Механизмы дифференцировки миогенных клеток внутренних половых органов женщины в онтогенезе и при реперативной регенерации

Актуальность исследования. Проблема дифференцировки, регенерации и функционирования гладкомышечных клеток (ГМК) остаётся одной из самых актуальных и малоисследованных в медицине и биологии [45, 95, 110, 128, 137, 146, 167, 186]. Несмотря на кажущуюся хорошую изученность гладкомышечной ткани, остаются неизвестными многие аспекты развития и поведения ГМК при различных воздействиях. Актуальность изучения морфо-функциональных характеристик ГМК обусловлено как большим количеством заболеваний связанных с нарушением их функционирования, так и недостаточной изученностью патогенеза таких состояний. Большой вклад в патогенез различных заболеваний вносит нарушение механизмов дифференцировки ГМК, в том числе и в различные периоды эмбрионального развития. Кроме того, изучение механизмов дифференцировки и регенерации ГМК имеет большое общебиологическое значение в рамках проблемы изучения этих процессов в различных органах и тканях.

Одним из наименее изученных аспектов функционирования ГМК является их развитие, дифференцировка и регенерация в пределах женской репродуктивной системы, хотя знания этих механизмов диктуется запросами практической медицины, в частности акушерства, в котором полноценная регенерация миометрия после оперативного вмешательства на матку — один из самых актуальных вопросов. Важность проблемы обусловлена увеличением частоты операций кесарева сечения, количество которых достигает 30% от общего числа родов [5, 17, 23, 94]. До 40% женщин, перенесших кесарево сечение, планируют повторную беременность и роды, которые зачастую завершаются оперативно из-за угрозы разрыва матки по рубцу [13, 18, 19]. Повторное кесарево сечение является технически более сложной операцией. Отбор женщин для самопроизвольных родов после кесарева сечения представляет собой самостоятельную серьезную проблему связанную, прежде всего, с оценкой состояния рубца на матке [23, 49]. В связи с этим все большую актуальность приобретают вопросы репарации шва на матке [14, 15]. Заживление рассеченной стенки матки может происходить либо путем субституции (неполная регенерация) с образованием мышечно-соединительнотканного рубца, либо реституции, при которой в месте повреждения рубец не выявляется [2, 32]. Одним из важных аспектов проблемы ведения беременности у женщин с рубцом на матке является оценка состояния рубца, которое зависит от совокупности фактов, в том числе от вида шва и шовного материала. Верифицировать полученные данные позволяет морфологическое исследование биопсированного рубца [28].

Таким образом, актуальность данного исследования определяется в первую очередь необходимостью детального морфологического изучения дифференцировки ГМК матки в онтогенезе и при репаративной регенерации для выявления морфологических критериев полноценности рубца на матке после кесарева сечения и сопоставления этих данных с результатами исследования плодов человека на разных сроках гестации для проведения параллелей между репаративной регенерацией и пренатальным онтогенезом. В связи с этим были поставлены следующие цель и задачи.

Цель исследования: изучить общие закономерности дифференцировки гладкомышечных клеток матки и маточных труб человека на разных сроках пренатального онтогенеза и сравнить полученные данные с процессом дифференцировки ГМК в ходе репаративной регенерации рубца на матке после операции кесарева сечения в зависимости от вида шва и шовного материала.

Задачи исследования:

1. Изучить сроки появления в ГМК матки и маточных труб плода человека специфических миогенных маркеров: альфа-гладкомышечного актина (альфа-ГМА), десмина и кальпонина в пренатальном онтогенезе.

2. Изучить те же характеристики ГМК матки человека при репаративной регенерации после интраоперационного механического повреждения.

3. Провести сравнительный анализ иммуногистохимических характеристик ГМК матки и маточных труб человека в эмбриогенезе и при репаративной регенерации в зависимости от вида шва и шовного материала.

Научная новизна. Впервые получены данные о последовательности появления миоспецифичных белков (десмина, альфа-ГМА, кальпонина) в ГМК матки и маточных труб человека в онтогенезе. Новыми следует признать данные, полученные при иммуногистохимическом изучении ГМК матки в условиях регенерации у человека. Приоритетными являются результаты изучения рубца на матке в зависимости от вида шва и шовного материала. Впервые разработаны критерии оценки состояния ГМК человека, учитывающие основные морфологические и иммуногистохимические показатели.

Теоретическая и практическая ценность работы. Проведенное исследование выявило последовательность и сроки появления миоспецифичных белков (десмина, альфа-ГМА и кальпонина) и морфологические закономерности развития миоцитов репродуктивной системы плода человека в пренатальном онтогенезе и в процессе репарации. Полученные в работе данные приближают нас к пониманию процесса дифференцировки ГМК матки и маточных труб в пренатальном онтогенезе и при репаративной регенерации. Результаты иммуногистохимического исследования ГМК зоны рубца в совокупности с другими методами диагностики могут быть использованы в акушерстве для оценки состояния миометрия оперированных женщин и выбора тактики для последующего родоразрешения. Полученные результаты имеют не только практический интерес для акушеров-гинекологов, но имеют и большое общебиологическое значение для гистологии и эмбриологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В процессе пренатального онтогенеза человека в ходе дифференцировки гладкомышечных клеток матки и маточных труб первым появляется десмин, затем альфа-гладкомышечный актин и на более поздних сроках кальпонин.

2. На успешность репаративной регенерации миометрия человека и формирование мышечного рубца влияет как вид шва, так и разновидность шовного материала.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на 74-й студенческой научно-практической конференции посвященной 100-летию P.A. Вяселева (Казань, 2000) — юбилейной научно-практической конференции «100 лет акушерско-гинекологической клинике им. проф. В.С.Груздева» (Казань, 2000) — всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Воронеж, 2001), Пироговской студенческой научной конференции (Москва, 2001) — III Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2002), IV Форуме «Мать и дитя» (Москва, 2002) — 9-й Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине», посвященной 190-летию Казанского государственного медицинского университета (Казань, 2004) — пятом Общероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004) — третьей Российской научной конференции «Роль природных факторов и туризма в формировании здоровья населения» (Уфа — Иремель, 2005) — 11-й Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ в Российских и зарубежных научных изданиях, в том числе одна статья.

Объем и структура работы.

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка основной использованной литературы. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, иллюстрирована 5 таблицами, 34 рисунками. Список использованной литературы включает 204 наименования, из которых 35 русскоязычных и 169 иностранных источника.

Статистические данные свидетельствуют о резком увеличении количества женщин использовавших для родоразрешения оперативный подход в виде кесарева сечения. А это в свою очередь резко увеличивает контингент женщин с рубцом на' матке, причем более половины из них планирует повторную беременность в ближайшем будущем [120, 199]. В связи с этим всё актуальней становится проблема выбора вида родоразрешения у женщин с рубцом на матке [44, 120]. Именно в отборе кандидаток на консервативные роды среди женщин, перенесших кесарево сечение, акушерам видится основной резерв снижения частоты случаев оперативного родоразрешения. В настоящее время отбор кандидаток для естественного родоразрешения среди этого контингента женщин производится по совокупности различных признаков, важнейшим из которых является оценка состояния рубца на матке после операции [120]. Единственными объективными методами, которые позволяют оценить состояние рубца, являются методы гистологии. Однако на сегодняшний день нет достоверных морфологических и иммуногистохимических критериев оценки состояния миометрия в зоне рубца после операции. Кроме того, не исследована возможная связь между морфологическими характеристиками миометрия в области рубца с его поведением во время повторной беременности и родов. В связи с этим нами разработана таблица: балльной оценки морфологической и иммуногистохимической зрелости миометрия, учитывающая наиболее значимые характеристики клеток миометрия, такие как: морфологическая структура ткани, экспрессия определяемого протеина в ГМК матки и маточных труб и её интенсивность в сравнении со зрелыми ГМК, которые позволяют объективно оценить его состояние. Использованный метод позволяет оценить как каждый из морфологических показателей в отдельности, так и весь процесс регенерации и созревания ГМК внутренних половых органов в совокупности. Общая сумма баллов отражает степень зрелости ГМК женской репродуктивной системы в целом. Для иммуногистохимической оценки зрелости ГМК миометрия обычно используют разнообразные белки-маркеры, по которым возможно объективно судить о состоянии ГМК. В связи с этим, проанализировав как отечественные, так и зарубежные литературные источники, мы пришли к выводу, что для этих целей наиболее подходят десмин, альфа-ГМА и кальпонин [84, 85, 114, 142, 166, 180, 185]. Каждый из белков характеризует различные стороны функционирования гладкого миоцита и по их одновременному присутствию в клетке, мы можем сделать вывод о степени дифференцировки ГМК. Известно, что ГМК млекопитающих, в отличие от исчерченных миоцитов могут находиться в двух функциональных состояниях: функционально неактивном, состоянии синтеза и накопления сократительных белков (синтетический белковый фенотип) или в функционально активном состоянии (сократительный белковый фенотип) [42, 66, 74]. На переход ГМК из неактивного состояния в активное, т. е. на функциональное созревание гладкого миоцита, значительное влияние оказывает ряд факторов: трофика и оксигенация ткани, клеточное микроокружение, гуморальные факторы [81, 141, 169]. Нарушение эффекта любого из них препятствует полноценному переходу от сократительного в синтетический фенотип ГМК [194]. Известно, что регенерация различных органов и тканей во многом повторяет пренатальный онтогенез, это характерно, в том числе и для ГМК женских половых органов [12]. Вот почему мы решили сравнить процесс репаративной регенерации ГМК миометрия и пренатальное развитие ГМК матки и маточных труб плода человека. Наш интерес к пренатальному онтогенезу ГМК матки и маточных труб также обусловлен отсутствием точных данных о. времени начала синтеза различных белков и виде фенотипа ГМК к завершению эмбрионального периода человека. Нами изучены ГМК миометрия и мышечной оболочки маточных труб плода человека на сроке гестации от 15 до 37 недель. При иммуногистохимическом исследовании первым в ГМК внутренних половых органах плода человека появляется десмин — на 16 неделе гестации, за ним с разницей в одну неделю, один за другим, начинали экспрессироваться альфа ГМА и кальпонин. Нами отмечено, что иммуноэкспрессия всех трех вышеназванных протеинов в ГМК маточных труб начиналась раньше на неделю, чем в ГМК матки. Однако к'25 неделе различия в окраске антителами к изучаемым белкам ГМК матки и маточных труб плода человека полностью нивелируются. К этому сроку происходят не только иммуногистохимические, но и морфологическое изменение мышечной ткани матки и маточных труб плода человека. Так, миометрий приобретает упорядоченную волокнистую структуру, хотя ещё сохраняется его гетерогенность по иммуногистохимической окраске ГМК на альфа-ГМА и кальпонин, это характерно и для маточных. труб. Эти различия исчезают к 37-й неделе гестации, когда мышечный слой матки и маточных труб плода человека, как по морфологическим, так и по иммуногистохимическим характеристикам неотличим от миометрия небеременной женш-ины. Таким образом, согласно результатам наших исследований морфологическое и иммуногистохимическое созревание миометрия и мышечного слоя маточных труб плода человека завершается ещё до рождения. Анализ полученных результатов позволил нам заключить, что существует определенная последовательность экспрессии из5Д1аемых белков: первым появляется десмин, затем альфа-ГМА, последним начинает экспрессироваться кальпонин. Для выбора тактики повторного родоразрешения у женщин перенесших кесарево сечение, необходимо знать в каком состоянии находятся ГМК миометрия в области рубца. Если большую их часть следует отнести к ГМК сократительного фенотипа, то в этом случае не противопоказано родоразрешение через естественные родовые пути, и такой миометрии сможет его обеспечить. Зная о высокой чувствительности ГМК к дефициту трофических факторов, при выборе способа ушивания миометрия необходимо подобрать наиболее щадящий, «нежный» шов, которым будет восстановлена целостность стенки матки, чтобы он оказывал минимальное воздействие на регенерирующий миометрии и не препятствовал нормальной васкуляризации. Вместе с тем на процесс регенерации влияет и вид шовного материала. В современной хирургии существует множество способов ушивания стенок полых органов и видов рассасывающегося шовного материала. Классически при ушивании стенки матки принято использовать двухрядный шов рассасывающимся природным шовным материалом — кетгутом [15]. При своей технической простоте и высокой надежности этот шов имеет ряд недостатков, в том числе грубое сдавливание ткани двумя рядами лигатур и рассасывание кетгута в процессе асептического воспаления, что ещё больше приводит к отеку и нарушению трофики миометрия в области рубца [15]. Такой шов принято называть «грубым». Использование однорядного серозно-мышечного шва синтетической рассасывающейся полимерной нитью «Викрил» рекомендовано ВОЗ и AGOG [39]. При таком виде шва не происходит сильного сдавления ткани, к тому же викрил рассасывается посредством гидролиза не вызывая дополнительного отека и ишемии поврежденной ткани («нежный» шов).Нами изучены 54 биопсии миометрия двух групп женщин перенесших кесарево сечение, которым целостность матки восстанавливалась либо «грубым» кетгутовым швом, либо «нежным» викриловым швом. Для изучения регенерации миометрия пункционная биопсия проводилась на тех сроках, которые соответствуют основным этапам регенерации гладкомышечной ткани в эксперименте [74]. При исследовании биопсий миометрия из зоны рубца, нами установлено, что через неделю после операции вне зависимости от вида шва в миометрии отмечалась схожая картина. Преобладали процессы деструкции, на фоне которых отмечено начало регенерации. ГМК располагаются беспорядочно, вокруг них большое количество соединительнотканных волокон и клеток воспаления. Однако в препаратах миометрия ушитого «нежным» швом мы не наблюдали такого обилия клеток воспаления, как при изучении «грубого» шва. В миометрий отмечены ГМК имеющие различный уровень экспрессии десмина, альфа-ГМА и кальпонина, подобную картину мы наблюдали в миометрий плода человека на 17−19 неделе гестации. Через три месяца после операции в зависимости от вида шва появляются различия в морфологической и иммуногистохимической картине миометрия в зоне рубца. В миометрий ушитом «грубым» швом процесс регенерации пошел по пути субституции соединительной ткани мышечной, тогда как при ушивании «нежным» швом он идет по пути реституции. Через 6−7 месяцев после операции различия в морфологической картине миометрия становятся еш-ё более очевидными. При этом в своём развитии миометрий «нежного» шва опережает «грубый» шов не ТОЛЬКО: по морфологическим, но и по иммуногистохимическим признакам. Через один год после операции в миометрий зоны «нежного» шва по своим морфологическим и иммуногистохимическим характеристикам не отличим от интактного миометрия женщины или плода человека на 37-й неделе внутриутробного развития. Миометрий ушитый грубым швом по морфологическим и иммуногистохимическим характеристикам был схож с миометрием плода человека на 24−26 неделе гестации. На исход регенерации значительное влияние оказывает вид шва и шовного материала. Нами установлено, что на миометрий предпочтительно накладывать однорядный шов нитью «Викрил», репарация которого имеет значительное преимущество перед репарацией классического кетгутового шва в виде полноценного замещения соединительной ткани на мышечную, которая схожа с интактным миометрием. В результате нашего исследования при изучении регенерации миометрия области рубца оказалось, что в основном регенерация миометрия завершается через один год после операции. Так же нами установлено, что к рождению ГМК матки и маточных труб плода человека по экспрессии десмина, альфа-ГМА и кальпонина не отличаются от функционально зрелых ГМК миометрия небеременной женщины. Это факт дает основание предполагать, что к рождению ГМК матки и маточных труб плода человека уже функционально зрелые. Глава 6. Выводы.

1. В ходе пренатального онтогенеза ГМК миометрия и маточных труб плода человека начинают окрашиваться на десмин с 16 недели, альфа-ГМА с 18 недели, а кальпонин на 18−19 неделе внутриутробной жизни.2. ГМК маточных: труб плода человека начинают окрашиваться на альфа ГМА, десмин и кальпонин раньше, чем ГМК миометрия плода человека: • десмин-позитивные ГМК обнаруживаются в маточных трубах с 16 недели гестации, в миометрии с 17 недели гестации. • альфа-ГМА-позитивные ГМК обнаруживается на сроке 18 недель внутриутробной жизни маточных трубах плода человека, тогда как в матке только через неделю. • кальпонин-позитивные ГМК обнаруживается в маточных трубах плода человека с 18−19 недель гестации и с 19 недели гестации в ГМК миометрии плода.3. Различия в степени выраженности экспрессии альфа-ГМА, десмина и кальпонина в ГМК матки и маточных труб нивелируются к 24−25 неделе внутриутробного развития плода.4. В течении позднего пренатального онтогенеза происходит постепенное изменение структуры миометрия, который к 37 неделе внутриутробного развития иммуногистохимически не отличается от миометрия небеременной женш-ины.5. Морфологическая дифференцировка и становление сократительного фенотипа ГМК миометрия, а так же мышечной оболочки маточных труб плода человека завершается к 37 неделе гестации.6. На исход процесса репаративной регенерации в виде формирования мускуляризированного полноценного или «дефектного», с большим количеством соединительной ткани, рубца на матке значительное влияние оказывают вид шва и шовного материала. Процесс регенерации миометрия «нежного» шва опережает регенерацию «грубого» шва.7. Вне зависимости от вида шва и шовного материала процесс репаративнои регенерации полностью завершается лишь через 40−48 недель после операции.8. При наложении «грубого» шва на матку регенерация идет по пути субституции, а ГМК в области рубца не доходят до дифференцированного состояния и соответствуют миометрию плода человека на 24−26 неделе гестации.9. При наложении «нежного» шва на матку происходит формирование полноценного мышечного рубца, миометрий которого составляют высокодифференцированные миоциты, а структура миометрия соответствует нормальному миометрию небеременной женщины или миометрию плода человека после 37-й недели гестации. Практические рекомендации.

1. Для наиболее точной и всесторонней оценки состояния рубца на матке следует использовать иммуногистохимическое исследование миометрия в области рубца с использованием антител против десмина, альфа-ГМА и кальпонина.2. Для удобства оценки состояния миометрия как в онтогенезе, так и при регенерации матки и установления его морфологической и иммуногистохимической зрелости мы рекомендуем использовать таблицу определения индекса гистологической зрелости ткани матки и маточных труб.3. Для формирования рубца идентичного интактному миометрию и позволяющего повторные роды через естественные родовые пути мы рекомендуем ушивать миометрии однорядным серозно-мышечным швом нитью викрил.4. Исходя из полученных в диссертации результатов, мы рекомендуем, планирование повторной беременности у женщин перенесших кесарево сечение не раньше, чем через 1 год после операции.