Диплом, курсовая, контрольная работа
Помощь в написании студенческих работ

Функции теломеразного белка дрожжей Saccharomyces cerevisiae Est3

Диссертация: Функции теломеразного белка дрожжей Saccharomyces cerevisiae Est3
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Достаточно странным является отсутствие взаимосвязи между гидролизом ГТФ и взаимодействием белка Est3 с теломерной ДНК. Обычно гидролиз ГТФ приводит к изменению конформации белка, которое, в свою очередь, вызывает изменение его свойств. Однако не стоит забывать, что белок Est3 взаимодействует и с другими компонентами теломеразного комплекса. Гидролиз ГТФ может регулировать взаимодействие с одним… Читать ещё >

Содержание

  • Список сокращений
  • 1. Введение
  • 2. Обзор Литературы. Взаимодействие белков с в-квадруплексами
    • 2. 1. в-квадруплексы
    • 2. 2. Белки, взаимодействующие с ДНК-квадруплексами
    • 2. 3. Теломерные и теломер-ассоциированные белки, взаимодействующие с ДНК-квадруплексами
      • 2. 3. 1. Белки ТЕВР и их структурные гомологи
      • 2. 3. 2. Репликативный белок, А ^РА)
      • 2. 3. 3. Белки, взаимодействующие с двухцепочечной теломерной ДНК — Иар1 и ТКР
      • 2. 3. 4. Белки комплекса М1*Х
      • 2. 3. 5. Хеликазы
      • 2. 3. 6. Белок ЕбП

Функции теломеразного белка дрожжей Saccharomyces cerevisiae Est3 (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

На концах хромосом находятся ДНК-белковые структуры — теломеры. Они защищают линейные концы хромосом эукариот от деградации и слияния, поддерживая стабильность генома. Недорепликация концов хромосом при каждом клеточном делении приводит к укорочению теломер, в результате которого клетка перестаёт делиться, входит в состояние сенессенса и погибает. Однако, во многих клетках, например в раковых, стволовых и эмбриональных клетках млекопитающих, а также в одноклеточных эукариотических организмах существует механизм поддержания стабильности длины теломер с помощью достраивания теломерных повторов ферментом теломеразой. Изучение работы и регуляции теломеразного комплекса вызывает большой интерес во всем мире, так как открывает возможности для лечения онкологических заболеваний путём восстановления контроля числа клеточных делений в раковых клетках. Работы по созданию противоопухолевых препаратов, ингибирующих теломеразную активность, в частности, за счёт стабилизации квадруплексов на теломерных повторах, ведутся уже много лет. Очевидно, что для дальнейшего развития этого направления необходимо детальное понимание не только механизма работы теломеразного комплекса, но и особенностей взаимодействия теломерных квадруплексов с теломеразой как in vivo, так и in vitro.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae, являясь одноклеточными эукариотами и одновременно одним из наиболее изученных организмов, в геном которого легко вносить необходимые изменения, представляют собой удобную модельную систему для изучения теломеразного комплекса. В теломеразный комплекс дрожжей входят 4 незаменимых in vivo компонента: теломеразная обратная транскриптаза Est2, теломеразная РНК tlcl и два регуляторных белка — Est3 и Estl. Est3 является наименее изученным компонентом теломеразного комплекса, его структура и функция остаются неизвестными. Только в последние несколько лет стали известны некоторые его биохимические свойства, в частности, ГТФазная активность и способность к димеризации, взаимодействие Est3 с теломерными олигонуклеотидами, однако основная функция белка Est3 до сих пор не ясна.

Основой для данной работы стала гипотеза о взаимодействии белка Est3 с ДНК-квадруплексами на концах теломер и необходимости этого взаимодействия для регуляции теломеразной активности в дрожжах. На сегодняшний день известно несколько белков, входящих в теломеразный комплекс других организмов, и взаимодействующих с квадруплексами. Например, структурный гомолог Est3 — ТЕВР (3 простейших — в паре с ТЕВРа способствует формированию G-квадруплексов in vivo. В то же время, другой структурный гомолог Est3 — ТРР1 человека — образует димер Potl/TPPl, который расплетает ДНК-квадруплексы и является фактором процессивности для теломеразы человека. Последние данные свидетельствуют, что для привлечения Est3 на теломеры необходимо взаимодействие с другим незаменимым /л vivo белком теломеразного комплекса — Estl. Кроме того, недавно было показано, белок Estl способен формировать ДНК-квадруплексы. Подтверждение предполагаемого взаимодействия Est3 с ДНК квадруплексами будет означать, что регуляция теломеразной активности за счёт формирования квадруплексов является консервативным механизмом.

Целью работы являлась проверка гипотезы о взаимодействии Est3 с ДНК-квадруплексами, поиск возможной роли этого взаимодействия в функционировании теломеразного комплекса дрожжей 5. cerevisiae, и определение связи с ГТФазной активностью и димеризацией белка Est3 S.cerevisiae.

5. Выводы.

1. Белок Est3 специфично взаимодействует с ДНКи РНК-квадруплексами in vitro.

2. Узнавание различных квадруплексов белком Est3 основано на взаимодействии с петлёй в составе ДНК-квадруплекса.

3. ДНК-квадруплекс ингибирует гидролиз ГТФ белком Est3.

4. ГТФазная активность белка Est3 коррелирует с димеризацией молекул белка.

5. Димеризация белка Est3 стимулируется присутствием ионов магния.

3.6.

Заключение

.

Таким образом, в представленной работе впервые показано, что белок Est3 способен взаимодействовать с ДНКи РНК-квадруплексами, образованными теломерными повторами. Получены и охарактеризованы белки Est3 S. cerevisiae с заменами аминокислотных остатков, подтверждающими важность взаимодействия белка Est3 с ДНКквадруплексами для работы теломеразного комплекса in vivo. Показана специфичность взаимодействия с межмолекулярными квадруплексами, определены константы диссоциации с различными типами квадруплексов. Обнаружено, что в узнавании и связывании ДНК-квадруплексов белком Est3 важную роль играет не только структура квадруплекса, но и нуклеотидная последовательность между гуаниновыми трактами, образующими G-квартеты. Установлено, что Est3 взаимодействует с квадруплексами преимущественно в виде димера. Однако количество трактов G-квартетов, как и наличие и структура петель между ними могут изменять кооперативность образования комплекса.

Достаточно странным является отсутствие взаимосвязи между гидролизом ГТФ и взаимодействием белка Est3 с теломерной ДНК. Обычно гидролиз ГТФ приводит к изменению конформации белка, которое, в свою очередь, вызывает изменение его свойств. Однако не стоит забывать, что белок Est3 взаимодействует и с другими компонентами теломеразного комплекса. Гидролиз ГТФ может регулировать взаимодействие с одним из этих компонентов, например обратной транскриптазой Est2 или квадруплекс-формирующим белком Estl. Ранее уже высказывалось предположение, что активация белком Estl удлинения теломер может быть следствием его взаимодействия с Est3 [284]. Действительно, взаимодействие Est3 с теломеразным комплексом на теломерах регулируется в течение клеточного цикла и зависит от Estl[284], Поскольку Estl формирует ДНК-квадруплексы, взаимодействие с ними белка Est3 может дополнительно стабилизировать теломеразный комплекс, а гидролиз ГТФ участвовать в активации удлинения теломер обратной транскриптазой Est2.

Достаточно интересным также представляется сравнение белков Est3 в S. cerevisiae с ТЕВРР в S. lemnae и ТРР1 человека. Из результатов представленной работы очевидно, что способность ТЕВРр формировать теломерные ДНК-квадруплексы в процессе эволюции была отделена от функции, выполняемой консервативным для ТЕВР (3, ТРР1 и Est3 OB-fold доменном. Можно предположить, что в S. cerevisiae эту функцию /л vivo выполняет белок Estl. Наличие взаимодействия между Estl и Est3 в сочетании со способностью Est3 образовывать комплексы с теломерными квадруплексами предполагает тем не менее наличие тесной взаимосвязи между формированием квадруплексов и основной функцией OB-fold домена белка Est3. Также можно утверждать, что Est3 является одиним из звеньев консервативного механизма регуляции стабильности и длины теломер с помощью образования квадруплексов. Роль ТЕВРа, партнёра TEBP?, по всей видимости, выполняют Cdcl3 в S. cerevisiae и Potl в делящихся дрожжах, M. musculus и H.sapiens.

Неизвестной пока остаётся роль взаимодействия Est3 с теломерными РНК-квадруплексами. Однако то, что нарушение этого взаимодействия в белке Est3D164A приводит к проявлению сенессенс фенотипа, предполагает его важность для регуляции теломеразной активности в клетке. Теломерные РНК-повторы представлены в клетке в виде недавно обнаруженной РНК — TERRA. Роль TERRA в регуляции теломеразной активности пока не выяснена, и взаимодействие с ней абсолютного необходимого in vivo компонента теломеразного комплекса Est3 является весьма интригующим.

4. Материалы и методы.

4.1. Реактивы, биопрепараты, буферные растворы,.

В работе были использованы следующие реактивы и препараты:

— NaCI, NaOAc, Na2HP04, КН2Р04, KCl, KOAc, MgCI2, Mg (OAc)2, Tris, NaOH, КОН, ЭДТА, НЗВОЗ, HEPES, персульфат аммония, бромфеноловый синий, ксиленцианол, бромистый этидий, имидазол, глицерин фирмы Merk, Германия.

— Доде ци л сульфат натрия, акриламид, 11,11'-метиленбисакриамид, ТЕМЕД, Кумасси R-250 фирмы Serva, Германия.

— уксусная кислота, соляная кислота, хлороформ, изоамиловый спирт, ацетон, фирмы Химмед, Россия.

— водонасыщенный фенол, Triton Х-100 фирмы Roth, Германияэтанол фирмы Ферейн, Россия.

— азотистые основания: аденин, урациламинокислоты: лейцин, триптофан, гистидин, треонин, аргинин, изолейцин, лизин, метионин, фенилаланин, тирозин, валинсахара: глюкоза, галактоза, арабиноза, сахароза, стеклянные шарики диаметром, 425−600 микрон, LiOAc, БСА, ДТТ, ПМСФ, ДНК спермы лосося, спермидин, формальдегид, формамид, 2-меркаптоэтанол, ампициллин, генетицин, протеиназа К, РНКаза, А фирмы Sigma, Германия.

— полиэтиленгликоль 6000, Tween 20 фирмы Fluka, Германия.

— бакто-триптон, дрожжевой экстракт, бакто-агар, YNB (Yeast Nitrogen Base w/o aminoacids), мочевина фирмы Difco, США.

— амициллин, канамицин фирмы Invitrogen, США.

-[у-32Р]АТР, фирмы Amersham Biosciences Part of GE Healthcare, СШАZymolyase фирмы Seikagatu, Япония.

— Ni-сефароза (Ni Sepharose High Performance) фирмы GE Healthcare, США.

— голубой декстран, БСА, овальбумин, химотрипсиноген А, цитохром С фирмы Invitrogen, США.

— Т4 ДНК-лигаза, Т4 ДНК-полимераза, Taq-полимераза, эндонуклеазы рестрикции фирмы MBI Fermentas, Литва.

— олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы фирмой Синтол, Россия и фирмой Sigma, Великобритания.

— набор реагентов для выделения плазмидной ДНК и набор реагентов для выделения ДНК из агарозного геля фирмы Fermentas мембрана PVDF, ECL Western Blotting Detection Kit, Amersham-Pharmacia Biotech, США.

— набор ингибиторов протеаз в таблетках фирмы Roche, Германия.

— секвеназа 2.0 фирмы USB Corporation, США.

— первичные антитела кролика против белков Est3 и HSP 70/80, вторичные антитела козы против постоянной части антител кролика, коньюгированные с пероксидазой фирмы Promega, США.

— фильтровальная бумага Whatman ЗММ фирмы Whatman Biomerta.

— плазмиды pE3N3 и pET30a-Tev6His-S-EST3 были любезно предоставлены Шараповым Ю. С. -штамм DBY-746 а был любезно предоставлен М.Д. Тер-Аванесяном (Москва) Таблица 10. Растворы, использовавшиеся в работе.

LB 1% бакто-триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl (1.5% бакто-агар для твердой среды).

Буфер, А 50 мМ Tris-HCI рН 8.0, 500 мМ KCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ ПМСФ, 1% Triton Х-100.

Буфер Б-100 50 мМ Tris-HCI рН 8.0, 100 мМ KCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ ПМСФ, 10% глицерин.

Буфер Б-20 50 мМ Tris-HCI pH 8.0, 500 мМ KCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ ПМСФ, 10% глицерин, 20 мМ имидазол.

Буфер Б-40 50 мМ Tris-HCI рН 8.0, 500 мМ KCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ ПМСФ, 10% глицерин, 40 мМ имидазол.

Буфер Б-60 50 мМ Tris-HCI рН 8.0, 500 мМ KCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ ПМСФ, 10% глицерин, 60 мМ имидазол.

Буфер Б-300 50 мМ Tris-HCI рН 8.0, 500 мМ KCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ ПМСФ, 10% глицерин, 300 мМ имидазол.

LA 0,1% ксиленцианол, ОД % бромфеноловый синий, 0,5% SDS, 0,1 М ЭДТА рН 8,0, 50% глицерин.

ТВ 2% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 8,55 мМ NaCI, 2,5 мМ KCI, 0,5 мМ MgCI2 lxPBS 140 мМ NaCI, 2.7 мМ KCI, 10 мМ Na2HP04, 1.8 мМ КН2Р04, рН 7.3 ни (200 мМ трис (гидроксиметил)аминометан, 1 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 8 М мочевина, 5%ный додецилсульфат натрия, 1.5%ный 1.4дитио01.треитол, рН 6.8).

SB 62,5 мМ Tris-HCI рН 6,8, 10% глицерин, 2% SDS, 5% 2-меркаптоэтанол, 0,1% бромфеноловый синий.

TGS 25 мМ Tris-HCI рН 8,3, 250 мМ глицин, 0,1% SDS.

TGB 25 мМ Tris-HCI рН 8,3, 250 мМ глицин, 0,1% SDS, 20% Этанол.

БСА-ТБСТ 20 мМ Tris-HCI рН 7,6, 150 мМ NaCI, 0,1% Tween 20, 5% БСА.

Буфер Б100−1 50 мМ Tris-HCI рН 8.0, 500 мМ KCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ ПМСФ, 1% глицерин.

ТБСТ 20 мМ Tris-HCI рН 7,6,150 мМ NaCI, 0,1% Tween 20.

Раствор М 1,18% (NH4)6Mo7024*4H20, 0,07% малахитовый зеленый, 4н H2S04.

1хТВ ОД М Tris, ОД М Н3ВО3, рН 8,3 lxTE 10 мМ Tris-HCI рН 8,0, 1 мМ ЭДТА.

STOP 1 М TrisCI (рН 7,5), 1 М (3-меркаптоэтанол, ОД М ЭДТА.

Sc-His 0,67% YNB, 2% глюкоза, 0,01% аденин, 0,02% урацил, 0,01% лейцин, 0,01% триптофан, 0,02% треонин, 0,002% аргинин, 0,003% изолейцин, 0,003% лизин, 0,002% метионин, 0,005% фенилаланин, 0,003% тирозин, 0,015% валин (2% бакто-агар для твердой среды, 250 мкл 2 М NaOH на 200 мл твёрдой среды).

YPD 2% бакто-триптон, 1% дрожжевой экстракт, 2% глюкоза (2% бакто-агар для твердой среды).

Sc 0,67% YNB, 2% глюкоза, 0,01% аденин, 0,02% урацил, 0,01% лейцин, 0,01% триптофан, 0,005% гистидин, 0,02% треонин, 0,002% аргинин, 0,003% изолейцин, 0,003% лизин, 0,002% метионин, 0,005% фенилаланин, 0,003% тирозин, 0,015% валин (2% бакто-агар для твердой среды, 250 мкл 2 М NaOH на 200 мл твердой среды).

LiCI Трис-HCI, рН 8.1 ЮтМ, LiCl 250тМ, NP40 1%, ЭДТА 1тМ.

Lysis Трис-HCI, рН 8.1 50 mM, SDS 1%, ЭДТА ЮтМ, коктейль ингибиторов протеаз.

TES 10 мМ Tris-HCI рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, 1% SDS.

RllOEFwd GAAAGGACTCATAATTGCGAGATCACATCTGAGACGACC.

RllOERev GGTCGTCTCAGATGTGATCTCGCAATTATGAGTCCTTTC.

D164AFwd ACCAGGCC ACGATATTTGCTATTGATCAA GTCGGATCG.

D164ARev CGATCCGACTTGATCAATAGCAAATATCGTGGCCTGGT.

BDH2−1 G CCTTAG CGTATTTCGGTAAAG.

BDH2−2 GTACTTTGTAGCAGTGAGATTCGTT.

Yal069−2 ATATGG TG G GTAG AAG AA ACG С ATT.

Tel01L-5 ACACCCACACACCCACAC.

Up-fwd GTGAGTACTAGTCGACGGATGA.

H3-fwd CTTGGGGAAGCTACATCGTCATC.

H3-rev GATGACGATGTAGCTTAACAAG.

E3-Fwd CTGAGTATGTTGGCTTTGAATGAG.

E3-rev CTCATTCAACGACAACAGACTCAG.

Down-rev CTGTCTTTGGACTGAGTGCAG.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Watson, J. D., and Crick, F. H., Molecular structure of nucleic acids- a structure for deoxyribose nucleic acid. // Nature, 1953,171, 737−738.
  2. Fry, M., Tetraplex DNA and its interacting proteins. // Front Biosci, 2007,12, 4336−4351.
  3. Davis, J. T., G-Quartets 40 Years Later: From 5'-GMP to Molecular Biology and Supramolecular Chemistry. // Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 2004, 668 698.
  4. Oxford, G. S., and Gillespie, R. G., Evolution and ecology of spider coloration. // Annu Rev Entomol, 1998, 43, 619−643.
  5. Yafe, A., Etzioni, S., Weisman-Shomer, P., and Fry, M., Formation and properties of hairpin and tetraplex structures of guanine-rich regulatory sequences of muscle-specific genes. // Nucleic Acids Res, 2005, 33, 2887−2900.
  6. Xu, Y., and Sugiyama, H., Formation of the G-quadruplex and ?-motif structures in retinoblastoma susceptibility genes (Rb). // Nucleic Acids Res, 2006, 34, 949−954.
  7. Dexheimer, T. S., Sun, D., and Hurley, L. H., Deconvoluting the structural and drug-recognition complexity of the G-quadruplex-forming region upstream of the bcl-2 PI promoter. // J Am Chem Soc, 2006, 128, 54 045 415.
  8. Hammond-Kosack, M. C., and Docherty, K., A consensus repeat sequence from the human insulin gene linked polymorphic region adopts multiple quadriplex DNA structures in vitro. // FEBS Lett, 1992, 301, 79−82.
  9. Woodford, K. J., Howell, R. M., and Usdin, K., A novel K (+)-dependent DNA synthesis arrest site in a commonly occurring sequence motif in eukaryotes. // J Biol Chem, 1994, 269, 27 029−27 035.
  10. Zahler A.M., W. J. R., Cech T.R. and Prescott D.M., Inhibition oftelomerase by G-quartet DNA structures. // Nature, 1991, 350, 718−720.
  11. Oganesian, L., Moon, I. K., Bryan, T. M., and Jarstfer, M. B., Extension of G-quadruplex DNA by ciliate telomerase. // EMBO J, 2006, 25,1148−1159.
  12. Oganesian, L., Graham, M. E., Robinson, P. J., and Bryan, T. M., Telomerase recognizes G-quadruplex and linear DNA as distinct substrates. // Biochemistry, 2007, 46,11 279−11 290.
  13. Chang, C. C., Kuo, I. C., Ling, I. F., Chen, C. T., Chen, H. C., Lou, P. J., Lin, J. J., and Chang, T. C., Detection of quadruplex DNA structures in human telomeres by a fluorescent carbazole derivative. // Anal Chem, 2004, 76, 4490−4494.
  14. Chang, T.-C., and Chang, C.-C., Detection of G-Quadruplexes in Cells and Investigation of G-Quadruplex Structure ofd (T2AG3)4 in K+ Solution by a Carbazole Derivative: BMVC. //, 2010, 608,183−206.
  15. Feuerhahn, S., Iglesias, N., Panza, A., Porro, A., and Lingner, J., TERRA biogenesis, turnover and implications for function. U FEBS Lett, 2010, 584, 3812−3818.
  16. Uliel, L., Weisman-Shomer, P., Oren-Jazan, H., Newcomb, T., Loeb, L. A., and Fry, M., Human Ku antigen tightly binds and stabilizes a tetrahelical form of the Fragile X syndrome d (CGG)n expanded sequence. // J Biol Chem, 2000, 275, 33 134−33 141.
  17. Plyler, J., Jasheway, K., Tuesuwan, B., Karr, J., Brennan, J. S., Kerwin, S. M., and David, W. M., Real-time investigation of SV40 large T-antigen helicase activity using surface plasmon resonance. // Cell Biochem Biophys, 2009, 53, 43−52.
  18. Wu, Y., Sommers, J. A., Khan, I., de Winter, J. P., and Brosh, R. M., Jr., Biochemical characterization of warsaw breakage syndrome helicase. // J Biol Chem, 2012, 287,1007−1021.22
Заполнить форму текущей работой

На отлично!