получают случайно отобранные более длинные микротрубочки, у которых меньше шансов деполимеризоваться полностью при катастрофе. Данная ситуация как раз происходит в системе in vitro (Kirschner and Mitchison, 1986): средняя длина микротрубочек увеличивается по мере инкубации.

В литературе имеются данные, что взаимодействие микротрубочки с клеточным кортексом может быть предметом регуляции. Так было показано, что Wnt сигнальный каскад может ингибировать деполимеризацию микротрубочек у кортекса в растущем аксоне и они начинают загибаться обратно, что сильно затрудняет дальнейший рост аксона (Purro et al., 2008). В эхом случае при запускании Wnt каскада происходит потеря белка АРС с плюс конца микротрубочки (Purro et al., 2008).

Интересные данные, полученные при исследовании цитопластов, относятся к механизму центрирования центросом. Хотя микротрубочки в стареющих цитопластах часто растут параллельно кортексу, и приложенные к ним тянущие усилия минус-концевого динеинового мотора, закрепленные на кортексе, не могут прямо влиять на положение центросомы, центросома в последних находится вблизи центроида. Это может подтверждать модель центрирования, которая говорит, что центровкой центросомы занимаются динеиновые моторы, закрепленные по всей цитоплазме, а не только на краю клетки (Valee and Stehman, 2005). Действительно, такая модель должна работать в нашей системе с внешне хаотическими микротрубочками, поскольку при нуклеации микротрубочки на центросоме она сначала растет до периферии, образуя радиальный участок своей длины, а затем только загибается и продолжает свой рост, но силы, приложенные ко второму участку длины микротрубочки, уже играют второстепенную роль в центровке, так как они уже не «тянут» саму центросому.

В цитопластах, полученных из клеток BSC-1 и HeLa, возможно формирование бесцентросомной радиальной сети микротрубочек. В клетках HeLa подобный механизм играет, по-видимому, основную роль из-за низкой активности самой центросомы, что выявляется после деполимеризации микротрубочек с последующим восстановлением. В результате мы можем наблюдать в основном свободные микротрубочки в клетках HeLa по сравнению с выраженной центросомной звездой микротрубочек в BSC-1. Для формирования бесцентросомной системы микротрубочек также, по-видимому, необходимо участие динеиновых комплексов. При ингибировании функции динеина при сверхпродукции фрагмента СС1 белка pl50Glued радиальная система микротрубочек разрушается, как у клеток Vero, где эта система организована центросомой, так и у клеток HeLa, которые образуют ее и без участия центросомы и у бесцентросомных цитопластов BSC-1. Это может говорить о том, что функция динеина важна для построения бесцентросомной радиальной системы микротрубочек. Следовательно, для исследования более детального механизма образования радиальной системы микротрубочек необходимо определить возможные органеллы клетки, которые принимают участие в формировании радиальной системы микротрубочек без участия центросомы.

Возможно, данной функцией обладают органеллы везикулярного транспорта, которые тесно связаны с микротрубочковым цитоскелетом. Причем мы обратили внимание на ранний везикулярный транспорт — из эндоплазматического ретикулума в аппарат Гольджи и обратно, так как прямое его направление идет в направлении центра.

60 клетки, где локализован аппарат Гольджи к минус концам микротрубочек, за что как раз ответственны динеиновые моторы, необходимые для построения бесцентросомной системы микротрубочек. Следовательно, отпочковавшаяся от ERES везикула должна нести на себе динеиновые моторы, чтобы быть доставлена к аппарату Гольджи. Нами было предположено, что данный сегмент транспорта имеет постоянную динеиновую активность, которая, возможно, может быть движущей силой и организации самих микротрубочек.

Чтобы проверить настоящую гипотезу, необходимо заингибировать прохождение транспорта ЭР-аппарат Гольджи и посмотреть, как это отразится на системе бесцентросомных микротрубочек. Предполагалось, что формирование бесцентросомной радиальной сети микротрубочек идет за счет образования из диспергированного состояния компактной структуры аппарата Гольджи после отмывки нокодазола (Malikov et al., 2005). Также аппарат Гольджи является внецентросомным нуклеатором микротрубочек (Efimov et al., 2007), что впрочем, и было подтверждено также в нашей работе, так как у цитопластов с отсутствующей явной центросомной нуклеацией микротрубочек, последние все равно нуклеировались в центральной области, которую занимает как раз аппарат Гольджи.

Роль аппарата Гольджи легко проверить действием брефелдина А, который полностью его диспергирует (Lippincott-Scwartz et al., 1990). В нашей работе брефелдин не препятствовал возникновению радиальной системы микротрубочек, то есть она собиралась в отсутствие аппарата Гольджи. Это казалось удивительным, поскольку остальные органеллы системы везикулярного транспорта не занимают в клетке четко выраженной центральной позиции, что казалось бы необходимым для образования микротрубочко-организующего центра.

В отсутствие COPI зависимого транспорта, заингибированого брефелдином, COPII-зависимый транспорт происходит нормально, и промежуточный компартмент ERGIC сохраняется. Сохраняется и ERES, причем различия ERES и ERGIC в настоящее время признаются не всеми группами, работающими в этой области. Для обеих органелл показано возможность связывания с динеин-динактиновым комплексом. Роль этих органелл в радиальной организации микротрубочек, тем не менее, считалась сомнительной, поскольку они распределены в виде везикулярных структур по всей клетке, кроме того, не являются подвижными органеллами.

Чтобы более точно описать распределение данных органелл в цитопластах мы исследовали их положение в цитоплазме и показали, что данные органеллы хотя и не образуют компактной структуры, как аппарат Гольджи, располагаются в цитоплазме градиентно тоесть имеют тенденцию скапливаться в центральной области цитопласта.

Стоит отметить, что в теоретической модели другими авторами показано, что возможно спонтанное образование радиальной системы микротрубочек при возможности их тредмилинга (Maly and Borisy, 2002), а также показана возможность самоорганизации микротрубочек с помощью минус-концевых моторов в радиальноподобную систему. Ярким примером самоорганизации системы микротрубочек является организация веретена деления без центросомы в митотических экстрактах яиц (Chakravarty et al., 2004). Поэтому мы решили проверить экспериментально, являются ли ERES и ERGIC организаторами системы микротрубочек в бесцентросомных цитопластах.

Мы обнаружили, что при действии окадаевой кислоты, которая является ингибитором экспорта белка из ЭР в СОРИ везикулы (Pryde et al., 1998), эффективно блокируется формирование радиальной сети микротрубочек в цитопластах без центросомы. Следовательно, данный сегмент аппарата транспорта может принимать участие в организации системы микротрубочек. Следует отметить, что сама окадаевая кислота является ингибитором двух основных протеинфосфатаз: РР2А и, в <-меныпей степени, РР1 (Bialojan and Takai, 1988). При этом существуют данные, указывающие на то, что РР1 регулирует динеин-зависимое формирование сети ЭР в системе in vitro. При ее ингибировании окадаевой кислотой существенно повышается двигательная активность мембран ЭР (Allan, 1995). Так что, возможно, действие окадаевой кислоты на организацию системы микротрубочек основано на каком-то другом механизме.

Более специфического ингибирования COPII-зависимого транспорта можно добиться с помощью доминантно-негативного мутанта малой ГТФ-азы Sarla[T39N]- Мы синтезировали в клетках эту мутантную ГТФазу и показали, что данное воздействие блокировало образование радиальной системы микротрубочек без центросомы.

Следует еще раз вернуться к возможной роли аппарата Гольджи. При его разрушении брефелдином, А нуклеирующие микротрубочки факторы могут переходить в компартменты раннего везикулярного транспорта — в ERES (Rivero et al., 2009). Следовательно возникает вопрос, а не является ли это причиной того, что мы не наблюдали ингибирующего эффекта брефельдина А. Для поиска возможного ответа на данный вопрос стоит обратить внимание на существенное различие в морфологии аппарата Гольджи, компактная структура которого занимает центральное положение, тогда как ERES и ERGIC распределены градиентно, однако морфология системы микротрубочек не отличима в цитопластах с диспергированным брефельдином, А аппаратом Гольджи, от контрольных, что может свидетельствовать не в пользу данного.

62 утверждения. Хотя роль перераспределения белков из аппарата Гольджи в структуры раннего везикулярного транспорта полностью исключать нельзя.

В этой связи нам было очень интересно более подробно разобраться с действием другого мутанта малой ГТФ-азы Sari, а — конститутивно-активного. При действии данного мутанта ингибируется отпочковывание COPII-окаймленных везикул, но при этом окаймление как бы остается замороженным на мембранах ERES, и они образуют скопления в центре клетки (Ward et al., 2001). Также белки-маркеры ERGIC и некоторые маркеры аппарата Гольджи, а именно гольджины — белки, образующие внешний каркас аппарата Гольджи, колокализуются с данными скоплениями. Из-за этого вначале было сделано предположение, что скопления ERES есть остаточная часть аппарата Гольджи, которая не чувствительна к действию Sarla[H79G] (Seemann et al., 2000). Однако, данный конгломерат устойчив к действию брефельдина А, более того, если в преинкубированные с BFA клетки инъецировать рекомбинантную Sar[H79G], то образующиеся везикулярные структуры по всей клетке сходятся в центральную область, независимо от того, был или нет отмыт брефельдин A (Ward et al., 2001). Можно также заметить, что другими авторами было показана возможность прямой сборки диспергированных нокодазолом цистерн аппарата Гольджи путем их кластеризации в достаточно специализированной культуры клеток сетчатки глаза (Miller et al., 2009).

Так как при сверхэкспрессии Sar[H79G] отсутствуют другие органеллы раннего везикулярного транспорта, кроме ERES/ERGIC (Ward et al., 2001), по-видимому, сборка скоплений ERES/ERGIC является основной движущей силой образования радиальной системы микротрубочек без участия центросомы. Поняв молекулярные механизмы сборки данных скоплений, впоследствии их можно применить для исследования роли в построении бесцентросомной радиальной системы микротрубочек.

Нами было показано, что образование такого конгломерата зависит от присутствия микротрубочек, и при их деполимеризации можно наблюдать разделение конгломерата на отдельные части. При этом само диспергирование в системе везикулярного транспорта может происходить по-разному. Диспергирование аппарата Гольджи происходит не прямо, а в результате рециркуляции его компонентов, через эндоплазматический ретикулум, то есть отдельные мембраны аппарата Гольджи формируются на периферии de novo. Противоположный пример — это прямое схождение-расхождение везикулярных структур, к примеру, транспорт пигментных гранул в меланоцитах Xenopus, которое как раз может организовывать микротрубочки (Malikov et al., 2005).

В случеае кластера ERES при сверхэкспресси Sar[H79G] мы имеем дело как раз с прямым диспергированием и агрегированием, как нами было показано при прижизненном.

63 наблюдении. Тогда следует ожидать, что образование такого кластера связано с действием минус-концевого мотора динеина, который вместе со своим кофактором динактином должен привлекаться на эти мембраны для их перемещения. Информация о связывании и регулировании динеина при сверхэкспресси Sar[H79G] и образование кластера ERES является, скорее всего, ключевой для понимания механизма образования радиальной системы микротрубочек у бесцентросомных цитопластов, так как формирование последней зависит от активности динеина и ингибируется при сверхэкспрессии р150-СС1.

В работах других авторов было показано ранее, что С-концевой фрагмент белка pl50-Glued (СТ-р150) может связываться с белком СОРИ окаймления Sec23 (Watson et al., 2005), тем самым возможно привлечение динеина к окаймленной везикуле. Мы решили проверить, будет ли сверхэкспрессия данного фрагмента ингибирующе действововать на образование кластера ERES. Для этого клетки были котрансфицированы GFP-CT-pl50 и HA-Sar[H79G], Оказалось, что сверхэкспрессия СТ-р150 не влияет на образование кластера, причем сам С-концевой фрагмент достаточно хорошо колокализуется с образующимся скоплением ERES. В качестве отрицательного контроля нами был выбран междоменный участок белка р150 (MD-pl50), который также не влиял на образование кластера, но, что удивительно, также колокализовался со скоплением. Нами было предположено, что этот участок также может принимать участие в направление динеин-динактинового комплекса к ERES, и тем самым это объясняло бы отсутствие эффекта при сверхэкспрессии одного только С-концевого фрагмента. Для проверки данного предположения нами был коэкспрессирован участок белка р150, содержащий оба этих фрагмента (MD-CT), однако результат был таким же, как и экспрессии отдельно СТ и MD.

В качестве положительного контроля мы использовали СС1 фрагмент белка р150, который ингибирующе действует на динеин-динактиновый комплекс (Quentine et al., 1999). В этих условиях кластер не формировался, и можно было наблюдать диспергированные везикулярные структуры. Такой же эффект оказывал фрагмент белка р150, у которого отсутствовал N-концевой участок (pl50-delta head), однако имелся СС1 фрагмент. Отдельно же экспрессированый N-концевой участок не оказывал никакого влияния на образование кластера.

Сама колокализация с кластерами СТ и MD фрагментов может быть следствием двух причин: либо это опосредуется связыванием с Sec23, либо же, чего нельзя исключать, это есть последствие димеризации данного фрагмента с полноразмерным pi 50, присутствующим в комплексе (Shroer, 2004). Известно, что участки СТ и MD входят в часть молекулы pl50Glued, погруженную в «плечо» динактина, т. е. в комплекс Arpl-филамента и динамитина. Возможно, что фрагменты MD-CT связываются с «плечом».

64 динактина, содержащим также и полноразмерную молекулу pl50Glued, что делает комплекс функционально полноценным. Также нельзя исключать прямое взаимодействие Sarla[H79G] с моторными белками. Данные о таком взаимодействии были получены в экспериментах с пермеабилизованными клетками. У этих клеток вымывалось большинство цитоплазматических белков, но оставались внутренние мебраны. При добавлении Sarla[H79G] формировались мембранные тубулы, причем интересно, что тубулы не формировались, если перед пермеабилизацией микротрубочки у таких клеток были разрушены (Aridor et al., 2001).

Очень интересным примером, возможно, подтверждающим, что у ERES могут иметься функции в клетке, связанные с микротрубочковым цитоскелетом, являются последние данные об образовании аксона, формирование которого зависит от индукции полимеризации микротрубочек в нейрите с последующей их там стабилизацией (Poulain and Sobel, 2009). На ранних стадиях формирования аксона происходит специфическое накопление ERES в формирующимся отростке, и если заингибировать СОРИ активность ERES путем сверхэкспрессии мутанта Sarla[T39N] то формирование аксона сильно затруднено (Aridor and Kenneth, 2009). выводы.

1. В стареющих цитопластах клеток Vero хаотизация системы микротрубочек происходит без потери активности центросомы, а наиболее вероятной причиной потери радиальности сети микротрубочек является утрата способности микротрубочки останавливать свой рост у клеточного кортекса.

2. Центральное положение центросомы определяют силы, приложенные к микротрубочкам по их длине, а не только на концах.

3. Аппарат Гольджи и COPI-зависимый транспорт не участвуют в формировании радиальной системы микротрубочек в бесцентросомных цитопластах.

4. Инактивация COPII-зависимого транспорта блокирует образование радиальной системы микротрубочек в бесцентросомных цитопластах. Наиболее вероятными клеточными компарментами, организующими радиальную систему микротрубочек в бесцентросомных цитопластах, являются ERES (места выхода везикул из эндоплазматического ретикулума) и ERGIC (промежуточный компартмент между эндоплазматическим ретикулумом и аппаратом Гольджи).

5. Образование в клетках плотных скоплений ERES при действии конститутивно-активной формы ГТФазы Sarla[H79G] зависит от присутствия микротрубочек. При деполимеризации микротрубочек происходит прямое диспергирование исходного скопления из центральной области по всей клетке.

6. Сборка в центральной части клетки плотных скоплений ERES при действии конститутивно-активной формы ГТФазы Sarla[H79G] зависит от активности динеин-динактинового комплекса.

Бураков А., Надеждина Е. Динеин и динактин как организаторы системы клеточных микротрубочек // Онтогенез. 2006. 37. С. 1−17.

Жаппарова О. Роль динеин-динактинового комплекса в организации системы микротрубочек в интерфазных клетках // Канд. диссертация. 2008. МГУ. Москва.

Смурова К., Алиева И., Воробьев И. Динамика восстановления цитоплазматических микротрубочек после их разрушения нокодазолом в клетках культуры Vero // Биологические мембраны. 2002. 19. С. 472−482.

Allan V. Protein phosphatase 1 regulates the cytoplasmic dynein-driven formation of endoplasmic reticulum networks in vitro//J. Cell. Biol. 1995. 128. P. 879−891.

Allan V., Vale R. Movement of membrane tubules along microtubules in vitro: evidence for specialised sites of motor attachment Hi. Cell Sci. 1994. V. 107. P. 1885−1897.

Altan-Bonnet N., Sougrat R., Lippincott-Schwartz J. Molecular basis for Golgi maintenance and biogenesis // Curr. Opin. Cell Biol. 2004. V. 16. P. 364−372.

Andrade J, Zhao H, Titus B, Timm Pearce S, Barroso M. The EF-hand Ca2±binding protein p22 plays a role in microtubule and endoplasmic reticulum organization and dynamics with distinct Ca2±binding requirements//Mol. Biol. Cell. 2004. 15. P. 481−496.

Appenzeller C., Andersson H., Kappeler F., Hauri HP. The lectin ERGIC-53 is a cargo transport receptor for glycoproteins //Nat Cell Biol. 1999. 6. P. 330−334.

Appenzeller-Herzog C., Hauri HP. The ER-Golgi intermediate compartment [ERGIC]: in search of its identity and function // J. Cell Sci. // 2006. 119. P. 2173−2183.

Aridor M., Kenneth N.F. Selective Targeting of ER Exit Sites Supports Axon Development doi:10.1111/j.1600−0854.2009.

Askham J., Vaughan K., Goodson H., Morrison E. Evidence that an interaction between EB1 and pl50Glued is required for the formation and maintenance of a radial microtubule array anchored at the centrosome // Mol. Cell Biol. 2002. 13. P. 3627−3645.

Bartolini F and Gundersen G. Generation of noncentrosomal microtubule arrays // J. Cell Sci. 2006. 119. P. 4155−4163.

Baas, P. W., Deitch, J. S., Black, M. M. and Banker, G. A. Polarity orientation of microtubules in hippocampal neurons: uniformity in the axon and nonuniformity in the dendrite // PNAS 1988. 85. P. 8335−8339.

Ben-Tekaya H., Miura K., Pepperkok R., Hauri HP. Live imaging of bi-directional traffic from the ERGIC // J. Cell Sci. 2004. 118. P. 357−367.

Bialojan D., Takai A. Inhibitory effect of a marine sponge toxin, okadaic acid, on protein phosphatases // Biochem J. 1998. 256. P. 283−290.

Bouckson-Castaing V., Moudjou M., Ferguson D., Mucklow S., Belkaid Y., Milon G., Crocker P. Molecular characterisation of ninein, a new coiled-coil protein of the centrosome // J. Cell Sci. 1996. 109. P. 179−190.

Bre M., Kreis Т., Karsenti E. Control of microtubule nucleation and stability in Madin-Darby canine kidney cells: the occurrence of noncentrosomal, stable detyrosinated microtubules // J. Cell Biol. 1987. 105. P. 1283−1296.

Burakov A., Nadezdina E., Slepchenko В., Rodionov V. Centrosome positioning in interphase cells // J. Cell Biol. 2003. 162. P. 963−969.

Burkhard J., Echeverri C., Nilson Т., Vallee R. Overexpression of the dynamitim (p50) subunit of the dynactin complex disrupts dynein-dependent maintenance of membrane organelle distribution//J. Cell Biol. 1997. 139. P. 469−484.

Cai H., Yu S., Menon S., Cai Y., Lazarova D., Fu C., Reinisch K., Hay C., Ferro-Novick S. TRAPPI tethers COPII vesicles by binding the coat subunit Sec23 //Nature. 2007. 445. P. 941 944.

Campellone KG., Webb NJ., Znameroski EA., Welch MD. WHAMM is an Arp2/3 complex activator that binds microtubules and functions in ER to Golgi transport // Cell. 2008. 134. P. 148−161.

Carlier, MF., Hill TL., Chen, YD. Interference of GTP hydrolysis in the mechanism of microtubule assembly: an experimental study // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. 87. P. 771 -775.

Chausovsky A, Bershadsky AD, Borisy GG. Cadherin-mediated regulation of microtubule dynamics //Nat. Cell Biol. 2000. 2. P. 797−804.

Chabin-Brion K., Marceiller J., Perez F., Settegrana C., Drechou A., Durand G., Pous C. The Golgi complex is a microtubule-organizing organelle //Mol. Biol. Cell. 2001. 12. P. 2047;2060.

Chakravarty A, Howard L, Compton DA A mechanistic model for the organization of microtubule asters by motor and non-motor proteins in a mammalian mitotic extract // Mol Biol Cell. 2004. 15. P. 2116−2132.

Chen JL., Fucini RV., Lacomis L., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Stamnes M. Coatomer-bound Cdc42 regulates dynein recruitment to COPI vesicles // J. Cell. Biol. 2005. 169. P. 383−389.

Cole N., Ellenberg J., Song J., DiEuliis D., Lippincott-Schwartz J. Retrograde transport of Golgi-localised proteins to the ER // J. Cell. Biol. 1996. 140. P. 1−15.

Cole N., Sciaky N., Marotta A., Song J., Lippincott-Schwartz J. Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites //Moll. Biol. Cell. 1996. 7. P. 631−650.

Cytrynbaum E., Rodionov V, Mogilner A. Computational model of dynein-dependent self-organization of microtubule asters // J. Cell Biol. 2004. 117. P. 1381−1397.

Delgehyr N., Silllibourne J., Bornens M. Microtubule nucleation and anchoring at the centrosome are independent processes linked by ninein function // J. Cell Sci. 2005. 118. P. 1565−1575.

Dehmelt L., Halpain S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins // Genome Biol. 2005. 6(1). P. 204.

Dictenberg J., Zimmerman W., Sparks C., Young A., Yidair C., Zheng Y., Carrington W., Fay F., Doxey S. Pericentric and y-tubulin form a protein complex and are organized into a novel lattice at the centrosome // J. Cell Biol. 1998. 141. P. 163−174.

Dixit R., Ross J.5 Goldman Y., Holzbaur E. Differental regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau // Science. 2008. 319. P. 1086−1089.

Dogterom M., Yurke B. Measurement of the forse-velocity relation for growing microtubules // Science. 1997. 278. P. 856−860.

Drewes G., Ebneth A., Mandelkow E. MAPs, MAPKs and microtubule dynamics // Trends Biochem. Sci. 1998. 23(8). P. 307−311.

Dujardin D., Barnhart L., Stehman S., Gomes E., Gundersen G., Richard V. A role for cytoplasmic dynein and LIS 1 in directed cell movement // J. Cell Biol. 2003. 163. P.1205−1211.

Efimov A., Kharitonov A., Efimova N., Loncarek J., Miller PM., Andreyeva N., Gleeson P., Galjart N., Maia AR., McLeod IX., Yates JR., Maiato H., Khodjakov A., Akhmanova A., Kaverina I. Asymmetric CLASP-dependent nucleation of noncentrosomal microtubules at the trans-Golgi network //Dev. Cell. 2007. 12. P. 917−930.

Fumoto K., Hoogenraad C., Kikuchi A. GSK-3p-regulated interaction of BICD with dynein is involved in microtubule anchorage at centrosome // EMBO J. 2006. 25. P. 5670−5682.

Gilbert Т., Le Bivic A., Quaroni A., Rodrigues-Boulan E. (1991). Microtubules organization and its involvement in the biogenetic pathways of plasma membrane proteins in Caco-2 interstinal ehithelial cells. J. Cell Biol. 113. P. 275−288.

Gorgidze L., Vorobjev I. (1995). Centrosome and microtubules behavior in the cytoplasts. J. Submicrosc. Cytol. Pathol. 27:381−389.

Grigoriev I., Borisy G., Vorobjev I. Regulation of Microtubule Dynamics in 3T3 Fibroblasts by Rho Family GTPases // Cell Motility and the Cytoskeleton. 2006. 63. P. 29−40.

Guo J., Yang Z., Song W., Chen Q., Wang F., Zhang Q., Zhu X. Nudel contributes to microtubule anchoring at the mother centriole and is involved in both dynein-dependent andindependent centrosomal protein assembly // Mol. Bol. Cell. 2006. 17. P. 680−689.

Gupta V., Palmer K., Spence P., Hudson A., Stephens DJ. Kinesin-1 [uKHC/KIF5B] is Required for Bidirectional Motility of ER Exit Sites and Efficient ER-to-Golgi Transport // Traffic. 2008 9. P. 1850−1866.

Hagnia M., Cavalli V., Shah S., Schimmelpfeng K., Brusch R., Yang G., Herrera C., Pilling A., Goldstein L. Dynactin is required for coordinated bidirectional motility, but not for dynein membrane attachment//Mol. Biol. Cell. 2007. 18. P. 2081;2089.

Halpain S., Dehmelt 1. The MAPI family of microtubule-associated proteins // Genome Biol. 2006. 7(6). P. 224.

Hammond AT., Glick BS. Dynamics of Transitional Endoplasmic Reticulum Sites in Vertebrate Cells // Mol. Biol. Cell. 2000. 11. P. 3013−3030.

Hauri H.P., Kappelel F., Andersson H., Appenzeller C. ERGIC-53 and traffic in the secretory pathway//J. Cell. Sci. 2000. 113. P. 587−596.

Hauri H.P., Schweizer A. The ER-Golgi membrane system: compartment organization and protein traffic // In Handbook of Physiology: Cell Physiology (ed. J.F. Hoffman and J.D. Jamieson). 1997. section 14, P. 605−647. Oxpord University Press, Oxford.

Heinzer S., Worz S., Kalla C., Rolir K., Weiss MJ. A model for the self-organization of exit sites in the endoplasmic reticulum // Cell Sci. 2008. 121. P.55−64.

Hirokawa N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport// Science. 1998. 279. P. 519−27.

Hirokawa N., Noda Y., Okada Y. Kinesin and dynein superfamily proteins in organelle transport and cell division // Curr. Opin. Cell Biol. 1998. 10. P. 60−73.

Holmfeldt P, Sellin ME, Gullberg M. Predominant regulators of tubulin monomer-polymer partitioning and their implication for cell polarization. Cell Mol Life Sci. 2009 66(20):3263−76.

Hughes H., Stephens DJ. Assembly, organization, and function of the COPII coat // Histochem. Cell. Biol. 2008. 129. P. 129−151.

Janson M., Mathilde E., Dogterom M. Dynamic instability of microtubules is regulated by forse n// J. Cell Biol. 2003. 161. P. 1029−1034.

Kahana A., Kenan G., Feingold M., Elbaum M., and Granek R. Active transport on disordered microtubule networks: The generalized random velocity model // Phys. Rev. E. 2008. 78. P. 51 912.

Kamal A., Goldstein LS. Connecting vesicle transport to the cytoskeleton // Curr. Opin. Cell. Biol. 2000. 12. P. 503−508.

Karsenti E., Kobayashi S., Mitchison Т., Kirschner M. Role of the centrosome in organizing the interphase microtubule array: propertie of cytoplasts containing or lacking centrosomes // J. Cell Biol. 1984. 98. P. 1763−1776.

Keating Т., Borisy G. Immunostructural evidence for the template mechanism of microtubule nucleation // Nat. Cell Biol. 2000. 2. P. 352−357.

Kim H., Ling S., Rogers G., Kural C., Selvin P., Rogers S., Gelfand V. Microtubule binding by dynactin is required for microtubule organization but not cargo transport // J. Cell Biol. 2007. 176. P. 641−651.

Kim S., Lee K., Rhee K. NEK7 is a centrosomal kinase critical for microtubule nucleation // BBRC. 2007. 360. P. 56−62.

King S., Brown C., Maier K., Quintyne N., Schroer T. Analysis of the dynein-dynactin interaction in vitro and in vivo // Mol. Biol. Cell. 2003. 14. P. 5089−5097.

King S., Schroer T. Dynactin increases the processivity of the cytoplasmic dynein motor // Nat. Cell Biol. 2000. 2. P. 20−24.

Kirschner MW, Mitchison T. Microtubule dynamics // Nature. 1986. 324. P. 621.

Klumperman J., Schweizer A., Clausen H., Tang BL., Hong W., Oorschot V., Hauri HP. The recycling pathway of protein ERGIC-53 and dynamics of the ER-Golgi intermediate compartment//J. Cell Sci. 1998. 111. P. 3411−3425.

Kodani A., Kristensen I., Huang L., Siitterlin C. GM130-dependent control of Cdc42 activity at the Golgi regulates centrosome organization // Mol. Biol. Cell. 2009. 20. P. 1192−1200.

Komarova Y., Vorojev I., Borisy G. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary // J. Cell Sci. 2002. 115. P. 3527−3539.

Laan L., Husson J., van Duijin M., Vale R., Rech-Peterson SL., Dogterom M. Cortical dynein can capture and pull on dynamic microtubule ends in vitro // 48th ASCB San-Francisco. 2008. P.1545.

La Terra S., English CN., Hergert P., McEwen BF., Sluder G., Khodjakov A. The de novo centriole assemble pathway in HeLa cells: cell cycle progression an centriole assemble/maturation // J. Cell. Biol. 2005. 168 P. 713−22.

Lee M., Gergely F., Jeffers K., Peak-Chew S., Raff J. Msps/XMAP215 interacts with the centrosomal protein D-TACC to regulate microtubule behaviour // Nat. Cell Biol. 2001. 3. P. 643−649.

Lechter Т., Fuchs E. Desmoplakin: an unexpected regulator of microtubule organisation in the epidermis. J. Cell Biol. 2007. 176. P. 147−54.

Li S., Finley J., Liu Z., Qiu S., Chen H., Luan C., Carson M., Tsao J., Johnson D., Lin G. Zhao J. Thomas W., Nagy L., Sha В., DeLucas L., Wang В., Luo M. Crystal structure of the cytoskeleton-associated protein glycine-rich (CAP-Gly) domain // J. Biol. Chem. 2002. 277. P. 48 596−48 601.

Lippincott-Schwartz J., Yuan L., Bonifacino J., Klausner R. Rapid redistribution of Golgi proteins into the endoplasmic reticulum in cells treated with brefeldin A: evidence for membrane cycling from Golgi to ER// Cell. 1989. 60. P.821−836.

Lippincott-Schwartz J., Donaldson J., Schweizer A., Berger E., Hauri H.P., Yuan L.C., Klausner R. Microtubule-dependent retrograde transport of proteins into the ER in the presence of brefeldin A suggests an ER recycling pathway // Cell. 1990. 60. P. 821−836.

Ma S., Trivinos-Lagos L., Graf R., Chrisholm R. Dynein intermediate chain mediated dynein-dynactin interaction is required for interphase microtubule organization and centrosome replication and separation in Dictiostelium // J. Cell Biol. 1999. 147. P. 1261−1273.

Magnani E., Fan J., Gasparini L., Golding M., Willims M., Schiavo G., Goedert M., Amos L., Spillantini M. Interaction of tau protein with the dynactin complex // EMBO J. 2007. 26. P. 4546−4554.

Malikov V., Cytrynbaum E., Kashina A., Mogilner A., Rodionov V. Centring of a radial microtubule array by translocation along microtubules spontaneously nucleated in the cytoplasm //Nat. Cell. Biol. 2005. 7. P. 1113−1118.

Malikov V., Kashina A., Rodionov V. Cytoplasmic dynein nucleates microtubules to organize them into radial arrays in vivo // Mol. Biol. Cell. 2004. 15. P. 2742−2749.

Mallik R., Gross S. Molecular motors: stratagies to get along // Curr. Biol. 2004. 14. P. 971 982.

Maly I., Borisy G. Self-organisation of treadmilling microtubules into a polar array // Trends Cell Biol 2002.12. P: 462−465.

Maniotis A., Schliwa M. Mcrosugical removal of centrosomes blocks cell reproduction and centriole generation in BSC-1 cells // Cell. 1991. 67. P. 495−504.

Mandelkow E., Schweers O., Drewes G., Biernat J., Gustke N., Trinczek В., Mandelkow E. Structure, microtubule interaction, and phosphorylation of tau potein // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1996. 17(777). P. 96−106.

McGrail M., Gepner J., Silvanovich A., Ludmann S., Serr M., Hays T. Regulation of cytoplasmic dynein function in vivo by the Drosophila Glued complex // J. Cell Biol. 1995. 131. P. 411−425.

Meads Т., Schroer T. Polarity and nucleation of microtubules in polarized epithelial cells // Cell. Motil. Cytoskeleton. 1995. 32. P.273−288.

Melkonian K., Maier K., Godfrey J., Rodgers M., Schroer T. Mechanism of dynamitin-mediated disruption of dynactin // J. Biol. Chem. 2007. 282. P. 19 355−19 364.

Merdes A., Heald R., Samejima K., Earnshaw W., Cleveland D. Formation of spindle poles by dynein/dynactin-dependent transport ofNuMA // J. Cell Biol. 2000. 149. P. 851−862.

Merdes A., Ramyar K., Vechio J., Cleveland D. A complex of NuMA and cytoplasmic dynein is essential for mitotic spindle assembly // Cell. 1996. 87. P. 447−458.

Meusser В., Hirsch C., Jarosch E., Sommer T. ERAD: the long road to destruction // Nat. Cell Biol. 2005. 7. P. 766−772.

Miller PM, Folkmann AW, Maia AR, EfimovaN, Eflmov A, Kaverina I. Golgi-derived CLASP-dependent microtubules control Golgi organization and polarized trafficking in motile cells //Nat Cell Biol. 2009. 11. P. 1069−1080.

Mimori-Kiyosue Y., Grigoriev I., Lansbergen G., Sasaki H., Matsui C., Severin F., Galjart N., Grosveld F., Vorobjev I., Tsukita S., Akhmanova A. CLASP 1 and CLASP2 bind EB1 and regulate microtubule plus-end dynamics at the cell cortex // J. Cell Biol. 2005. 168. P. 141−153.

Mimori-Kiyosue Y., Tsukita S. «Search-and-capture» of microtubules through plus-end-binding proteins (+TIPs) // J. Biochem. 2003. 134. P. 321−326.

Minin A. Dispersal of Golgi apparatus in nocodazol-treated fibroblasts is a kinesin driven process //J. Cell Sci. 1997. 110. P. 24 595−2505.

Mogensen M., Malik A., Piel M., Bouckson-Castaing V., Bornens M. Microtubule minus-end anchorage at centrosomal and non-centrosomal sites: the role of ninein // J. Cell Sci. 2000. 113. P.3013−3023.

Moritz M., Braunfeld M., Sedat J., Alberts В., Agard D. Microtubule nucleation by gamma-tubulin-containing rings in the centrosome //Nature. 1995. 378. P. 638−640.

Moskalewski S., Thyberg J. On the role of the nucleus in the structural organization of the cell: dispersion and rearrangement of the Golgi complex in cytoplasts treated with antimicrotubular drugs //J. Submicrosc. Cytol. Pathol. 1988. 20. P. 305−316.

Musch A. Microtubule Organization and Function in Epithelial Cells // Traffic. 2004. 5. P. 19.

Nathke I, Adams CL, Polakis P, Sellin JH, Nelson WJ. The adenomatous polyposis coli tumor suppressor protein localizes to plasma membrane sites involved in active cell migration // J Cell. Biol 134. P. 165−179.

Niu TK., Pfeifer A., Lippincott-Schwartz J., Jackson C. Dynamics of GBF1, a brefeldin A-sensitive Arfl exchange factor at the Golgi // Mol. Biol. Cell. 2005. 16. P. 1213−1222.

Ohta Т., Essner R., Ryu J., Palazzo R., Uetake Y., Kuriyama R. Characterization of Сер 135, a novel coiled-coil centrosomal protein involved in microtubule organization in mammalian cells //J. Cell Biol. 2002. 156. P. 87−99.

Palmer KJ, Hughes H, Stephens DJ. Specificity of cytoplasmic dynein subunits in discrete membrane-trafficking steps // Mol Biol Cell. 2009. 20. P. 2885−2899.

Pepperkok R., Bre M., Davoust J., Kreis T. Microtubules are stabilized in confluent epithelial cellsbut not in fibroblasts // J. Cell. Biol. 1990. 111. P. 3003−3012.

Perez-Ferreiro C., Vernos I., Correas I. Protein 4.1R regulates interphase microtubule organization at the centrosome // J. Cell Sci. 2004. 117. P. 6197−6206.

Pfister KK, Shah PR, Hummerich H, Russ A, Cotton J, Annuar AA, King SM, Fisher EM. Genetic analysis of the cytoplasmic dynein subunit families. PLoS Genet. 2006 Jan-2(l):el.

Piel M., Meyer P., Khodjakov A., Rieder C., Bornens M. The respective contributions of the mother and daughter centrosome activity and behaviour in vertebrate cells // J. Cell Biol. 2000. 149. P. 317−329.

Piperno G., LeDizet M., Chang X. Microtubules containing acetylated a-tubulin in mammalian cells in culture // J. Cell Biol. 1987. 104. P. 289−302.

Pizon V, Gerbal F, Diaz CC, Karsenti E. Microtubule-dependent transport and organization of sarcomeric myosin during skeletal muscle differentiation EM BO J. 2005 24. P. 3781−3792.

Poulain, F.E., Sobel, A., The microtubule network and neuronal morphogenesis: Dynamic and coordinatedorchestration through multiple players, Mol. Cell. Neurosci. (2009). doi: 10.1016/j .mcn.2009.07.012.

Presley J., Smith C., Hirschberg K., Miller C., Cole N., Zaal K., Lippincott-Schwartz J. Golgi membrane dynamics //Mol. Biol. Cell. 1998. 9. P. 1617−1626.

Pryde J., Farmaki Т., Lucocq J. Okadaic acid induces selective arrest of protein transport in rough endoplasmic reticulum and prevents export into COPII-coated structures // Mol. Cell Biol. 1998. 18. P. 1125−1135.

Purro SA., Ciani L., Hoyos-Flight M., Stamatakou E., Siomou E., Salinas PC. Wnt Regulates Axon Behavior through Changes in Microtubule Growth Directionality: A New Role for Adenomatous Polyposis Coli // J. Neuroscience. 2008. 28. P. 8644−8654.

Quintyne N., Gill S., Eckley D., Crego C., Compton D., Schroer T. Dynactin is required for microtubule anchoring at centrosomes // J. Cell Biol. 1999. 147. P. 321−334.

Quintyne N., Schroer T. Distinct cell cycle-dependent roles for dynactin and dynein at centrosomes // J. Cell Biol. 2002. 159. P. 245−254.

Reihenmann K., Riehemann, K., Sorg, C. Sequence homologies between four cytoskeleton-associated proteins // Trends Biochem. Sci. 1993. 18. P. 82−83.

Reilein A., Yamada S., Nelson J. Self-organisation of an acentrosomal microtubule network at the basal cortex of polarized epithelial cells // J. Cell. Biol. 2005. 171. P. 845−855.

Rios RM., Sanchis A., Tassin AM., Fedriani C., Bornens M. GMAP-210 recruits gamma-tubulin complexes to cis-Golgi membranes and is required for Golgi ribbon formation // Cell. 2004. 118. P. 323−335.

Rivero S., Cardenas J., Bornens M., Rios RM. Microtubule nucleation at the cis-side of the Golgi apparatus requires AKAP450 and GM130 // EMBO J. 2009. 22. P. 1016−1028.

Rodionov V., Borisy G. Self-centring activity of cytoplasm //Nature. 1997. 386. P. 170−173.

Rodionov V., Nadezhdina E., Borisy G. Centrosomal control of microtubule dynamics // PNAS. 1999. 96. P. 115−120.

Saraste J., Svensson K. Distribution of the intermediate elements operating in ER-to-Golgi transport//J. Cell. Sci. 1991. 100. P. 415−430.

Schroer T. Dynactin//Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2004. 20. P. 759−779.

Sciaky N., Presley J., Smith C., Zaal K., Cole N., Moreira J., Terasaki M., Siggia E., Lippincott-Schwartz J. (1997). Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells. J. Cell Biol. 139. 1137−1155.

Seemann J., Jokitalo E., Pypaert M., Warren G. Matrix proteins can generate the higher order architecture of the Golgi apparatus //Nature 2000. 407. P. 1022−6.

Shelden E., Wadsworth P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific J. Cell Biol. 1993. 120. P. 935 945.

Signor, D. and Scholey, J. M. Microtubule-based transport along axons, dendrites and axonemes //Essays Biochem. 2000. 35, 89−102.

Stephens DJ., Pepperkok R. Imaging of procollagen transport reveals COPIdependent cargo sorting during ER-to-Golgi transport in mammalian cells // J. Cell Sci. 2002. 115. P. 1149−1160.

Storrie В., White J., Rottger S., Stelzer E., Suganuma Т., Nilsson T. Recycling of golgi-resident glycosyltransferases through the ER reveals a novel pathway and provides an explanation for nocodazol-induced golgi scattering // J. Cell. Biol. 1998. 143. P. 1505−1521.

Tirnauer J., Bierer, В. EB1 proteins regulate microtubule dynamics, cell polarity, and chromosome stability // J. Cell Biol. 2000. 149. P.761−766.

Uetake Y., Terada Y., Matuliene J., Kuriyama R. Interaction of Сер 135 with a p50 dynactin subunit in mammalian centrosomes // Cell Mot. Cytoskel. 2004. 58. P. 53−66.

Vallee R., Stehman S. How dynein helps the cell find its center: a servomechanical model // Trends Cell Biol. 2005. 15. P. 288−294.

Vedrenne C., Hauri HP. Morphogenesis of the Endoplasmic Reticulum: Beyond Active Membrane Expansion // Traffic. 2006. V. 7. P 639−646.

Vorobjev I., Malikov V., Rodionov V. Self-organization of a radial microtubule array by dynein-dependent nucleation of microtubules // PNAS. 2001. 98. P. 10 160−10 165.

Vorobjev I., Svitkina Т., Borisy G. Cytoplasmic assembly of microtubules in cultured cells // J. Cell Sci. 1997. 110. P. 2635−2645.

Wakana Y., Takai S., Nakajima K., Tani K., Yamamoto A., Watson P., Stephens DJ., Hauri HP., Tagaya M. Bap31 is an itinerant protein that moves between the peripheral endoplasmic reticulum [ER] and a juxtanuclear compartment related to ER-associated Degradation // Mol. Biol. Cell. 2008. 19. P. 1825−1836.

Wang J., Liu F. Microtubule-associated protein tau in development, degeneration and protection of neurons //Prog. Neurobiol. 2008. 85(2). P. 148−175.

Ward Т., Polishchuk R., Caplan S., Hirschberg K., Lippincott-Schwartz J. Mintenance of Golgi structure and function depends on the integrity of ER export // J. Cell. Biol. 2001. 155. P. 557−570.

Watson DJ., Stephens J. Microtubule plus-end loading of pl50[Glued] is mediated by EB1 and CLIP-170 but is not required for intracellular membrane traffic in mammalian cells // J. Cell Sci. 2006. 119. P. 2758−2767.

Watson P., Forster R., Palmer K., Pepperkok R., Stephens D. Coupling of ER exit to microtubules through direct interaction of COPII with dynactin//Nat. Cell. Biol. 2004. 7. P. 4855.

Watson P., Stephens D. Microtubule plus-end loading of pl50Glued is mediated by EB1 and CLIP-170 but is not required for intracellular membrane traffic in mammalian cells // J. Cell Sci.

2006. 119. P. 2758−2767.

Weisbrich A., Honnappa S., Jaussi R., Okhrimenko O., Frey D., Jelesarov I., Akhmanova A., Steinmetz M. Structure-function relationship of CAP-Gly domains // Nat. Struct. Mol. Biol.

2007. 14. P. 959−967.

Weissman JT., Plutner H., Balch WE. The Mammalian Guanine Nucleotide Exchange Factor mSecl2 is Essential for Activation of the Sari GTPase Directing Endoplasmic Reticulum Export //Traffic. 2001. 2. P. 465−475.

Wendeler MW., Paccaud JP., Hauri HP. Role of Sec24 isoforms in selective export of membrane proteins from the endoplasmic reticulum // EMBO reports. 2007. 8. P. 258−264.

Yan X., Habedanck R., Nigg E. A complex of two centrosomal proteins, CAP350 and FOP, cooperates with EB1 in microtubule anchoring // Mol. Biol. Cell. 2006. 17. P. 634−644.

Young A., Dictenberg J., Purohit A., Tuft R., Doxey S. Cytoplasmic dynein-mediated assembly of pericentrin and y-tubulin onto centrosomes // Mol. Biol. Cell. 2000. 11. P. 20 472 056.

Zheng Y., Wong M., Alberts В., Mitchison T. Nucleation of microtubule assembly by a gamma-tubulin-containing ring complex //Nature. 1995. 378. P. 577−583.