Диплом, курсовая, контрольная работа
Помощь в написании студенческих работ

Структура и анализ генома вируса Карши

Диссертация: Структура и анализ генома вируса Карши
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Остаётся нерешённым вопрос и о точном таксономическом положении вируса Карши среди представителей комплекса клещевого энцефалита, вследствие отсутствия каких-либо знаний о полной структуре его генома. В связи с этим, была предпринята попытка изучить структуру полного генома вируса Карши. К моменту выполнения данной работы в базе данных GenBank была представлена только нуклеотидная… Читать ещё >

Содержание

  • Список использованных сокращений
  • Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. 1. Экология вируса Карши и его географическое распространение
    • 1. 2. Биологические свойства вируса Карши
      • 1. 2. 1. Патогенные свойства вируса
      • 1. 2. 2. Роль вируса Карши в патологии человека
    • 1. 3. Иммунохимические характеристики вируса
    • 1. 4. Таксономическое положение вируса Карши
    • 1. 5. Молекулярно-биологические характеристики флавивирусов
      • 1. 5. 1. Структура генома флавивирусов
      • 1. 5. 2. Вирусные белки
      • 1. 5. 3. Репродуктивный цикл флавивирусов
    • 1. 6. Филогенетические взаимоотношения представителей рода Flavivirus
    • 1. 7. Проблемы классификации вирусов комплекса клещевого энцефалита
  • СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
  • Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
    • 2. 1. Исследуемые штаммы
    • 2. 2. Использованные олигонуклеотидные праймеры
    • 2. 3. Выделение вирусной РНК
    • 2. 4. Реакция обратной транскрипции
    • 2. 5. Проведение полимеразной цепной реакции
    • 2. 6. Определение 5'-концевой последовательности геномной
    • 2. 7. Электрофорез ДНК
    • 2. 8. Подготовка ДНК для секвенирования
    • 2. 9. Секвенирование ДНК
    • 2. 10. Построение алайментов и филогенетический анализ
    • 2. 11. Клонирование ПЦР-фрагментов
  • Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
    • 3. 1. Определение первичной нуклеотидной последовательности генома вируса Карши (штамм LEIV-2247 Uz)
    • 3. 2. Определение первичной нуклеотидной последовательности генома штамма LEIV-7192 Tur
    • 3. 3. Анализ структуры полноразмерного генома вируса Карши
      • 3. 3. 1. Особенности организации белков вируса Карши
      • 3. 3. 2. 5'-нетранслируемая область генома
    • 3. 4. Филогенетические взаимоотношения вируса Карши и других представителей рода Flavivirus
    • 3. 5. Создание лабораторного варианта ОТ-ПЦР для детекции вируса Карши

Структура и анализ генома вируса Карши (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Около ста лет назад Вальтер Рид описал патогенный для человека вирус жёлтой лихорадки, ставший типовым представителем рода Flavivirus семейства Flaviviridae. С тех пор были идентифицированы более 80 представителей этого рода, большинство из которых переносят комары или клещи. Представители этой группы вызывают опасные заболевания для человека и животных. Вирус Денге (.Denge virus), вирус Западного Нила (WNV), вирус японского (, JEV) и клещевого энцефалитов (TBEV) являются возбудителями тяжёлых заболеваний человека, нередко заканчивающихся летальным исходом [18].

Вопросы дифференциации и классификации вирусов рода Flavivirus и входящих в него вирусов комплекса клещевого энцефалита (ККЭ) являются важнейшими и имеют не только теоретический интерес, но и практическое значение, так как с ними связаны возможности усовершенствования диагностики и профилактики заболеваний, вызываемых этими вирусами. До настоящего времени эволюционные и генетические взаимоотношения между флавивирусами ясны не в полной мере, вследствие чего их таксономическое положение и классификация нуждаются в дальнейшем осмыслении и уточнении.

Актуальность проблемы.

Особый интерес для практической медицины и науки представляет группа вирусов рода Flavivirus, объединённых в антигенный комплекс клещевого энцефалита. За последние 30−40 лет в России и ряде стран мира был отмечен рост заболеваемости людей, связанный с вирусами данной антигенной группы. Для разработки адекватной стратегии борьбы с тяжёлыми инфекциями, вызванными этими вирусами, применения наиболее эффективных методов диагностики, профилактики и лечения необходимо исчерпывающе представлять всё многообразие вирусов антигенной группы клещевого энцефалита.

Современная классификация вирусов, входящих в антигенный комплекс клещевого энцефалита, далека от совершенной. По-прежнему ведутся дискуссии о величине различий в таксономических рангах внутри данной группы. Изучение иммунохимических свойств вирусных антигенов с помощью современных методов позволило более точно определить таксономическое положение вирусов в пределах семейства и рода. Для детализации этого положения необходимо учитывать иммунологические и генетические свойства вируса, однако молекулярно-генетическое изучение генома вируса даёт наиболее адекватное представление.

В результате комплексного обследования, которое провели сотрудники Института вирусологии имени Д. И. Ивановского во главе с академиком Д. К. Львовым, в конце прошлого столетия на территории СССР была определена локализация природных очагов различных арбовирусных инфекций, в том числе для ранее неизвестных флавивирусов [10]. Так, в 1972 г., из клещей Ornithodoros papillipes, собранных в окрестностях Каршинской степи Узбекистана, был выделен инфекционный агент, позднее идентифицированный как новый вирус Карши (KSIV или Karshi virus), отнесённый к роду Flavivirus [73].

Вирус Карши является эндемичным для стран Средней Азии и Казахстана. Он является слабопатогенным для человека и вызывает лихорадочное заболевание. Описаны случаи заболевания лихорадкой Карши людей в Казахстане. Больным, инфицированным вирусом Карши через укус клеща, был поставлен диагноз острое респираторное заболевание. Последующие исследования иммунологических свойств антигена позволили идентифицировать вирус Карши как возбудителя [5]. Этиология заболевания изначально была определена не верно, вследствие того, что диагностика и патология этого вируса для человека исследована не достаточно. Для дальнейшего изучения экологии вируса и его роли в патологии человека большое значение имеет мониторинг с помощью специфичной детекции его геномной РНК.

Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению представителей рода Flavivirus, по-прежнему отсутствуют данные о точном систематическом положении и структурных особенностях многих из них. Так, исследования вируса Карши, основанные только на биологических и иммунологических свойствах этого вируса, в течение 10 лет не приводили к точному установлению его положения внутри рода Flavivirus. С совершенствованием иммунохимических методов диагностики и появлением первых данных о первичной структуре небольшого участка гена NS5 вируса Карши, его отнесли к ККЭ [20].

Оставался нерешённым вопрос и о таксономическом положении вируса Карши среди представителей комплекса клещевого энцефалита, вследствие отсутствия данных о структуре его полного генома. Определение же таксономического положения малоизвестного вируса представляет собой непростую задачу, так как классификация, установленная Международным комитетом по таксономии вирусов, не является завершённой, и многие её положения развиваются исследователями.

Для исчерпывающей характеристики штаммов вируса, необходимо знать полную нуклеотидную последовательность их геномов. К началу настоящих исследований данные о структуре полноразмерного генома вируса Карши отсутствовали.

Цель и задачи исследования

.

Целью настоящего исследования явилось определение первичной структуры полного генома вариантов вируса Карши (штаммов LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Тиг), молекулярно-генетическая характеристика его генома и определение систематического положения этого вируса среди представителей рода Flavivirus.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Определить первичную структуру полного генома штамма LEIV-2247 Uz вируса Карши, выделенного в Узбекистане.

2. Определить первичную структуру полного генома штамма LEIV-7192 Tur вируса Карши, изолированного в Туркмении.

3. Провести молекулярно-генетический анализ структуры полноразмерного генома, возможных структурных и неструктурных белков исследуемых штаммов вируса Карши, а также сравнить их между собой и с ранее охарактеризованными вирусами антигенного комплекса клещевого энцефалита.

4. Провести филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генов Е, NS5 и полноразмерныхных геномов изолятов вируса Карши среди представителей рода Flavivirus.

5. Установить точное таксономическое положение штаммов LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Тиг вируса Карши внутри антигенного комплекса клещевого энцефалита, опираясь на данные о первичной структуре их полноразмерных геномов.

6. Разработать лабораторный вариант метода ОТ-ПЦР для избирательного выявления геномной РНК вируса Карши с использованием данных о нуклеотидных последовательностях известных штаммов.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Генетически охарактеризован, на основе определённой нами первичной структуры генома, штамм вируса Карши LEIV-2247 Uz (10 653 и.о.), выделенный в Узбекистане. Последовательность генома этого штамма является первой полноразмерной последовательностью генома вируса Карши, и может быть использована в качестве эталонной для данного вируса при последующих анализах филогенетических взаимоотношений.

2. Определена полная первичная структура генома штамма LEIV-7192 Тиг (10 768 и.о.), изолированного в Туркмении и ранее отнесённого по иммунохимическим свойствам к вирусу Карши.

3. Показано, что геном вируса Карши кодирует полипротеин, который впоследствии нарезается на 11 белков, так же как у остальных вирусов ККЭ. Предсказаны вероятные сайты vV-гликозилирования, а также проанализированы функциональные сайты структурных белков.

4. В результате молекулярно-генетического анализа нуклеотидной и аминокислотной последовательностей белка Е нами были предсказаны нейротропные свойства исследуемых штаммов вируса Карши.

5. На основе определённой нуклеотидной последовательности была предсказана вторичная структура 5-концевого нетранслируемого региона.

6. Молекулярно-генетическое сравнение вируса Карши с флавивирусами, для которых известны полноразмерные последовательности генома и гена NS5, позволяет нам утверждать, что вирус Карши равноудалён от всех представителей ККЭ и образует отдельный кластер внутри данной группы вирусов, к которому, по-видимому, принадлежит и вирус Royal Farm.

7., На основании анализа полной нуклеотидной последовательности генома установлено, что изученные штаммы LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Тиг соответствуют разным генотипам одного вируса (значение дивергенции 5,5%).

8. Создан лабораторный вариант ОТ-ПЦР, позволяющий специфично детектировать геномную РНК вируса Карши (на участке гена NS5) от других представителей комплекса клещевого энцефалита.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генома вируса Карши штаммов LEIV-2247 Uz (10 653 н.о.) и LEIV-7192Tur (10 768 н.о.).

2. Установленная полная нуклеотидная последовательность генома штаммов LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Тиг вируса Карши позволяет использовать их в качестве эталонных представителей двух различных генотипов этой генетической линий. Сравнительный генетический анализ этих штаммов по нуклеотидным последовательностям полных геномов показал, что они различаются друг от друга на уровне, характерном для разных субтипов вируса Tick-borne encephalitis.

3. Предсказаны сайты протеолитического расщепления полипротеина вируса Карши на 11 белков и проанализированы их важные функциональные сайты, в том числе iV-гликозилирования. Показано, что гликопротеин оболочки вириона вируса Карши наиболее похож на белок Е вирусов, вызывающих энцефалиты, кроме того, в позиции 76 находится Thr, что ранее описано для нейротропных вирусов.

4. В ходе сравнительного анализа предсказанной вторичной структуры 5'-концевого нетранслируемого региона вируса Карши была показана его наибольшая степень гомологии с аналогичным участком вируса Powassan. Большая шпилечная структура 5'-нетранслируемой области имеет делецию протяжённостью 6 н.о.

5. Молекулярно-генетическое сравнение вируса Карши среди флавивирусов с известными полноразмерными последовательностями генома, а также генов Е и NS5 свидетельствует о том, что вирус Карши образует отдельный кластер внутри антигенного ККЭ, к которому, по-видимому, принадлежит вирус Royal Farm.

6. Сравнение результатов филогенетического анализа по нуклеотидным последовательностям генов Е, NS5 и по полным последовательностям геномов вирусов, принадлежащих к комплексу клещевого энцефалита, показало, что эти данные хорошо коррелируют между собой. Полученные данные позволяют сделать заключение о правомерном использовании любого из этих генов для установления филогенетических взаимоотношений штаммов вируса Карши в пределах антигенного ККЭ.

7. Создан вариант метода ОТ-ПЦР для выявления вируса Карши, позволяющий специфично детектировать варианты этого вируса от других представителей комплекса клещевого энцефалита. С помощью данной системы обнаружены варианты вируса Карши двух основных генетических линий, известных к настоящему времени.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые установлена первичная структура практически полного генома вируса Карши штамма LEIV-2247 Uz (10 653 и.о.), выделенного в Узбекистане, и штамма LEIV-7192 Тиг (10 768 и.о.), изолированного в Туркмении. Проведено сравнительное изучение функциональных сайтов структурных и неструктурных белков и сайтов нарезания полипротеина между двумя штаммами вируса Карши и другими представителями комплекса клещевого энцефалита.

2. Определена первичная и предсказана вторичная структуры 5'-нетранслируемого региона вируса Карши. Сравнительный анализ этого участка генома вирусов комплекса клещевого энцефалита показал, что последовательность, образующая большую шпилечную структуру является вариабельной и несёт в своём составе делецию протяженностью 6 н.о.

3. Показано, что у изученных штаммов вируса Карши гликопротеин оболочки вириона Е имеет максимальное сходство с белками вирусов, вызывающих энцефалиты. Установлено, что оба штамма в позиции 76 белка Е имеют замену с Ala на Thr, что характерно для нейротропных вирусов комплекса клещевого энцефалита.

4. На основе полученных данных филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей генов Е и NS5, которые хорошо коррелируют с результатами филогенетического анализа полного генома, установлено, что вирус Карши равноудалён от всех представителей комплекса клещевого энцефалита и образует отдельный генетический кластер, к которому, по-видимому, принадлежит и вирус Royal Farm.

5. Сравнительный генетический анализ нуклеотидных последовательностей полных геномов штаммов LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Тиг относительно других представителей комплекса клещевого энцефалита позволил установить, что они принадлежат к разным генотипам вируса Карши.

6. На основе гена NS5 разработан лабораторный вариант ОТ-ПЦР для детекции геномной РНК вируса Карши, позволяющий специфично выявлять этот вирус среди других представителей комплекса клещевого энцефалита.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Род Flavivirus включает в себя более 80 представителей, многие из которых вызывают опасные заболевания человека. Особый интерес для практической медицины и науки представляет группа вирусов этого рода, объединённая, в антигенный комплекс клещевого энцефалита. В последнюю четверть XX века в ряде стран мира был отмечен рост заболеваемости людей, связанных с вирусами данной антигенной группы (Omsk hemorrhagic fever virus, Tick-borne encephalitis virus, Powassan virus и Kyasanur forest disease virus). Для разработки адекватной стратегии борьбы с тяжёлыми инфекциями, вызванных этими вирусами, применения наиболее эффективных методов диагностики, профилактики и лечения необходимо правильно представлять всё многообразие вирусов антигенной группы клещевого энцефалита.

Одним из важнейших аспектов анализа эпидемиологической ситуации является объективная характеристика этиологического фактора заболевания, а именно: оценка генетической вариабельности вирусов, определение числа генотипов каждой генетической линии, уровней дивергенции вирусов и их генотипов, их географического распространения, связи с антигенными вариантами, патогенности, эволюционных взаимосвязей с родственными флавивирусами антигенного комплекса и, несомненно, таксономическое положение.

Существование различных методических подходов, оценочных критериев разных исследователей создаёт дополнительные трудности в классификации вирусов комплекса клещевого энцефалита. По мнению Дж. Р. Стефенсона, современная номенклатура вирусов данного рода несовершенна, и поэтому необходимо принять новую номенклатуру, согласованную на международном уровне [11]. Несомненно, устранению недостатков в классификации будет способствовать использование данных, полученных молекулярно-биологическими методами исследования. Повидимому, новая классификация флавивирусов будет построена по принципу сравнения гомологии геномов для установления характера филогенетических взаимоотношений.

Вирус Карши является представителем комплекса клещевого энцефалита. Этот вирус является эндемичным для стран Средней Азии и Казахстана. Он является слабопатогенным для человека и вызывает заболевание под названием лихорадка Карши. Патология этого вируса для человека так до конца и не исследована. Это объясняется тем, что долгое время диагностика этого заболевания была ошибочной.

Остаётся нерешённым вопрос и о точном таксономическом положении вируса Карши среди представителей комплекса клещевого энцефалита, вследствие отсутствия каких-либо знаний о полной структуре его генома. В связи с этим, была предпринята попытка изучить структуру полного генома вируса Карши. К моменту выполнения данной работы в базе данных GenBank была представлена только нуклеотидная последовательность небольшого участка гена NS5 (AF013381) вируса Карши. Для определения нуклеотидной последовательности полного генома вируса Карши были использованы штаммы из коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии имени Д. И. Ивановского РАМН: LEIV-2247 Uz, выделенный из клещей Ornithodoros papillipes, собранных в Узбекистане, и LEIV-7192 Тиг, изолированного из клещей вида Ornithodoros caniceps, собранных в Туркмении. В ходе работы была определена нуклеотидная последовательность генома штамма LEIV-2247 Uz, составляющая 10 653 н.о. и 10 768 н.о. для изолята LEIV-7192 Тиг (за исключением участка З'-нетранслируемых областей). Нуклеотидная последовательность генома вируса Карши 2-х штаммов LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Тиг была депонирована в базу данных GenBank под номерами AY863002 (NC006947) и (DQ462443) соответственно.

Определённые нами нуклеотидные последовательности двух штаммов из Узбекистана и Туркмении являются первыми полноразмерными последовательностями генома вируса Карши и могут быть использованы в качестве эталонных для данного вируса при последующих анализах филогенетических взаимоотношений.

Анализ и сопоставление полученных нуклеотидных последовательностей полного генома этих штаммов позволил обнаружить в их составе одну открытую рамку считывания, которая кодирует полипротеин протяжённостью 3416 а.о. Исходя из этого анализа, можно предположить, что полипротеин вируса Карши расщепляется на 3 структурных белка: С, prM, Е и 8 неструктурных: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5 и 2K. Подобное строение генома характерно для всех флавивирусов.

Анализ аминокислотной последовательности белка С вируса Карши показал, что он содержит регионы, похожие на сайты ядерной локализации На основании структурных особенностей С-концевого участка этого белка вируса Карши можно предположить, что этот белок может локализироваться в ядре инфицированной клетки.

Аминокислотная последовательность вируса Карши была выровнена с аминокислотными последовательностями других представителей комплекса клещевого энцефалита, как по полному полипротеину, так и по отдельным белкам, что позволило установить гомологию с белками вирусов антигенного комплекса. Можно предположить, опираясь на данные максимальной степени гомологии, что структура главного антигена вируса Карши наиболее похожа на белок Е вирусов TBEV и Powassan и составила 71,4%. Наиболее отдалён вирус Карши по этому показателю от вируса Alkhurma (степень гомологии 67,9%). Это хорошо согласуется с тем, что в позиции 76 домена II белка Е у обоих штаммов вируса Карши присутствует 77гг-остаток, характерный для нейротропных вирусов ККЭ.

Из анализа нуклеотидных последовательностей, кодирующих полипротеин, следует, что максимальная степень гомологии исследуемого штамма LEIV-2247 Uz вируса Карши наблюдалась со штаммами Vasilchenko восточносибирского субтипа и Sojjin-HO дальневосточного субтипа вируса ТВЕ (71,2%), а минимальная (69,8%) с вирусом Deer tick (штамм ctb30) и.

Louping ill (штамм 369/T2). Разница степени гомологии по полному полипротеину составила всего лишь 1,4%, по различным белкам вируса Карши максимальное сходство наблюдалось со всеми представителями комплекса клещевого энцефалита, кроме белков Louping ill virus.

Большинство исследователей рассматривают филогенетические взаимоотношения вирусов внутри рода Flavivirus по последовательности консервативного гена NS5 (РНК-зависимая РНК-полимераза). Поэтому для проведения аналогичного анализа по установлению филогенетических связей вируса Карши с различными представителями рода Flavivirus были взяты 82 штамма, для которых известна первичная структура полного генома или нуклеотидная последовательность участка гена, кодирующая белок NS5, отнесённых в настоящий момент к данному роду. В результате филогенетического анализа по участку гена NS5 можно утверждать, что вирус Карши принадлежит к антигенному комплексу клещевого энцефалита [58]. Оказалось, что изучаемые штаммы вируса Карши наиболее близки к малоизученному вирусу Royal Farm. Вероятно, вместе они образуют отдельный кластер внутри антигенного комплекса клещевого энцефалита. Основываясь на филогенетическом анализе участка белка NS5, можно предположить, что рассматриваемые вирусы генетически удалены друг от друга на расстояния, превышающие межштаммовые различия. Так генетическое расстояние по этому участку между вирусом Royal Farm и Карши составила 13,6−13,9%, а между двумя предполагаемыми штаммами LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Тиг 3,0%.

Представляет интерес уточнение филогенетического положения вируса Карши внутри группы клещевого энцефалита. Вопрос об уровне различий антигенных вариантов вирусов ККЭ неоднократно дискутировался и до сих пор остаётся открытым. С этой целью мы проанализировали максимальное количество разнообразных штаммов и вирусов, известных на сегодняшний день. Оказалось, что штамм LEIV-2247 Uz имеет максимальную степень гомологии со штаммами Vasilchenko восточносибирского субтипа и Sofjin.

НО дальневосточного субтипа вируса ТВЕ (71,2%) и минимальную (69,8%) с вирусом Deer tick (штамм ctb30) и Louping ill (штамм 369/Т2). Максимальная степень гомологии штамма LEIV-7192 Tur была со штаммом Vasilchenko вируса ТВЕ (71,0%), а минимальная с вирусом Deer tick (69,5%). Разница значений гомологии вируса Карши с представителями антигенного комплекса, к которому он отнесён, составила 1,4−1,5%. Следовательно, можно предположить, что анализируемый вирус достаточно удалён от всех представителей своего серокомплекса и образует отдельную генетическую группу.

Не так давно вирус Карши наряду с вирусом Gadgets Gully был относён к различным субтипам вируса Royal Farm [44]. В результате филогенетического анализа оказалось, что значения дивергенции между вирусами Gadgets Gully и Карши (14,8−16%), Gadgets Gully и Royal Farm (16,3%), а также между Royal Farm и Карши (13−13,3%) значительно превышают показатели дивергенции между различными субтипами TBEV (2,7−7%) и сопоставимы с генетическими расстояниями между различными генетическими линиями в пределах ККЭ. Следовательно, все три вируса не являются субтипами одного вируса, каждый из них представляет собой отдельную генетическую линию. Тем не менее, к вирусу Карши наиболее близок вирус Royal Farm, выделенный в Афганистане.

Географическая удалённость штаммов вируса Карши, выделенных в Узбекистане и Туркмении, предполагала их различия в первичной структуре геномной РНК. Учитывая противоречия, которые возникли по вопросу классификации представителей данного комплекса, трудно оценить, основываясь лишь на иммунологических исследованиях, являются ли изоляты LEIV-2247 Uz и LEIV-7192 Tur генетическими разновидностями одного вируса Карши или же разными генетическими линиями. Генетическое расстояние, оцененное по полной первичной структуре генома, между штаммами вируса Карши (дивергенция 5,5%) сопоставимо с различиями между субтипами TBEV (дивергенция 4,9 — 7,1%). Следовательно, изоляты анализируемого вируса следует рассматривать как различные генотипы вируса Карши.

К сожалению, не для всех представителей анализируемой нами антигенной группы известна структура полного генома, поэтому многими исследователями для установления положения вирусов внутри антигенного комплекса клещевого энцефалита использовались аминокислотные или нуклеотидные последовательности генов Е и NS5 или даже их участков.

Для того чтобы ответить на вопрос о правомерности использования участка гена Е и NS5 для филогении, были сопоставлены данные филогенетических анализов по перечисленным генам с данными по полноразмерному геному. Корреляция между значениями дивергенции оказалась высокая, следовательно, эти данные позволяют с уверенностью говорить о правомерности использования нуклеотидных последовательностей генов Е и NS5 для естественной классификации вирусов комплекса клещевого энцефалита.

В международной базе данных Gen Bank по гену, кодирующему поверхностный гликопротеин (Е), опубликовано максимальное количество нуклеотидных и аминокислотных последовательностей различных штаммов и вирусов рассматриваемого комплекса. Филогенетический анализ с использованием нуклеотидных последовательностей всех известных представителей комплекса клещевого энцефалита достоверно подтвердил ранее изложенные в работе представления о положении внутри него вируса Карши.

С использованием данных о структуре геномов различных генотипов вирусов Карши был создан лабораторный вариант ОТ-ПЦР для выявления геномной РНК вируса Карши. Условия данного метода были оптимизированы, а система ОТ-ПЦР проверена на специфичность с различными представителями комплекса клещевого энцефалита.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Н.И., Львов Д. К., Кирющенко Т. В., Каримов С. К. и Роговая С.Г. Результаты серологических и вирусологических исследований птиц и млекопитающих на территории Южного Прибайкалья. // Медицинская паразитология. 1980. — Т.49. — № 2. -Стр. 27−29.
  2. В.И., Беликов С. И., Джиоев Ю. П., Демина Т. В., Козлова И. В. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита. Иркутск: РИО ВСНЦ СО РАМН, 2003. 272с.
  3. С.К., Кирющенко Т. В. К экологии вируса Карши и роли его в инфекционной патологии человека. // Экология вирусов. М. — 1980. -Стр 114−117.
  4. Клонирование ДНК. Методы. / Под редакцией Д. М. Гловера. М.: Мир, 1988, 538с.
  5. Д.К., Логинова Н. В., Лебедева Г. А., Дерябин П. Г., Парыгина М. М., Буйницкая О. Б. Биологические свойства и антигенные взаимосвязи флавивирусов Тюлений и Карши. // Вопросы вирусологии. 1994. — Т.39. — № 5. Стр. 205−208.
  6. О.В., Бахвалова В. Н., Добрикова Е. Ю., Максимова Т. Г. клеточные белки взаимодействуют с РНК вируса клещевого энцефалита. // Журнал инфекционной патологии. 1996. — Т. 3. — № 4. -С. 382−383.
  7. Ю.Сидорова Г. А., Андреев В. П. Некоторые черты экологии новых арбовирусов, выделенных в Узбекистане и Туркмении. // Медицинская паразитология. 1978. — № 3. — Стр. 108−114.
  8. Дж.Р. (Stephenson J.R.) Классификация флавивирусов, передающихся клещами. // Acta virology. 1989. — V. 33. — P. 471.
  9. И.И., Абрамова Л. Н., Савосина Н. С., Громашевский В. Л., Львов Д. К. Результаты заражения лабораторных животных и обезьян вирусом Карши. // Медицинская паразитология. 1989. — № 1. — Стр. 7174.
  10. Allison S.L., SchalichJ., StiasnyK., Mandl C.W., Heinz F.X. Mutational evidence for an internal fision peptide in flavivirus envelope protein E. // Journal of Virology. 2001. — V. 75. — P. 4268−4275.
  11. Allison S.L., StiasnyK., StadlerK., Mandl C.W. and Heinz F.X. Mapping of functional elements in the stem-anchor region of tick-borne encephalitis virus envelope protein E. // Journal of Virology. 1999. — V. 73. — P. 56 055 612.
  12. Amberg S.M., Nestorowicz A., McCourtD.W., Rice C. NS2B-3 proteinase-mediated processing in the yellow fever virus structural region: In vitro and in vivo studies. // Journal of Virology. 1994. — V. 68. — P. 3794−3802.
  13. Bazan J.F., Fletterick R.J. Detection of a trypsin-like serine protease domain in flaviviruses and pestiviruses. // Virology. 1989.-V. 171.-P. 637−639.
  14. Burke D.S., Monath T.P., Flaviviruses. In: Knipe, D.M., Howley, P.M. (Eds.), Fields' Virology, 4th ed. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia. 2001. — Vol. 1. — P. 1043−1125−1041.
  15. CahourA., PletnevA., Vazielle-Falcoz M., Rosen L, Lai C.J. Growth-restricted dengue virus mutants containing deletions in the 5' noncoding region of the RNA genome. // Virology. 1995. — V. 207. — P. 68−76.
  16. Calisher CH. Antigenic classification and taxonomy of flaviviruses (family Flaviviridae) emphasizing a universal system for the taxonomy of viruses causing tick-borne encephalitis. // Acta Virology. 1988. — V. 32. — P. 69 478.
  17. Cauchi M.R., Henchal E.A., Wright P.J. The sensitivity of cell-associated dengue virus proteins to trypsin and the detection of trypsin-resistant fragments of the nonstructural protein NS1. // Virology. 1991. — V. 180/ -P. 659−667.
  18. Cecilia D. and Gould E.A. Nucleotide changes responsible for loss of neuroinvasiveness in Japanese encephalitis virus neutrolization-resistant mutants.//Virology.- 1991.-V. 181.-P. 70−77.
  19. Chambers T.J., Nestorowicz A., Amberg S.M., Rice C.M. Mutagenesis of the yellow fever virus NS2B protein: Effects on proteolytic processing, NS2B-NS3 complex formation, and viral replication. // Journal General Virology. 1993. — V. 67. — P. 6797−6807.
  20. Charrel, R. N. de Lamballerie, X. The Alkhurma virus (family Flaviviridae, genus Flavivirus): an emerging pathogen responsible for hemorrhage fever in the Middle East. // Med Trop (Mars). 2003. — V. 63. — P. 296−299.
  21. Chen C.J., Kuo M.D., Chien L.J., Hsu S.L., Wang Y.M. and Lin J.H. RNA-protein interactions: involvment of NS3, MS5 and З'-noncoding regions of Japanese encephalitis virus genomic RNA. // Journal of Virology. 1997. -V. 71.-P. 3466−3473.
  22. Chen Woan-Ru, Tesh Robert B. and Rico-Henesse Rebecca. Genetic variation of Japanese encephalitis virus in nature. // Journal General Virology. 1990. — V. 71. — P. 2915−2922.
  23. Chomzcynski P., Sacchi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. // Anal Biochem. -1987. V.162. — P.156−159.
  24. Chu M.C., O’Rourke E.J., Trent D.W. Genetic relatedness among structural protein genes of denge 1 virus strains. // Journal General Virology. 1989. -V. 70.-P. 1701−1712.
  25. Droll D.A., Kirishna Murthy H.M., Chambers T.J. Yellow fever virus NS2B-3 protease: Charged-to-alanine mutagenesis and deletion analysis define regions important for protease complex formation and function. // Virology. 2000. — V. 275. — P. 335−347.
  26. Falgout В., MarkoffL. Evidence that flavivirus NS1-NS2A cleavage is mediated by a membrane-bound host protease in the endoplasmic reticulum. // Journal of Virology. 1995. — V. 69. — P. 7232−7243.
  27. Ескег M., Allison S.L., Meixner Т., Heinz F.X. Sequence analisis andgenetic classification of tick-borne encephalitis viruses from Europe and Asia. // Journal General Virology. 1999. — V. 80. — P. 179−185.
  28. Francki R.I.B., Fauquet C.M., Knudson D.L., Brown F. Classification and nomenclature of viruses: Fifth report of the international committee on taxonomy of viruses. // Archives of Virology Suppl. 1991. — V. 2. — P. 223.
  29. Gaidamovich S.Y., Melnicova Y.E., GresikovaM. et al. Two kind of monoclonalantibodies to tick-borne encephalitis virus. // Acta virology. -1986.-V. 30.-P. 206−212.
  30. Gresikova M., CalisherC.H. Tick-borne encephalitis. // The arboviruses: epidemiology and ecology. 1989. — V. 4. — P. 177−202.
  31. Gresikova M., SelkeyovaM. К антигенной классификации некоторых вирусов из комплекса клещевого энцефалита, исследованных с помощью моноклональных антител. // Acta virology. 1990. — V. 34. -P. 89−92.
  32. Gritsun T.S., Gould E.A. Infectious transcripts of tick-borne encephalitis virus, generated in days by RT-PCR. // Virology. 1995. — V. 214. — P. 611 618.
  33. Gritsun T.S., Lashkevich V.A., Gould E.A. Tick-borne encephalitis. // Antiviral Research. 2003. — V. 57. — P. 129−146.
  34. Gritsun T.S., Lashkevich V.A. and Could E.A., Nucleotide and deduced ammoacid sequence of the envelope glycoprotein of Omsk hemorrhagic fever virus comparison with other flaviviruses. // Journal of Virology. -1993.-V. 74.-P. 287−291.
  35. Hahn C.S., HahnY.S., Rice C.M., LeeE., Dalgarno L., Strauss E.G., Strauss J.H. Conserved elements in the 3' untranslated region of flavivirus RNAs and potential cyclization sequences. // Journal Molecular Biology. -1987.-V. 198.-P. 33−41.
  36. Heinz F.X., Berger R., Tuma W. and Kunz C. A topological and functional of epitopes on the structural glycoprotein of tick-borne encephalitis virus defined by monoclonal antibodies. // Virology. 1983. — V. 126. — P. 525 537.
  37. HeinzF.X. Epitope mapping of Flavivirus glycoproteins. // Adv. Virus Research. 1986. — V. 31. — P. 103−168.
  38. Heinz F.X., Allison S. The machinery for Flavivirus fusion with host cell membranes. // Current Opinion in Microbiology. 2001. — V. 4. — P.450−455.
  39. JanL.R., YangC.S., Trent D.W., FalgoutB. and Lai C.J. Processing of Japanese encephalitis virus non-structural proteins: NS2B-NS3 complex and heterologous proteases. // Journal of General Virology. 1995. — V. 76. -P. 573−580.
  40. Khromykh A.A., Westaway E.G. Subgenomic replicons of the flavivirus Kunjin: Construction and applications. // Journal of Virology. 1997. -V.71.-P. 1497−1505.
  41. Kimura-Kuroda J. and Yasui K. Antigenic comparison of envelope protein E between Japanese encephalitis virus and some other flaviviruses using monoclonal antibodies. // Journal of General Virology. 1986. — V. 67. -P. 2663−2672.
  42. Koonin E.V. Computer-assisted identification of a putative methyltransferase domain in NS5 protein of flaviviruses and lambda 2protein of reovirus. // Journal of General Virology. 1993. — V. 74. -P. 733−740.
  43. Kuno G, Artsob H., Karabatsos N., Tsuchiya K.R. and Chang J.J. Genomic sequencing of Deer tick virus and phylogeny of Powassan-related viruses of North America. // The American journal of tropical medicine and hygiene. -2001.-V. 65. P. 671−676.
  44. Kuno G, Chang GJ, Tsuchiya KR, Karabatsos N., Cropp C.B. Phylogeny of the genus Flavivirus. // Journal of Virology. 1998. — V. 72. — P. 73−83.
  45. Lamballerie X., Crochu S., Billoir F., neyts J., Micco P., Holmes E.C. and Dould E.A. Genome sequence analysis of Tamana bat virus and its relationship with the genus Flavivirus. // Journal General Virology. 2002. -V. 83.-P. 2443−2454.
  46. Lanciotti R.S., Gubler D.J., Trent D.W. Molecular evolution and phylogeny of denge-4 viruses. // Journal of Virology. 1997. — V. 78. — P. 2279−2286.
  47. Lanciotti R.S., Kerst A.J. Nucleic acid sequence-based amplification assays for rapid detection of West Nile and St. Louis encephalitis viruses // Journal of Clinical Microbiology. 2001. — Vol. 39. — № 12. — P. 4506−4513.
  48. Lanciotti R.S., Lewis J.A., Gubler D.J., Trent D.W. Molecular evolution and epidemiology of denge-3 viruses. // Journal of Virology. 1994. — V. 75. -P. 65−75.
  49. Lee E., Stocks C.E., Amberg S.M., Rice C.M., LobigsM. Mutagenesis of the signal sequence of yellow fever virus prM protein: Enhancement of signalase cleavage in vitro is lethal for virus production. // Journal Virology. -2000.— V. 74.-P. 24−32.
  50. Lewis J.A., Chang G.-J., Lanciotti R.S. Kinney R.M., Mayer L.W. Trent, D. W. Philogenetic relationships of denge-2 viruses. // Virology. 1993. — V. 197.-P. 216−224.
  51. Li Li, Rolin Pierre E., Nichol Stuart Т., Shope Robert E., Barrett Alan D.T. and Holbrook Michael R. Molecular determinants of the tick-borne flavivirus Omsk hemorrhagic fever virus. // Journal General Virology. -2004.-V. 85.-P. 1619−1624.
  52. Lin Di, Li Li, Dick Daryl, Shope Robert E., Feldmann Heinz, Barrett Alan D.T. and Holbrook Michael R. Analysis of the complete genome of the tick-borne flavivirus Omsk hemorrhagic fever virus. // Virology. 2003. — V. 313. — P. 81−90.
  53. Lindenbach B. D, Rice C.M. Flaviviridae: The Viruses and Their Replication. In: Knipe D.M., Howley P.M. (Eds.), Fields' Virology, 4th ed. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia. 2001. — Vol.1. — P. 9 911 041.
  54. Lindenbach B. D, Rice C.M. Trans-complementation of yellow fever virus NS1 reveals a role in early RNA replication. // Journal of Virology. 1997. -V. 71.-P. 9608−9617.
  55. Lindenbach B. D, Rice C.M. Genetic interaction of flavivirus nonstructural proteins NS1 and NS4A as a determinant of replicase function. // Journal of Virology. 1999. — V. 73. — P. 4611−4621.
  56. LvovD.K., NeronovV.M., Gromashevsky V.L., Skvortsova T.M., Berezina L.K., Sidorova G.A., Zhmaeva Z.M., Gofman Yu.A.,
  57. S.M., Fomina K.B. «Karshi» virus, a new Flavivirus (Togaviridae) isolated from Ornithodoros papillipes (Birula, 1895) ticks in Uzbek S.S.R. // Archives of Virology. 1976. — V. 50. — P. 29−36.
  58. Mackenzie J.M., Khromykh A.A., Jones M.K., Westaway E.G., Subcellular localization and some biochemical properties of the flavivirus Kujin nonstructural proteins NS2A and NS4A. // Virology. 1998. — V. 245. -№ 2.-P. 203−215.
  59. Mandl C. W, Guirakhoo F., Holzman H., Heinz F.X. and Kunz C. Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level, using tick-borne encephalitis virus as a model. // Journal Virology. 1989. — V. 63.-P. 564−571.
  60. Mandl C. W, Heinz F.X., Stockl E, Kunz C. Genome sequence of tick-borne encephalitis virus (Western subtype) and comparative analysis of nonstructural proteins with other flaviviruses. // Virology. 1989. — V. 173. -P. 291−301.
  61. Mandl C. W, Holzmann H, Kunz C. and Heinz F.X. Complete gemomic sequence of Powassan virus: evaluation of genetic elements in tick-borne versus mosquito-borne flaviviruses. // Virology. 1993. — V. 194. — P. 173 184.
  62. Mandl C.W., Iacono-Connoris L., Wallner G. et al. Sequence of the genes encoding the structural proteins of the low-virulence tick-borne flaviviruses Langat TP21 and Yelantsev. // Virology. 1998. — V. 72. — P. 2132−2140.
  63. Marin M.S., Mandl C.W., Kunz C. and Heinz F.X. The flavivirus 3'-noncoding region extensive size heterogeneity independent of evolutionaryrelationships among strains of tike-borne encephalitis virus. // Virology. -1995.-V. 213.-P. 160−178.
  64. Marin M.S., McKenzie J., Gao G.F., Antoniadis A. and Gould E.A. The virus causing encephalitis group. // Research Vet. Sci. 1995. — V. 58. — P. 11−13.
  65. Markoff L., Falgout В., Chang A. A conserved internal hydrophobic domain mediates the stable membrane integration of the dengue virus capsid protein. // Virology. 1997. — V. 233. — P. 105−117.
  66. Mc Minn P.C., Marshall I.D., Dalgorno L. Neurovirulence and neuroinvasivenes of Murrey Valley encephalitis virus mutants selected by passage in a monkey kidney cell line. // Journal General Virology. 1995. -V. 76.-P. 865−872.
  67. Mc Minn P.C., Weir R.S. and Dalgarno L. A mouse attenuated envelope protein variant of Murray Valley encephalitis virus with altered fusion activity. // Journal of General Virology. — 1996. — V. 77. — P. 2085−2088.
  68. Modis Y., Ogata S., Clements D. and Harrison S.C. Variable surface epitopes in the crystal structure of Denge virus type 3 envelope glycoprotein. // Journal of Virology. 2005. — V. 79. — № 6. — P. 3448−3458.
  69. Nam J.H., Chung Y.J., Ban S.J., KimE.J., ParkY.K., Cho H.W. Envelope gene sequence variation among Japanese encephalitis virus isolated in Korea. // Acta virology. 1996. — V. 40. — P. 303−309.
  70. Ni H., Barret A.D.T. Nucleotide and deduced amino acid sequence the structural proteins genes of Japanese encephalitis virus from different geographic location. // Journal General Virology. 1995. — V. 76. — P. 401 407.
  71. NowakT., Wengler G. Analysis of disulphides present in the membrane proteins of the West Nile Flavivirus. // Virology. 1987. — V. 156. — P. 127 137.
  72. Proutski V, Gould EA, Holmes EC. Secondary structure of the 3' untranslated region of flaviviruses: Similarities and differences. // Nucleic Acids Research. 1997. -V. 25. — P. 1194−1202.
  73. Rauscher S, FlammC, Mandl C.W., Heinz F.X., StadlerP.F. Secondary structure of the З'-noncoding region of flavivirus genomes: Comparative analysis of base pairing probabilities. // RNA. 1997. — V. 3. — P. 779−791.
  74. Rey F.A., Heinz F.X., Mandl C.W., Kunz C., Harrison S.C. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2A resolution. // Nature. -1995.-V. 375.-P. 291−298.
  75. Rice C.M., benches E.M., Eddy S.R., Shin S.J., Sheets R.L., Strauss J.H. Nucleotide sequence of yellow fever virus: Implications for flavivirus gene expression and evolution. // Science. 1985. — V. 229. — P. 726−733.
  76. Robbins J., Dilworth S. M., Laskey R. A., Dingwall C. Two interdependent basic domains in nucleoplasmin nuclear targeting sequence: identification of a class of bipartite nuclear targeting sequence. // Cell. 1991. — V.64. -P.615−623.
  77. Roehrig J.T., Mathews J.H. and Trent D.W. Identification of epitopes on the E glycoprotein of Saint Louis encephalitis virus using monoclonal antibodies. // Virology. 1983.-V. 128.-P. 118−126.
  78. Shamanin V.A., PletnevA.G., Rubin S.G., ZlobinV.I. Differentiation of strains of tick-borne encephalitis virus by means of RNA-DNA hybridization. // Journal General Virology. 1990. — V. 71. — P. 1505−1515.
  79. Shju S.Y.W., Aires M.D. and Gould F.A. Genomic sequence of the structural proteins of Louping ill virus: comparative analysis with tick-borne encephalitis virus. // Virology. 1991. — V. 180. — P. 411−415.
  80. SimmondsP., Smith D.B., McOmishF., Yap P.L., KolbergJ., Urdea M.S. and Holmes E.C. Identification of genotypes of hepatitis С virus by sequence comparison in the core, El, and NS5 regions. // Journal General Virology. 1994.-V. 75.-P. 1075−1061.
  81. Stadler K., Allison S.L., Schalich J., Heinz F.X. Proteolytic activation of tick-borne encephalitis virus by fiirin. // Journal Virology. 1997. -V. 71.-P. 8475−8481.
  82. Telford S., Armstrong P.M., Katavolos P., FoppaL, Olmrda Garcia A.S., Wilson M.L. and Spielman A. A new tick-borne encephalitis-like virus infecting New England deer ticks, Ixodes dammini. // Emerging Infection Disease. 1997. — V. 3. — P. 165−170.
  83. Twiddy Susanna S. and Holmes Edward C. The extent of homologous recombination in members of the genus Flavivirus. // Journal General Virology. 2003. — V. 84. — P. 429−440.
  84. Van Regenmorel M.H.V. Virus species, a much overlooked but essential concept in virus classification. // Intervirology. 1990. — V. 31. — P. 241−254.
  85. VenugopalK., Buckley A., ReidH.W. and Gould E.A. Nucleotide sequence of the envelope glycoprotein of Negishi virus shows a close homology to Louping ill virus. // Virology. 1992. — V. 190. — P. 515−521.
  86. WenglerG., WenglerG. The NS 3 nonstructural protein of flaviviruses contains an RNA triphosphatase activity. // Virology. 1993. -V. 197.-P. 265−273.
  87. Wengler G., Wengler G., Gross H.J. Studies on virus-specific nucleic acids synthesized in vertebrate and mosquito cells infected with flaviviruses. // Virology. 1978. — V. 89. — P. 423−437.
  88. Westaway E.G., BrintonM.A., Gaidamovich S.Y., Horzinek M.C., Igarashi A., Kaariainen L., Lvov D.K., Porterfield J.S., Russell P.K., Trent D.W. Flaviviridae. // Intervirology. 1985. — V. 24. — P. 183−192.
  89. Westaway E.G., Khromykh A.A., KenneyM.T., Mackenzie J.M., Jones M.K. Proteins С and NS4B of the flavivirus Kunjin translocate independently into the nucleus. // Virology. 1997. — V. 234. — P. 31−41.
  90. Winkler G., Randolph V.B., Cleaves G.R., Ryan Т.Е., StollarV. Evidence that the mature from of the Flavivirus nonstructural protein NS1 is a dimmer.//Virology. 1988.-V. 162.-P. 187−196.
  91. Yamshchikov V.F., Trent D.W., Compans R.W. Upregulation of signalase processing and induction of prM-E secretion by the flavivirus NS2B-NS3 protease: Roles of protease components. // Journal Virology. -1997.-V. 71.-P. 4364−4371.
  92. ZengL, FalgoutB, MarkoffL. Identification of specific nucleotide sequences within the conserved З'-SL in the dengue type 2 virus genome required for replication. // Journal Virology. 1998. — V. 72. — P. 7510— 7522.
Заполнить форму текущей работой

На отлично!