Свободнорадикальные процессы в пространственно-временной регуляции развития низших позвоночных

2.1. Радиочувствительность зародышей и личинок травяной лягушки. 92.

2.2. Чувствительность эмбриональных зачатков к локальному лазерному облучению.97.

2.3. Чувствительность зародышей к химическим воздействиям.107.

2.4. Гравитационная чувствительность зародышей амфибий.112.

Клиностатирование зародышей амфибий различного возраста.112.

Возможные причины аномалий развития.116.

2.5. Чувствительность зародышей амфибий к сверхмалым дозам биологически активных веществ. 123.

2.6. Модификации морфогенеза как средство изучения механизмов развития. 125.

2.7. Развитие стрессовой реакции во времени. 126.

Заключение

130.

Глава 3. СПОСОБЫ БИОТЕСТИРОВАНИЯ ЗАГРЯЗНЕНИЙ.

ВОДНОЙ СРЕДЫ НА ОСНОВЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО КРИТЕРИЯ И ПРИНЦИПЫ ЭМБРИОМОНИТОРИНГА. 131.

Введение

131.

3.1. Методологический подход: биоиндикация загрязнения водной среды по метаболическому критерию. 132.

3.2. Регламент биотестирования. 141.

3.3. Проведение токсикологических исследований на дафниях. 143.

3.4. Определение концентрационных зависимостей эффекта метилурацила фармакопейного на показатели физиологического состояния дафний: уровень свободнорадикальных реакций, скорость роста и плодовитость. 145.

Заключение

149.

3.5. Применение метода привитой сополимеризации для оценки загрязнения водной среды на примере легочных моллюсков. 150.

3.6. Морские и пресноводные биотесты. 155.

3.7. Метаболический критерий для оценки жизнеспособности репродуктивного материала ценных видов рыб после криоконсервации. 160.

3.8. Принципы эмбриомониторинга водной среды. 163.

Глава 4. БИОТЕСТИРОВАНИЕ ПРИРОДНЫХ ВОДОИСТОЧНИКОВ.

НА ОСНОВЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО КРИТЕРИЯ. 165.

4.1. Биотестирование сточных вод производства целлюлозы методом радикальной сополимеризации. 165.

4.2. Биотестирование природных вод Восточного Казахстана. 171.

Обсуждение результатов. «Экологический диагноз» г. Зыряиовска. 195.

4.3. Биотестирование природных вод в респ. Мордовия, в районах, подвергшихся воздействию радиоактивных выпадений после аварии Чернобыльской АЭС. 198.

Результаты биотестирования интегральной токсичности воды по метаболическому критерию. 198.

Выводы.204.

4.4. Биологический контроль экологического состояния природных вод в районе расположения предприятия атомной промышленности.209.

Результаты исследования и их обсуждение.212.

Заключение

213.

Глава 5. ЯВЛЕНИЯ САМООРГАНИЗАЦИИ В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ.

РОЛЬ ДИНАМИЧЕСКОГО ХАОСА В РАЗВИВАЮЩИХСЯ.

СИСТЕМАХ.214.

5.1. Явления самоорганизации в эмбриогенезе.214.

5.2. Роль динамического хаоса в развитии.216.

ВЫВОДЫ.218.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК.221.

Публикации О. П. Мелеховой по теме диссертации.245.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Последние десятилетия в развитии эмбриологии ознаменованы большими успехами в генетическом анализе эмбриогенеза. Основные представления о формировании пространственной организации эмбрионального организма сводятся к тому, что в зиготе существует неравномерное распределение морфогенов — материнских белков — специфически включающих определенные группы генов, продукты которых в свою очередь служат регуляторами следующих фаз развития. Обнаружено существование некоторых морфогенов в неактивной форме, так что для начала их действия необходим дополнительный механизм активации (например, путем ограниченного протеолиза, высвобождающего активные центры мор-фогена). Позже координирующим механизмом развития становятся индукционные взаимодействия зачатков.

Наследуются не только морфологические черты организма, но и сама динамическая картина его развития. Если первая наследственная программа может быть описана через ключевые моменты, связанные с дифференциальной экспрессией специфических генов в определенных зачатках зародыша, то вторая программа, определяющая пространственно-временную организацию развития, не ясна. По-видимому, она носит эпигеномный характер и определяет время и место активации экспрессии генов, закономерности формирования компетенции и время детерминации эмбриональных зачатков. Многими экспериментами показано, что такие регулирующие факторы заложены уже в цитоплазме зиготы, однако не известно, каким образом в реализации пространственно-временной программы развития сочетаются принципы генетического детерминизма и самоорганизации.

Начальные условия и параметры порядка пространственно-временной программы индивидуального развития организма не ясны. Задача их определения актуальна не только с точки зрения моделирования основных процессов эмбриогенеза — клеточного размножения, цитодифференцировки и морфогенеза — и познания механизмов их координации, но также и с практической целью определения причин и прогноза возникновения аномалий развития и эмбриональной смертности.

Информационный обмен, присущий всем живым системам, приводит не только к изменению ее специфических особенностей, связанных с определенными наборами структур и ферментов, но и к регуляции ее энергетического состояния. Нами был выбран один из показателей клеточного метаболизма: уровень свободнорадикальных (СР) процессов. Можно считать, что этот показатель отражает скорость энергетического протока в клетке. Окислительные процессы, протекающие в организме с участием свободных радикалов — активных форм кислорода (АФК) — привлекают в последние годы большой интерес. Развиваются представления о системе окислительно-восстановительного гомеостаза клетки, в которую включены сигнальные АФК, ферментные комплексы митохондрий, мик-росом и ядра, генерирующие АФК, ферментативные и низкомолекулярные анти-оксиданты. Под действием АФК перестраивается и физико-химическая система регуляции клеточного метаболизма мембранами, в результате изменяется функциональная активность клетки (Бурлакова и др., 2001). Полагают, что АФК могут выступать как субклеточные посредники в регуляции экспрессии генов (Allen, Baiin, 1989), что было показано и нами (Мелехова, 1976, 1977). Особенностью свободнорадикальных (СР) реакций является высокий энергетический выход, зачастую сопровождаемый хемилюминесценцией. Предполагают, что АФК могут играть сигнальную роль (Saran, Bors, 1989; Воейков, 2000) и также характеризовать уровень энергетических процессов в клетке (Кометиани, Каюшин, 1964; Дмитриев, 1997). Свободные радикалы возникают в нормальном метаболизме, а также характеризуют ранние этапы повреждения клеток при любых патологиях («окислительный стресс»).

Современные достижения генетики развития ставят перед нами задачу выяснения механизмов связи СР-реакций как параметра окислительно-восстановительного гомеостаза и энергообмена клетки с процессами регуляции экспрессии генов.

Цель и задачи исследования

.

Работа посвящена обоснованию координационной роли свободнорадикальных процессов в эмбриогенезе как пермиссивного фактора детерминации эмбриональных зачатков. Этот фактор может определять созревание компетенции в раннем развитии (период предетерминации) и готовности к структурно-функциональным перестройкам клеток перед началом специализации. Основные задачи работы заключались в том, чтобы.

• получить карты распределения относительных концентраций СР в клеточных популяциях зародыша на последовательных стадиях развития.

• исследовать субклеточную локализацию и биохимические субстраты СР реакций.

• исследовать механизмы дифференциальной чувствительности эмбриональных зачатков к повреждениям.

• применить полученные данные для биотестировапия качества водной среды.

Научная новизна и практическое значение.

В работе впервые показано фундаментальное значение флуктуаций энергетического метаболизма для формирования компетенции эмбриональных зачатков и их чувствительности к слабым повреждающим воздействиям, соответствующей периодам детерминации.

Впервые применен оригинальный экспериментальный подход, позволивший обнаружить универсальный неспецифический механизм детерминации, включающей развитие свободнорадикальных реакций и лежащий в основе повышенной чувствительности. В серии многолетних исследований автором был открыт универсальный метаболический параметр, характеризующий эмбриональные клетки в периоде детерминации — активное развитие свободнорадикальных процессов. Модифицированная автором для эмбриональнальных объектов (амфибии, рыбы) методика радиоавтографического выявления свободных радикалов (Козлов, 1970, 1973) является универсальным способом исследования детерминирующихся эмбриональных зачатков in situ без использования традиционных для этой цели приемов микрохирургии Результаты исследований раннего развития амфибий, в которых использовался этот метод, позволили сформулировать гипотезу о ключевой роли свободнорадикальных реакций в пространственно-временной координации процессов морфогенеза и цитодифференцировки в эмбриогенезе (Мелехова, 1976, 1977, 1990). На основе этих и других исследований (Остроумова, Белоусов, Михайлова, 1977) была разработана модель параметрического управления дифференцировкой (Chernavskii, Solyanik, Belousov, 1980), которая акцентирует внимание на возможной роли неспецифического метаболизма в начальной дивергенции клеточной популяции.

Проблема эпигенетической программы раннего развития имеет фундаментальное теоретическое значение. Исследование механизмов такой программы важно также в практическом плане для понимания причин аномалий развития и эмбриональной смертности.

Экспериментальная часть работы представляет собой исследование приоритетного характера, что подтверждено авторскими свидетельствами и патентами. Разработаны и запатентованы способы оценки жизнеспособности репродуктивного материала гидробионтов и биотестирования качества природной среды. Результаты работы применены в области биотехнологии для оценки методов и условий культивирования и консервации репродуктивного материала животных, а также в области экологической экспертизы природных водоисточников и качества очистки сточных вод. Материалы диссертации включены автором в лекционные курсы.

Материал диссертационной работы представляет оригинальное направление в области теоретической и экспериментальной эмбриологии, которое открывает также новые пути в исследовании механизмов влияния экологических факторов на эмбриогенез.

Положения, выдвигаемые на защиту.

1. Свободнорадикальные процессы участвуют в пространственно-временной регуляции эмбриогенеза в периодах предетерминации и преддифференци-ровки как факторы, определяющие компетенцию клеток и готовность к активному синтезу специфических продуктов.

2. Существенную роль в инициации процессов дифференцировки в эмбриогенезе вносят свободнорадикальные процессы в фосфоинозитидах и цепях трансдукции сигналов от мембраны к ядру.

3. Биохимический фон чувствительности детерминирующихся эмбриональных клеток к повреждающим агентам включает исходно повышенный уровень и неравновесное распределение CP-реакций в эмбрионах.

4. Модификации эмбрионального развития гидробионтов могут служить для оценки загрязнения водной среды, а также для тестирования биологической активности различных факторов и могут применяться в системе биомониторинга.

Реализации результатов работы.

По результатам работ получены следующие авторские свидетельства и патенты:

1. Мелехова О. П., Бузинова Н. С., Колосова J1.B., Коссова Г. В. Способ биоиндикации загрязнения водной среды. // Авт. свид. № 1 546 904, 1988 г.

2. Лазарев В. В., Мелехова О. П., Цаплин B.C., Яресько Ю. И. Способ определения жизнеспособности эмбрионов рыб. //Авт. свид. № 1 409 179, 1988 г.

3. Мелехова О. П., Коссова Г. В. Способ определения эмбриотоксичности химических соединений и их комплексов. // Патент № 2 073 868 от 20.02.1997.

4. Мелехова О. П., Цветкова Л. И., Докина О. В., Пронина Н. Д., Коссова Г. В., Падалка С. М., Миленко В. М. Патент на изобретение «Способ определения жизнеспособности спермы рыб после криоконсервации». // Патент № 2 233 142, Бюл. № 21 от 27.07.2004 г. Справка о приоритете от 21.01.2003 г.

Имеется акт о внедрении изобретения № 1 546 904 на Байкальском целлюлозно-бумажном комбинате для оценки качеств очистки сточных вод: Акт о внедрении изобретения (авт. свид. № 1 546 904) на БЦБК для тестирования сточных вод БЦБК, а также некоторых флоккулянтов от 10.04.90.

Получены также справки о приоритете:

1. Мелехова О. П. Способ определения действующей дозы электромагнитного излучения на эмбрионах водных животны. // Справка о приоритете № 9 300 2686(2 367 HB).

2. Мелехова О. П. Способ отбора клеточных тест-систем для оценки повреждающего воздействия электромагнитного излучения. // Справка о приоритете № 93 002 686 (366 HB).

Разработанные методы применены в комплексной экологической экспертизе:

• В Восточном Казахстане (по итогам экспертизы имеется доклад экспертов правительству Республики Казахстан);

• В республике Мордовия (по заказу республиканского Министерства экологии, по результатам экспертизы представлен отчет экспертов);

• В районе расположения предприятия атомной промышленности (г. Обнинск).

Апробация работы.

VI Всесоюзное совещание эмбриологов, Москва, 1981 г.- I Всесоюзный биофизический съезд, Москва, 1982 г.- VII Всесоюзное совещание эмбриологов, Ленинград, 1986 г.- III совещание по применению лазеров в биологии и медицине, Москва, 1983 г.- симпозиум СЭВ «Свободные радикалы и биостабилизация», София, Болгария, 1987 г.- Всесоюзный симпозиум по биохимии липидов, Алма-Ата, 1987 г.- International Conference on Regulation of FR-reactions, Varna, Bulgaria, 1989; III Всесоюзная конференция по хронобиологии, Ташкент, 1990 г.- Regional meating of Internation Union of Physiological sciences, Prague, 1991; I Biophysician Congress of Turkey, 1991; Международная конференция «Фундаментальные аспекты охраны окружающей среды и экология человека», Томск, 1995 г.- Международная конференция «Биоразпообразие наземных и почвенных беспозвоночных на Севере», Сыктывкар, 1999 г.- Международная научно-практическая конференция «Экология речных бассейнов», Владимир, 1999 г.- Международная конференция «Новое в экологии и безопасность жизнедеятельности», СПб, 2000 г.- Российская конференция «Радиохимия-2000», СПб, 2000 г.- Международная конференция «Эпергетика-2000», Обнинск, 2000 г.- III Всероссийская конференция «Физические проблемы экологии», Москва, 2001 г.- II Международный симпозиум по биоиндикаторам, Сыктывкар, 2001 г.- Международный конгресс «Экватек-2002», Москва, 2002 г.- Международная конференция «Новые технологии в защите биоразнообразия в водных экосистемах», Москва, 2002 г.- Международная конференция «Разнообразие и управление ресурсами животного мира в условиях хозяйственного освоения европейского севера», Сыктывкар, 2002 г.;

Международная конференция «Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных», Саранск, 2005 г.- Международный конгресс «ВэйстТэк 2005», Москва, 2005 г.- III Международная конференция «Электромагнитные излучения в биологии», Калуга, 2005 г.

ПРОБЛЕМА ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ РАЗВИТИЯ. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Упорядоченность и организованность являются важнейшими фундаментальными свойствами живых систем. Исследование этих свойств имеет основополагающее значение для понимания процессов индивидуального развития. Эти явления начали исследовать на современной научной основе лишь к середине XX в. Первая половина XX в. в биологии развития прошла под флагом физико-химических идей. Исследования целостности развития организмов как перехода из более вероятного состояния в менее вероятное (более организованное) приводили некоторых исследователей к противопоставлению физических и биологических закономерностей. Процессы интеграции, регуляции и управления в эмбриогенезе получили новое освещение с развитием теории информации, кибернетики, синергетики, термодинамики открытых неравновесных систем. В последние десятилетия достижения генетики развития и молекулярной биоэнергетики позволяют подойти к новому уровню понимания координационных механизмов в эмбриогенезе.

Развитие многоклеточного организма характеризуется тремя видами закономерно сочетающихся необратимых процессов: ростом и делением клеток, специализацией клеток (цитодифференцировкой) и становлением формы отдельных органов и всего организма (морфогенезом).

Эмбриональное развитие животных протекает с обязательной сменой фазкрупных периодов, каждый из которых характеризуется определенными гомео-статическими механизмами.

Эти фазы связаны с созданием «барьеров необратимости» и последовательно определяют биологический возраст, то есть, соответствующие морфо-физиологические состояния эмбриона, а именно:

• в пределах первой фазы (дробления) клеточные деления приводят к появлению многоклеточного эмбриона (бластула);

• клеточные популяции различного качества появляются в следующей фазегаструляции;

• у позвоночных в фазе нейруляции появляется осевой зачаток;

• в пределах следующей фазы (органогенез), происходит дифференцировка, которая приводит к формированию органов.

Вслед за этим низшие позвоночные вылупляются из капсулы, чтобы начать период личиночной жизни с активным движением и питанием. Каждый переход между фазами связан с возникновением состояния неустойчивости к внешним воздействиям и повышенной восприимчивости к повреждениям. Таким образом, упомянутые переходы можно считать критическими периодами развития (8Шс-сатй, Светлов, 1978, Пучков, 1978, Гилберт, 1993). Ч. Х. Уоддингтон (Vaddington, 1962) представлял развитие как «морфогенетический ландшафт», в котором периоды широких потенций, детерминации и чувствительности к внутренним и внешним воздействиям чередуются с периодами устойчивого программированного развития.

Эти разномасштабные процессы в живом зародыше должны быть объединены системой регуляций на организменном уровне, корректирующих субклеточные процессы таким образом, что обеспечивается закономерность смены фаз развития и интеграция процессов дифференцировки и морфогенеза. Эта система регуляций обеспечивает целостность развития организма зародыша и его реакций на внешние воздействия.

Одним из основных вопросов, волнующих исследователей, был и остается до сих пор вопрос о том, насколько преформирован (генетически детерминирован) процесс развития организма? В последние годы, в связи с развитием нового направления науки — синергетики — этот вопрос приобрел несколько иное выражение и более широкий смысл: каким образом в развитии не только зародыша, но и любой живой системы, сочетаются принципы детерминизма и самоорганизации? На протяжении многих поколений эмбриогенез любого организма в основном воспроизводится с высокой точностью. Однако каждая отдельная группа клеток может вести себя не строго определенным образом. В соответствии с принципом детерминизма, пласт однородных клеток зародыша не может без внешнего стимула детерминироваться в двух разных направлениях. По принципу же самоорганизации в таком пласте может спонтанно возникать неоднородность.

Различные теории развития ищут объяснения явлениям различных иерархических уровней, представленных процессами разных временных и пространственных масштабов.

Причинно-следственные связи смены фаз развития изучаются на уровне целого организма, в масштабе всего эмбриогенеза или целой жизни. Термодинамические теории рассматривают весь процесс развития как эволюцию к термодинамически устойчивым состояниям (Бауэр, Пригожин, Зотин и др.).

Явления цитодифференцировки и морфогенеза могут быть исследованы на протяжении одной фазы развития, в отдельной клеточной популяции. Применение современного молекулярно-генетического анализа стало возможным в результате развития экспериментальных микрохирургических методов трансплантации и эксплантации зачатков и разработки моделей для исследований in vitro (обзоры: Михайлов, 1988, Гилберт, 1993 — 1995, Корочкин, 2002). Концепция дифференцировки как результата дифференциальной активности генов была разработана на основе опытов по трансплантации ядер, а также ДНК-РНК-гибридизации.

Тестирование морфогенетических свойств гетерогенных индукторов и ростовых факторов проводят in vitro на эксплантатах эктодермы ранней гаструлы амфибий. Разработка метода гибридизации нуклеиновых кислот in situ и методов иммуноферментного анализа сделала возможными успехи молекулярно-генетического исследования раннего развития.

С самого начала эмбрион представляет собой сложную систему: сама яйцеклетка обладает изначально неоднородной цитоплазмой, которая затем обеспечивает самоорганизацию сложной структуры организма в целом. Другими словами, формирование эмбрионального организма не нуждается в особом внешнем воздействии и, следовательно, может рассматриваться как самоорганизующийся объект.

Последние достижения эмбриологии связаны с генетическим анализом процессов развития. В эмбриогенезе параллельно идут процессы морфологического усложнения зародыша и прогрессивной спецификации (дифференцировки) каждого его зачатка. Гены, управляющие ранним развитием, можно условно подразделить на «гены разметки» (морфогенеза) и «гены специализации» (Нейфах, 1993). Первые обеспечивают процессы ограниченной диффузии морфогенов и триггерной реакции клеток (зачатков органов) на них, а вторые дифференциальную активность «генов роскоши» и синтез специфических белков, определяющих специализацию клеточных типов.

Сразу после оплодотворения начинается не только пространственная организация эмбриона, но и отсчет индивидуального времени его жизни. Отсчет индивидуального времени в эмбриогенезе связан с процессами двух типов: циклами клеточных делений («маятниковые часы») и ходом необратимых процессов («песочные часы») дифференцировки (специализации клеток), роста и морфогенеза.

Появление специфических типов клеток является очевидным результатом дифференциальной активности генов. В пространственно-временной организации дифференциальной транскрипции значительную роль играет открытая A.A. Нейфахом периодичность морфогенетической функции ядер (МФФЯ) (Нейфах, 1961, 1962). Речь идет о том, что (на фоне непрерывной транскрипции) информационная РНК, обеспечивающая формообразовательные процессы, синтезируется как бы «квантованно», в ограниченные промежутки времени. Именно эти периоды развития являются наиболее чувствительными к повреждающим факторам, как например, ингибиторы транскрипции, ионизирующая радиация. В раннем развитии периоды МФФЯ обеспечивают наступление следующей фазы развития всего зародыша, при подготовке органогенеза в каждом зачатке также проявляется такая периодичность МФФЯ (Корочкин, 2002). Таким образом, для эмбриогенеза характерна дифференциальная активность генов во времени и в пространстве. У зародышей низших позвоночных первый период МФФЯ отмечен на стадии бластулы, когда подготавливаются гаструляционные процессы. Чувствительность к повреждающему воздействию наиболее велика в период МФФЯ, а проявляется поражение позже — с началом гаструляции.

Явление МФФЯ объясняет с молекулярно-генетических позиций сущность критических периодов развития (Броун, 1897, Стоккард, 1921, Гольдшмидт, 1927, 1932, Светлов, 1978, Дыбан, 1968, Токин, 1987).

Пространственно-временная регуляция эмбриогенеза представляется, в мо-лекулярно-генетическом аспекте, как результат взаимодействия генетической программы клеток со специфическими регуляторами генной экспрессии, — так называемыми морфогенами, распределенными в зародыше неравномерно (Корочкин, 2000, Корочкин, Михайлов, 1999). В некоторых случаях исследователи обнаруживали гены и их продукты, которые управляли определенными морфоге-нетическими явлениями. Тем самым у некоторых животных была частично раскрыта детальная мозаичная картина причинно-пространственной организации.

По современным представлениям, дифференциальная экспрессия генов в эмбриогенезе носит многоуровневый характер. Регуляция осуществляется и на уровне транскрипции, и на уровне трансляции, и при посттрансляционных событиях (время жизни, активация, транспорт продуктов). На каждом уровне можно выделить «триггер» всего каскада процессов, активаторы и ингибиторы каждого звена. В итоге создается неравномерное распределение генопродуктов в зародыше — основа «позиционной информации».

1.2. Характерные особенности эмбриогенеза как модели развивающейся системы.

Считывание генетической информации при эмбриогенезе происходит постепенно и, первоначально, управляется архитектурой яйцеклетки. Только что оплодотворенная яйцеклетка уже имеет сложную структуру, в которой заложен план строения, — так называемый «паттерн» будущего организма. В этом паттерне намечены координатные оси и отделы организма и, следовательно, предопределено размещение основных актов дифференцировки.

Для всех многоклеточных (М^агоа), необходимой фазой развития является дробление, — быстрые клеточные деленияоно завершается при достижении определенного критического количества клеток. Предполагается, что появившиеся при этом клетки обладают широким выбором путей дифференцировки (широкими потенциями развития).

В пределах этой популяции клеток постепенно нарастает качественное разнообразиеначало процесса дифференцировки носит бифуркационный характер. Такое разнообразие впервые проявляется как только клетки приобретают количественные отличия в неспецифических свойствах, таких, как скорость деления, реакции на внутренние и внешние воздействия и общий уровень окислительных процессов.

Процесс дифференцировки (специализации) возможен только для группы клеток, чье количество достигло определенного критического значения. Диффе-ренцировка начинается с латентного периода — детерминации, при которой «судьба клетки» становится предопределенной на генном уровнепри этом потенциал развития уменьшается, хотя не видно ни биохимических, ни морфологических изменений. Для начального периода эмбриогенеза характерен заблаговременный синтез матриц, необходимых для наступающей фазы развития. Эти матрицы, способные к быстрой активации, до некоторого момента сохраняются в неактивном состоянии.

Типичным предвестником периода детерминации является состояние компетенции. В этом состоянии клетки чрезвычайно чувствительны к слабым стимулам и готовы реагировать на них переходом к дифференцировке. В состоянии компетенции клетки обладают широкими потенциями развития. Более того, клетки становятся чрезвычайно восприимчивыми по отношению к повреждающим воздействиям, так что судьба каждой клетки неопределенна и может меняться под влиянием ближайшей окружающей среды.

Состояние компетенции, то есть, особой чувствительности к стимулам, вызывающим дифференцировку, является эндогенным свойством. Оно возникает или угасает в прямой связи с возрастом этих клеток, то есть, на определенных стадиях развития эмбриона, и существует не синхронно во всех зачатках эмбриона. Один и тот же сигнал порождает различные реакции и специфические виды синтеза в клетках разной степени «зрелости», то есть различного биологического возраста. В настоящее время молекулярно-генетические аспекты этих явлений активно изучают. Вероятнее всего эти явления контролируются мембранными рецепторами, а также метаболическими факторами, обеспечивающими передачу сигнала в пределах данной клетки. При всех современных знаниях, мы по-прежнему не вполне понимаем природу эндогенных процессов, которые делают клетки компетентными по отношению к любому виду дифференцировки.

Дифференцировки, приводящие к появлению различных видов клеток и развитию органов, координируются в значительной мере через взаимные контакты: «старшие» зачатки индуцируют (инициируют) дифференцировку в «младших» зачатках. Важная роль в раннем эмбриогенезе принадлежит также явлению «позиционной информации» (Volpert, 1983; Оигс1оп е! а1., 1994, 1995, 1996). Благодаря последней, клетки дифференцируются в соответствии с их расположением в эмбрионе. Полагают, что градиенты распределения «морфогенов» (веществ, регулирующих экспрессию генов) между клетками, как и различия между последними в отношении пороговой чувствительности к этим «морфогенам», ответственны за различные направления дифференцировки.

Характерной для ранних фаз развития эмбриона является способность к «эмбриональной регуляции», выражающейся в восстановлении нормального пути развития вслед за устранением, перемешиванием или добавлением клеточного материала. Важно только чтобы позиционная информация была введена до того, как наступило состояние устойчивой детерминации клеточного материала.

Следует также должным образом учитывать основную макроскопическую динамику развития, сходную для различных видов животных. Мы полагаем, что место и время начала событий морфогенеза и дифференцировки, то есть, возникновения координированной иерархии органов, следует единой эпигеиомной пространственно-временной программе (Мелехова, 1990,1998,2000).

1.3. Термодинамические теории развития.

Э.С. Бауэр (Бауэр, 1930, 1935) построил общую теорию жизненных явлений.

— включая обмен веществ, раздражимость и возбудимость, онтогенез и филогенез.

— на основе единого термодинамического принципа — устойчивого неравновесия. Э. С. Бауэр показал, что, исходя из фундаментальных свойств живых систем, их прогрессивная эволюция направлена в сторону увеличения способности извлекать энергию из окружающей среды и превращать ее в энергию динамических струкур, способных совершать работу по поддержанию неравновесия со средой. Э. С. Бауэр считал, что процессы развития и роста организмов сопровождаются непрерывным уменьшением свободной энергии структур, т. е. удельной свободной энергии организма. Во время оогенеза происходит «перезарядка» организма и яйцеклетка приобретает более высокий потенциал (уровень свободной энергии структур). Общая же свободная энергия растет в процессе развития и роста, достигает максимума к моменту прекращения роста и затем начинает снижаться, при этом начинается старение. Термодинамика неравновесных состояний (в отличие от равновесной) использует понятия не энтропии и свободной энергии как таковые, а скорости изменения этих функций (т.е. продукция энтропии, уменьшение удельной свободной энергии и т. п.).

Приближение организмов в процессе развития и роста к равновесному состоянию Бауэр характеризует уменьшением удельной свободной энергии (соотнесенной с весом). Бауэр считал, что свободная энергия структур проявляется в особом активном «деформированном» состоянии живых белков. Действительно, энергия внутриклеточных структур зависит от их фосфорилированного состояния.

По современным представлениям центральным пунктом энергетики клеток является система АДФ ^ АТФ, выполняющая роль унифицированного аккумулятора энергии (Скулачев, 1969). Т. е. энергия пищи фиксируется вначале в виде свободной эиергии АТФ.

Изучение механизма окислительного фосфорилирования привело к появлению хемиосмотической теории, согласно которой энергия окислительных процессов сначала трансформируется в мембранных потенциал митохондрий, а затем переводится в энергию макроэргических связей АТФ (Скулачев, 1972; Рэкер, 1979; Николе, 1985 и др.). Бауэр также считал, что «деформированное» состояние белков является источником электрического мембранного потенциала. Таким образом, возможный путь экспериментальной проверки идей Э. Бауэра состоит в исследовании клеточных энергетических процессов в развивающемся организме. Содержание АТФ в клетках определяется скоростями ее сиитеза и распада. Скорости окислительных реакций, гликолиза, уровень потребления кислорода, концентрация АТФ в зародышах различных животных были предметом многих исследований, подтвердивших в основном правильность теории Э. Бауэра в приложении к процессам развития, роста и старения животных (Зотин, Зотина, 1993;).

Теория Пригожина-Виам (Prigogine, ¡-Угат, 1946, 1960). Эти исследователи предлагают принцип минимальной скорости продукции энтропии в стационарном состоянии и вводят понятие «критерий эволюции» открытых систем: изменение диссипативной* функции, связанной с термодинамическими потоками и силами.

В живых системах протекают одновременно десятки тысяч химических реакций и, соответственно, термодинамических процессов. Поэтому непосредственно исследовать изменения диссипативной функции в развитии не представляется возможным. Но поставщик энергии для всех метаболических процессовокислительные процессы и гликолиз (энергетический метаболизм). По энергетическому метаболизму можно судить о потенциальных возможностях системы диссипация — рассениедиссипировать энергию. To-есть можно представить удельную диссипативную функцию как величину пропорциональную интенсивиости потребления кислорода" и интенсивности гликолиза (Зотин, Зотина, 1993).? = qo2 + 4gi.

В аэробных условиях величина qgi пренебрежимо мала и критерий эволюции живых систем приобретет вид: dqo2 / dt < 0.

Согласно теории Пригожина-Виам развитие, рост и старение приближает организм к конечному стационарному равновесному состоянию и сопровождаются непрерывным уменьшением удельной продукции энтропии, диссипативной функции и, соответственно, удельной скорости теплопродукции организма. Эти представления были приняты многими биологами, хотя далеко не все экспериментальные факты укладывались в рамки этой теории. В раннем онтогенезе организмы представляют собой системы далекие от равновесия, и их поведение описывается нелинейными функциями.

В частности, на ранних стадиях онтогенеза многих животных были обнаружены максимумы показателей энергетического метаболизма (Озернюк, 1985, Озериюк, Леляпова, 1985).

С именем И. Р. Пригожина связано также представление о развитии как процессе самоорганизации, механизмом которого является образование «дисси-пативных структур» (Prigogine, Nicolis, 1971; Эйген, 1973, Николис, Пригожин, 1979; Пригожии, 1983; Николис, Пригожин, 2003). Суть этих представлений в том, что при возрастании неравновесности системы достигается порог стабильности, за которым обнаруживаются периодические или апериодические колебания, спонтанное нарушение пространственной однородности или образование упорядоченных структур. Устойчивость этих структур поддерживается протоком энергии через систему: притоком энергии (или оттоком из нее). Так как эти структуры возникают в открытых сильно неравновесных системах и сопровождаются интенсивной диссипацией энергии, они были названы «диссипативны-ми». Теория диссипативпых структур имеет термодинамическое обоснование и математический аппарат. Науку о самоорганизации называют также «Синергетикой» (Haken, 1973; Хакен, 1980). В этой актуальной области появляется много работ, связанных с моделированием процессов морфогенеза и дифференцировки в эмбриональном развитии.

Критерий эволюции по Пригожину-Виам основан на принципе минимальной скорости продукции энтропии? = min, тогда критерий эволюции d^F / dt < 0*. Этот критерий эволюции действителен для систем, близких к равновесию (или же слабо нелинейных). Он показывает, что в процессе изменения термодинами" Интенсивность — скорость потребления 02 единицей массы тела Уравнение второго начала термодинамики имеет вид: djS / dt > 0, где djS / dt — продукция энтропии. ческих систем происходит уменьшение интенсивности диссипации энергии, которая в стационарном состоянии достигает минимальной величины. В сильно нелинейных системах скорость диссипации может не быть постоянной (но так же стремится к минимальной).

Феноменологическая теория онтогенеза, разработанная А. И. Зотиным и его сотрудниками (Зотип, 1974, 1988, Зотин, Зотина, 1993), эта теория рассматривает развитие, рост и старение организмов, учитывая их основные особенности: открытость, нелинейность и «организованность» (т.е. наличие механизмов саморегуляции), причем используется понятие отрицательной энтропии — «негэнтро-пии» (Бриллюэн, 1960). Согласно теории А. И. Зотина, критерий эволюции живых нелинейных организованных систем включает колебания величины диссипатив-иой функции в стационарном состоянии, а также возможность длительного уклонения от стационарного состояния за счет негэптропийных эффектов или изменения внутренних параметров под действием управляющих систем. Таким образом допускается, что развитие является немонотонным процессом, проходящим через смену фаз и гомеостатических механизмов.

Предполагается, что для организма характерны два типа стационарных состояний: одно из них — устойчивое состояние в отдельный момент времени, другое — конечное стационарное состояние, к которому организм эволюционизирует в процессе жизни.

Предложено назвать процесс приближения организмов к конечному стационарному состоянию «конститутивным», а процессы временного уклонения и последующего восстановления текущего стационарного состояния — индуци-бельными (Озернюк и др., 1971, Огегпуик е1 а1., 1973). «Феноменологическая теория» на большом экспериментальном материале рассматривает все основные этапы и феномены развития: оогенез, эмбриогенез, рост, старение, регенерацию, канцерогенез.

Согласно этой теории процесс развития сопровождается общим снижением функции внешней диссипации. Но каждый новый организм должен иметь вначале достаточно высокий уровень этого процесса. «Перезарядка» происходит во время оогенеза, когда возникает эффект негэптропии, связанный с накоплением информации в ооцитах и усложнением их организации. В оогенезе таким образом происходит значительное конститутивное уклонение от состояния устойчивого неравновесия, однако это не противоречит законам термодинамики, т.к. устойчивое уклонение ооцитов от стационарного состояния может происходить за счет сопряженных процессов в других частях организма матери.

В период эмбриогенеза и перехода к личиночному состоянию также возможны периоды уклонения от стационарного состояния. В дальнейшем, с возрастом происходит постоянное снижение удельной диссипативной функции, нарушаемое процессами индуцибельного уклонения от стационарного состояния при повреждениях, при регенерации, а также при злокачественном росте. Эти явления отклонения от конститутивного приближения к стационарному состоянию рассматривают как случаи «омоложения» отдельных частей организма.

Последовательные приложения этой теории имеют практическое значение. Речь идет о «митохондриальной концепции» старения и канцерогенеза, открывающей некоторые перспективы борьбы с этими явлениями. Согласно этой концепции, митохондрии являются центральным звеном механизмов старения и омоложения живых систем. У аэробных организмов в периодах «конститутивного омоложения» (оогенез и начало постэмбрионалыюго периода) происходит увеличение количества митохондрий, концентрации митохондриальных мембран, активности дыхательных ферментов (Озершок, 1985, Озернюк и др., 1987, 2000). При канцерогенезе — возрастает количество дефектных митохондрий, ослабляется их функция. При старении уменьшение производства митохондриальных мембран и их функционирования является основной причиной снижения энергетического обеспечения организмов и снижения основного обмена (Зотин, Зотина, 1993), а в целом — ослабления гомеостаза. Одной из причин этого явления считают повреждение свободными радикалами митохондриальной ДНК (Miguel, 1980, 1983, 1984 и др., Козлов, 1973 и др.).

Таким образом, термодинамические теории онтогенеза рассматривают крупномасштабные фазы индивидуального развития целого организма, их общую картину и направленность — от оогенеза до смерти. Сопоставляя термодинамические параметры (продукцию энтропии, удельную функцию диссипации, свободную энергию) с метаболическими процессами и показателями гомеостаза клетки и организма, исследователи приходят к выводу, что управляющие параметры развития относятся к сфере энергетического метаболизма.

Работы последних десятилетий (Зотин, Зотина, 1993, Озернюк, 1992, 2000) обосновывают митохондриальную концепцию развития и старения. Однако в этой концепции не рассматриваются подробно представления о дифферепциров-ке эмбриональных клеток (как результате дифференциальной активности генов).

1.4. Теории аксиальной упорядоченности эмбриогенеза.

Изучение этих явлений требует экспериментального подхода с позиций целостного организма. Важнейшим фактором пространственной организации эмбриогенеза является установление осей яйца (анимально-вегетативной — во время онтогенеза — и дорсовентральной — при оплодотворении), с чем и связана «разметка» отделов тела зародыша.

Важнейшей исторической вехой развития целостных представлений об эмбриогенезе явилось открытие Г. Дришем закона эмбриональных регуляций, т. е. экспериментальное обоснование утверждения, что судьба эмбрионального зачатка есть функция его положения в целом зародыше (Н. Driesch, 1892).

Важнейшим фактором пространственной организации эмбриогенеза является установление осей яйца (анимально-вегетативной — во время оогенеза — и дор-совентральной — при оплодотворении и ооплазматической сегрегации), с чем и связана «разметка» отделов тела зародыша.

П. Чайлд развил концепцию метаболических градиентов (в частности, градиентов окислительного метаболизма и градиента реактивности при повреждающих воздействиях) как основной причины осевой упорядоченности эмбриогенеза (Child, 1941). Источником наведения градиентов, по Чайлду, является внешняя среда. Теория П. Чайлда оказалась весьма плодотворной. Основные эксперименты Чайлда выполнены на гидроидах. Одной из теорий градиентов является также количественная теория «органицина» Далька и Пастельса. Согласно этой теории детерминация эмбрионального зачатка определяется количественным распределением гипотетического фактора органицина, которое зависит от соотношения градиентов желтка и дорсовентрального кортикального градиента (Pasteeis, 1942; Dalque et Pasteeis, 1937).

В современных представлениях идеи Чайлда дополнены представлениями о динамической природе полярной упорядоченности, в которой играют роль диффузионные градиенты и факторы межклеточной и внутриклеточной сигнализации.

Дальнейшее развитие аналитических моделей упорядоченности образования структур в эмбриогенезе принадлежит Л. Волперту и его группе (Wolpert, 1969, 1972).

В основе моделей Л. Волперта лежит представление о «позиционной информации» в виде регулирующего градиента особого морфогена или каких-либо метаболитов в организме зародыша. Интерпретация этой информации клетками расположенными по градиенту зависит от порогов их чувствительности к концентрации морфогена и затем проявляется в том или ином типе дифференциров-ки. Согласно теории Волперта, явление позиционной информации универсально для всех регулирующихся живых систем, а «коды» интерпретации этой информации могут быть видоспецифичными.

Таким образом, согласно этой модели достигается разнообразие фенотипов при сохранении основного эпигенетического механизма. Возможные механизмы интерпретации позиционной информации в этих работах не обсуждаются.

Поведение аксиально-упорядоченных систем рассматривает также модель А. Гирера и X. Майнардта (Gierer, Meinhardt, 1972). Авторы предполагают, что в аксиально-упорядоченных системах протекают два различных процесса, взаимодействия между которыми приводят к плавному распределению клеток по состояниям (например, дифференцировки). Один из них способен активировать небольшую соседнюю область (как например при эмбриональной индукции). Второй процесс — ингибирование большой области, где подавляется формирование индуцированных первым процессом структур. Предполагается, что скорость диффузии активатора и ингибитора разные и что для каждого из них имеется источник и (или) сток, что и дает начало полярности.

Эта модель основана на системе дифференциальных уравнений. Она принадлежит к группе уравнений реакций с диффузией, используемых для описания распределения морфогена в ткани. Первый пример таких моделей дала классическая работа А. Тьюринга (Turing, 1952). Возможные механизмы действия морфо-генов и регуляции развития в этих работах не рассматриваются.

Б. Гудвин (Goodwin, 1976, 1979) предложил иной подход к моделированию пространственно-временной упорядоченности в эмбриогенезе, основанный на свойствах цитоплазматической мембраны и кортекса яйцеклетки.

Основой начального события поляризации может служить «метаболическая возбудимость» мембраны. Присутствие аллостерических ферментов, способных к активации и ингибированию специфическими лигандами, может привести к возникновению в мембране волн активности. При этом от одного локального источника (стимула) могут возникать периодически повторяющиеся волны, которые создают устойчивый морфогенетический градиент. Проблема эпигенетического управления клеточными циклами в работах Б. Гудвина рассматривается в связи с установлением полярности в эмбриогенезе и процессами дифференцировки. При этом предполагается важная морфогенетическая роль простых метаболитов как модуляторов мембран и их воздействие на локальный метаболизм, что приводит к упорядоченной физиологической или структурной гетерогенности в развивающихся клеточных популяциях. Считается, что одна волна не создает устойчивого морфогенетического градиента, требуется периодичность волн от одного источника. Градиент на мембране поддерживается установлением равновесия между образованием метаболита в результате периодической активности источника и его высвобождением из комплекса с мембранным белком. Такая система лабильна, обладает высокой реактивностью, т. е. способна к саморегуляции. Мембранная волновая модель объясняет устойчивость морфогенетического поля к центрифугированию, гомогенизации и др. воздействиям.

Автор предполагает, что биохимическая природа «волнового морфогена» связана с работой вторичных мембранных мессеиджеров, например цАМФ. В этом случае в результате каскада фосфорилирования в яйцеклетке возникает сигнал с пространственным распределением энергии. Ответом на такой сигнал может быть узнавание белками соответствующих лигандов и специфические взаимодействия в определенных пространственных областях зародыша. В качестве примера таких явлений автор рассматривает возникновение полярной оси после оплодотворения или партеногенетической активации у водорослей Fucus и Pelve-tia и поляризацию миксамеб Dictiostellum discoideum при их агрегации.

Основой пространственно-временной организации дробления зиготы Б. Гудвин считает поляризованное «кортикальное поле», имеющее электрическую природу. Автор считает главным носителем апимально-вегетативной и дорсовен-тральной полярности кортикальный слой яйца, который и во время дробления сохраняет свое единство благодаря сети десмосом. Однако эта объединяющая функция кортикального слоя начинает ослабевать по мере проявления мезодер-мальной дифференциации и усиления связей между мезодермальными клетками.

Кооперативные взаимодействия бластомеров объясняются с другой точки зрения «теорией Фрелиха»: дальнодействующей когеренции на основе высокой диэлектрической поляризуемости биологического материала (Фрелих, 1980). Для яйцеклеток многих животных показано возникновение после оплодотворения и дальнейший рост электрического потенциала на мембране, происходящий благодаря притоку метаболической энергии и градиентам концентраций ионов на мембранах. «Полевая связь» и в целом эмбрионе определяется силами дальнодействующей когерентности (Риус, Гудвин, 1984).

Примеч.: в случае партеногенетической активации воздействующий агент наводит градиент извне).

Непосредственно на объяснение факторов, обеспечивающих целостность развивающихся организмов, направлены представления о морфогенетическом поле А. Г. Гурвича (Гурвич, 1944, 1991). А. Г. Гурвичем открыты при помощи биодетекции слабые электромагнитные излучения делящихся клеток в УФ-диапазоне («митогенетические лучи»). Позже такое излучение было зарегистрировано Г. М. Франком. На основе этого открытия А. Г. Гурвич предположил существование клеточных полей, слагающихся в «актуальное поле» многоклеточной структуры, управляющее морфогенезом эмбрионального зачатка посредством влияния на направление вновь образующихся митотических веретен. Важно при этом, что митогенетическое излучение является триггером вторичного излучения в биодетекторе, вызывающим каскад реакций митоза. Позже были обнаружены сверхслабые излучения погибающих клеток. Также с помощью фотоэлектронных умножителей было обнаружено и исследовано у широкого круга биообъектов в 60е годы XX в. явление сверхслабой хемилюминесценции — излучения в желто-зеленой области спектра, обусловленного рекомбинацией свободных радикалов при окислительных метаболических процессах (Тарусов, Эмануэль, Бурлакова и мн. др.).

Сейчас хорошо известно, что все жизненные процессы запускаются, регулируются и осуществляются с использованием электрических полей и сигналов. На этом основаны многие методы физиологической и медицинской функциональной диагностики (ЭЭГ, ЭКГ и др.). Многие исследователи считают, что за счет энергии электронновозбужденных соединений (свободных радикалов) в живых клетках постоянно осуществляются энергоемкие процессы, модулируется активность ферментов, физико-химическое состояние мембран. При этом генерируются сверхслабые излучения в разных областях спектра, которые играют функциональную роль. Возможно, что создаваемое электронновозбужденными частицами слабое электромагнитное поле и излучения, сопутствующие его ос-цилляциям, имеют информационное значение (Ревии и др., 2002).

В последние десятилетия Ф.-А. Попп и его коллеги показали, что клетки, многоклеточные организмы и даже их сообщества излучают когерентные электромагнитные волны (Popp, 1989, 1992), что может быть основой их взаимодействий (Белоусов, Воейков, Попп, 1997).

Понятие «морфогенетического поля» употреблялось и без указаний на его природу некоторыми исследователями, как характеристика свойств внутреннего пространства зародыша, т.к. процессы формообразования нельзя объяснить исходя из поведения и свойств единичных клеток. Так А. Г. Гурвич в своих ранних работах ввел понятие «морфогенетического поля», где целое определяется как сумма векторных полей отдельных клеток, возникающих при определенной ориентации веретен деления.

Гексли и де Бер понимали «поле» как область однородности, в которой определенные регулирующие факторы действуют одинаково (ср. понятие «поля проспективного зачатка органа» как «гармонической эквипотенциальной системы, клетки которой инструктированы к формированию любой части этого органа» (Гилберт, 1995). Шпеманн также использовал понятие «поле организатора». П. Чайлд применял сходное понятие «доминантной области» для характеристики наиболее физиологически активной области зародыша.

Н.К. Кольцов рассматривал морфогенетическое поле как силовое поле фи-зическо-химической природы (Кольцов, 1936). Исходная конфигурация этого поля определяется полярностью и компартментализацией ооцита и яйца. В ходе развития разные пункты силового поля характеризуются разностью потенциалов электрических, химических, температурных, механических и т. п.). Такое неравновесие физико-химических процессов определяет токи веществ в зародыше, поведение отдельных бластомеров и в дальнейшем — усложнение силового поля и расчленение зародыша. При этом по мере развития в зародыше образуются центры с высокой разностью потенциалов (аналог «доминантных областей» Чайлда). С точки зрения Н. К. Кольцова, не существует исключительно индуцирующих или индуцируемых зачатков: роль зачатков в индукционной системе определяется соотношением активности физиологических процессов. В настоящее время феномен морфогенетического поля понимают как равнодействующую межклеточных взаимодействий, которая и направляет формообразовательные перемещения клеточного материала.

План строения животных и, в том числе, амфибий формируется в результате целой цепи событий раннего развития, в основе которых лежит неоднородность химической организации яйцеклетки. Само развитие ооцита представляет собой последовательное формирование гетерогенности его цитоплазмы. В период оогенеза функционируют почти все уникальные последовательности ДНКв яйцеклетке амфибий в конце оогенеза содержится набор разнообразных мРНК и белков, многие из которых станут функционально активными гораздо позже. Таким образом, ядро ооцита обеспечивает будущие стадии развития. Л. И. Корочкин отмечает, что феномен «морфогенетического поля» реально существует. Он имеет не внешнюю по отношению к зародышу, а генетическую природу и представляет собой равнодействующую межклеточных взаимодействий, которая и направляет формообразовательные перемещения клеточного материала (Корочкин, 2002).

1.5. Современные представления о координационных механизмах в раннем эмбриогенезе.

Основными механизмами обеспечения целостности зародыша в раннем развитии являются ооплазматическая сегрегация и эмбриональная индукция.

Формирование плана строения зародыша амфибий включает следующие события:

• Во время оогенеза создается анималыю-вегетативная полярность ооцита, определяющая затем передне-заднюю ось эмбрионаооцит радиалыю симметричен.

• При оплодотворении закладывается билатеральная симметрия и дорсовен-тральная ось эмбрионаэто является следствием гравитационно-зависимого поворота оплодотворения (Gerhardt е.а., 1986, Pasteeis, 1964) и образования серого серпа на дорсальной стороне.

В последние годы установлено, что аксиализация яйца управляется сложными системами генов, среди которых выделяют основные группы (Корочкин, 2002):

• Материнские гены, функционирующие во время оогенеза. Их продуктытак называемые «морфогены» — (в неактивном состоянии) неравномерно распределены в цитоплазме яйца.

• Гены-активаторы, влияющие на стабильность морфогена и его градиента.

• Гены-антагонисты основного морфогена и их активаторы.

• Каскад структурных генов, активируемый основным морфогеном и обеспечивающий формообразовательные процессы.

Таким образом, дифференциальная экспрессия генов носит многоуровневый характер. Регуляция осуществляется и на уровне транскрипции, и на уровне трансляции, и при посттрансляционных событиях (время жизни, активация и транспорт продуктов). На каждом уровне можно выделить «триггер» всего каскада процессов, активаторы и ингибиторов каждого звена. В итоге создается неравномерное распределение генопродуктов в зародыше — основа «позиционной информации».

Во время оогенеза и при оплодотворении создается также неравномерное распределение энергоресурсов и морфогенов в цитоплазме яйцеклетки, которое и является основой позиционной информации. По современным представлениям, морфоген — это продукт материнских генов, индуктор, который способен по-разному определять путь дифференцировки (судьбу) многих клеток-мишеней, находящихся в зоне его эффективных концентраций (действие на расстоянии от места синтеза и секреции). Диффузия морфогена приводит к формированию в зародыше «морфогенетических градиентов». Наиболее важный момент — способность окружающих клеток к восприятию различных концентраций морфогена как различных информационных сигналов.

В результате градиент единичного морфогена может привести к формированию в исходно гомогенной клеточной массе нескольких субпопуляций с различными направлениями дифференцировки. Это должно обеспечиваться дифференциальной экспрессией материнских и зиготических генов. Экспрессия генов в раннем эмбриогенезе регулируется как на уровне транскрипции, так и трансляции, и в посттрансляционных процессах.

Градиент даже одного морфогена может координировать пространственное распределение различных типов клеток, если пороги их чувствительности к этому морфогену различны.

В эмбриональном развитии позвоночных градиенты морфогенов играют ведущую роль в формировании осевого зачатка, регионализации мезодермы и нейро-эктодермы. Молекулярная природа этих морфогенов и механизмы их действия исследованы лишь в конце XX в., хотя само существование морфогенов было известно давно (обзор: Михайлов, 1988, 1989).

Используя in vitro эмбриональную эктодерму и один из недавно охарактеризованных морфогенов — активин — Дж. Гердоп показал, что эмбриональные клетки способны детектировать весьма низкие концентрации морфогена (от 20 пикограмм), отвечать на двухкратное измеение концентрации морфогена изменением направления дифференцировки. Морфоген может не только активировать, но и репрессировать наборы генов в одних и тех же клетках-мишенях в зависимости от их положения в градиенте (Gurdon, 1994, 1995, 1996).

В дальнейшем основным механизмом пространственно-временной координации развития является эмбриональная индукция: все раннее развитие позвоночных животных представляет цепь взаимодействий «индуктор — компетентная реагирующая ткань».

Индукция — это взаимодействие клеток, побуждающее к дифференцировке. Индукция представляет собой один из регуляторных механизмов, обеспечивающих детерминацию того или иного клеточного типа в развитии. Возникновение каждого типа клеток является отражением и реализацией определенного паттерна генной активности, установившегося при детерминации.

Индукция является механизмом выбора пути дифференцировки одним зачатком эмбриона под влиянием другого, принимая во внимание, что окончательная (терминальная) гистотипическая дифференцировка является результатом нескольких последовательных двоичных выборов.

Как детерминация, так и последующая реализация соответствующей дифференцировки представляет суммарный результат, обусловленный собственными свойствами клеток и внешними регулирующими воздействиями. Все развитие зародыша можно рассматривать как каскад индукций, происходящих на фоне физиологического «созревания» клеток, изменений порогов их чувствительности к тем или иным путям дифференцировки.

Первым по времени проявлениям таких взаимодействий в эмбриогенезе является закладка Ныокуповского центра организации (индукция мезодермы) на стадии от 64 бластомеров до средней бластулы, в дорсальных бластомерах вегетативной части зародыша. В клетках презумптивной мезодермы индуктор вызывает экспрессию гена Brachyury, продукт которого активирует гены, контролирующие образование мезодермы.

В пространственно-временной организации дифференциальной транскрипции значительную роль играет открытая A.A. Нейфахом (1961) периодичность морфогенетической функции ядер (МФФЯ). Речь идет о том, что (на фоне непрерывной транскрипции) информационная РНК обеспечивающая формообразовательные процессы синтезируется как бы «квантованно», в ограниченные промежутки времени. Именно эти периоды развития являются наиболее чувствительными к повреждающим факторам, как, например, ингибиторы транскрипции, ионизирующая радиация. В раннем развитии периоды МФФЯ обеспечивают наступление следующей фазы развития всего зародыша, при подготовке органогенеза в каждом зачатке также проявляется такая периодичность МФФЯ (Корочкин, 2002).

Таким образом, для эмбриогенеза характерна дифференциальная активность генов во времени и в пространстве. У зародышей низших позвоночных первый период МФФЯ отмечен на стадии бластулы, когда подготавливаются га-струляционные процессы (Нейфах, 1961, 1962). Чувствительность к повреждающему воздействию наиболее велика в период МФФЯ, а проявляется поражение позже — с началом гаструляции.

Явление МФФЯ объясняет с молекулярно-генетических позиций сущность критических периодов развития (Броун, 1897, Стоккард, 1921, Гольдшмидт, 1927, 1932, Светлов, 1978, Дыбан, 1968, обзор: Токин, 1987).

Транскрипция начинается неодновременно во всех зачатках зародыша амфибий (Bachvarova, Davidson, 1967, обзор: Davidson, 1986), т. е. можно говорить о дифференциальной транскрипции. Дифференциальная транскрипция обеспечивается взаимодействием продуктов многих регуляторных генов, контролирующих в итоге функциональное состояние соответствующих участков ДНК. Среди этих генов могут существовать основные регуляторы, которые запускают весь каскад подчиненных регуляторных и структурных генов (Геринг, Gehring, цит. по: Корочкин, 1999, 2002, Lawrence, 1992), обеспечивающих формообразовательный процесс. Ключевая роль при этом принадлежит гомеозисным генам.

В средней бластуле лягушки согласно опытам П. Ньюкупа (1969) мезодерма индуцируется благодаря воздействию энтодермы. Что же представляет собой вещество-индуктор?

Индуктор должен обладать следующими свойствами: изменять направление дифференцировки реагирующей ткани (в эксперименте), его секреция или активация должна быть локализована в индукционной системе.

Эти свойства характерны для нескольких семейств белковых факторов: TGF-? (трансформирующий рост фактор), Wnt, FGF (фактор роста фибробла-стов), Hg (Heghehog), обнаруженных в эмбрионах Х.1. на этой стадии. Наиболее изучен путь передачи сигнала от белков суперсемейств TGF-?, в состав которого входят: Vg-1, активин, BMP (Gilbert et al., 1996).

Все эти факторы неактивны до момента специфического протеолитического расщепления прообласти и активной части молекулы. Активированный фактор TGF-? может секретироваться в межклеточное пространство и передавать сигнал тем клеткам, которые расположены в соответствующем месте и обладают рецепторами к TGF-?. Активация рецептора приводит к фосфорилированию белков SMAD, передающих сигнал в ядро к транскрипционному фактору. Известно, что продукт генов TGF-? влияет на гомеозисные гены. Белок Vg-1 является уникальным по своей способности организовать полную дорсальную ось. Известно, что Vg-1 — это продукт материнского гена, имеется в цитоплазме яйца, преимущественно в вегетативной части. Активацию его связывают с поворотом оплодотворения, когда происходит гравитационнозависимое перемещение пласта тяжелых гранул желтка по отношению к кортикальному слою и анимальной части яйца (Gerhardt е.а., 1986). Высказана гипотеза о том, что специфическая протеаза находится в анимальной части и при повороте оплодотворения оказывается только в области дорсального организатора, где и активирует Vg-1 (Gilbert е.а., 1996, Erickson е.а., 1995). Известно также, что TGF-? ингибирует вступление клеток в S-фазу цикла.

Членом того же суперсемейства белков TGF-? индукторов мезодермы является и другой материнский фактор — активин, который уже в яйцеклетке содержится в желточных пластинках. Экспрессия его гена не определяется до стадии морулы (Asashima, цит. по: Корочкин, 2002). Активин активирует экспрессию других мезодермальпых генов и также активирует движение клеток (Kelly, 1994, Slack, 1995, Smith, Howard, 1992).

Источником последующих индукционных влияний в образовании осевого зачатка на дорсальной стороне эмбриона является «Шпеманновский организатор» (дорсальная губа бластопора), свойства которого формируются на стадии бластулы. Все эти события определяют течение гаструляции и затем собственно формирование осевого зачатка.

Таким образом, первый этап пространственной регуляции будущего морфогенеза связан с ооплазматической сегрегацией. Результатом ооплазматической сегрегации является «разметка» осей и будущих отделов тела.

Важное формообразующее событие — индукция мезодермы, связано с последующим образованием центра начала гаструляции — организатором Шпемаи-на (область дорсальной губы). Классические эксперименты Ньюкупа по конъюгации эксплантантов анимального и вегетативного полюсов продемонстрировали, что вегетативные клетки эндодермы способны вызвать в анимальных шапочках образование мезодермальпых тканей (Niewkoop, 1969, 1973). Тип ткани, развивающийся в подобных «сэндвичах», зависит от дорсовентральной полярности эндодермальных фрагментов. Таким образом, Первичная индукция происходит до включения генома зародыша на стадии средней бластулы за счет материнских факторов, накопленных в оогенезе. После этого третий индукционный сигнал распространяется от организатора по маргинальной зоне и анимальному полушарию зародыша (Рис. 1).

Область организатора получила свое название после опытов Шпеманна по пересадке дорсальной губы бластопора на вентральную сторону зародыша, в результате чего развивалась эктопическая вторая ось (Spemann and Mangold, 1924).

В последние несколько лет усилия многих исследований были направлены на идентификацию молекул, вовлеченных в индукцию осей и дифференцировку мезодермы. В настоящее время известны некоторые компоненты дорсального и вентрального путей.

Wnt: путь передачи дорсального сигнала. Формирование дорсальной оси у Xenopus зависит от цитоплазматических компонентов. В результате взаимодействия одного из членов белкового семейства Wnt с соответствующим рецептором, активируется цитоплазматический белок Dishevelled, ингибирующий проте-инкиназу GSK-3p (Sokol, 1996). GSK-3J3 ингибирует дорсальный путь передачи сигнала, влияя на стабильность Р-катенина (Wylie, 1996). При активации Dishevelled ингибирующее действие GSK-3P подавлено, уровень цитоплазматического Р-катенина возрастает, и (3-катенин переходит в ядро в комплексе с транскрипционным фактором Tcf-З. Комплекс Р-катенин/Тс?3 действует как транскрипционный фактор, стимулируя wnt-активируемые гены, такие, как goosecoid (gsc) -транскрипционный фактор, участвующий в организации головных структур (Cho, 1991) и Samois — материнский ген, способный формировать эктопическую дорсальную ось (Lemaire, 1995).

В течение долгого времени для объяснения причин индукции различных тканей в ходе развития привлекались модели морфогенетических градиентов (Huxley, 1934), согласно которым клетки направлялись по тому или иному пути дифференцировки в зависимости от концентрации сигнальной молекулы (Dalcq and Pasteels, 1937). Однако в ходе исследований последних лет были обнаружены секреторные антагонисты таких индукторов, как BMP (bone morphogenic protein) (Thomsen, 1997) и Wnt. Поэтому теория морфогенов перестала быть единственным объяснением принципов развития.

Антагонистом Wnt являете Frzb — секретируемый белок, подобный внеклеточному амино-концевому домену рецептора Wnt-Frizzeled (Wang, 1997). В отсутствие Wnt GSK-Зр фосфорилирует цитоплазматический Р-катенин и вызывает его деградацию. Передачи сигнала внутрь клетки не происходит (Zorn, 1997). Но Frzb не единственный антагонист сигнального пути Wnt. гСс.

Рис. 1. Трехсигнальная модель эмбриональной индукции (по Smith, 1989). На стадии ранней бластулы вегетативная часть зародыша посылает два сигнала: вентральный индуцирует вентральную мезодерму, а дорсальный — организатор Шпеманна. Во время гаструляции организатор посылает третий, дорсализирую-щий сигнал в маргинальную зону. Из области МЗ формируется мышечная ткань, и только из самой вентральной Ml — кровяные островки.

Обозначения-. А — анимальное полушариеVV — вентральная вегетативная областьDVдорсальная вегетативная областьVM — вентральная мезодермаО — организатор Шпеманна (дорсальная мезодерма) — - Ml, М2 и МЗ — в разной степени дореализированная мезодерма.

Cerberus — секреторный фактор, экспрессирующийся на стадии гаструлы в районе организатора, предполагается, что он участвует в индукции головных структур (Bouwmeester, 1996). Недавно было установлено, что Cerberus является ингибитором сигнального пути Wnt во время раннего развития эмбрионов Xenopus.

Исходя из того, что области экспрессии обоих антагонистов сигнального пути Wnt перекрываются в районе дорсальной губы, можно предположить, что организатор — источник множества ингибиторов Wnt, которые выполняют роль тонких регуляторов индукционных взаимодействий.

ВМР-4: вентральный путь передачи сигнала. Классические эксперименты Шпеманна и его коллег (обзор Smith, 1989) привели к созданию дорсовентраль-ной модели развития. В этих экспериментах дорсальный эксплантат пересаживали на вентральную сторону нормального зародыша, в результате у него развивалось два осевых комплекса, причем значительная часть тканей второй дорсальной оси образовывалась из вентральной ткани зародыша. На вентральной стороне при нормальном развитии из эктодермы образуются клетки кожи, а при пересадке донора с дорсальной стороны — нервная трубка, происходит нейральная индукция. Модель получила дополнительную поддержку после экспериментов по культивированию дорсальных и вентральных эксплантатов (Smith, 1989). При совместном культивировании дорсальных и вентральных эксплантантов в виде «сэндвичей», в последних возникали хорда и сомиты. Результаты этих экспериментов были интерпретированы так, что вентральные ткани способны лишь пассивно воспринимать специфические сигналы центра Ныокупа и организатора Шпеманна, и, в отличие от дорсальных, не являются источником индукционных влияний. Однако, исследования последних лет показали, что вентральная ткань является источников активного вентрализующего сигнала, антагониста дорсальным индукторам — ВМР-4 — члену суперсемейста TGF-P (transforming growth factor).

Суперсемейство TGF-P играет ключевую роль в выборе пути развития и дифференцировке клеток (обзор Hogan, 1996). Два материнских фактора, вовлеченных в формирование мезодермы, являются членами семейства TGF-P: акти-вин (Cornell and Kimelman, 1994) и ВМР-4 (обзор Harland, 1994). Первый является дорсализующим фактором, а второй — вентрализующим. Сигналы TGF-P опосредуются семейством рецепторных протеинкиназ. Эти рецепторы подразделяются на две группы: передающие сигнал (класс 1) и лиганд-связывающие (класс 2). Взаимодействие ВМР-4 с рецепторами ведет к фосфорилированию рецепторов класса 1 и последующему фосфорилированию цитоплазматических белков (Candia, 1997). Сигнальный путь ВМР-4 необходим для индукции вентральной мезодермы. Оказалось, что при отсутствии передачи сигнала ВМР-4, вентральная мезодерма дорсализуется и связано это с тем, что при элиминировании эндогенного сигнала ВМР-4, на вентральной стороне появляются дорсальные факторы (Wilson and Hammati-Brivanlou, 1995).

Таким образом, два совершенно разных воздействия могут вызвать дорса-лизацию мезодермы — воздействие дорсальных индукторов организатора Шпе-манна и отсутствие сигнального пути ВМР-4. De Roberis и Harland показали, что индукторы дорсальной мезодермы — chordin и noggin связывают ВМР-4 с высокой степенью аффинности (Sasi, 1995; Zimmerman, 1996). Таким образом, факторы, секретируемые организатором, не только действуют как активные индукторы, но и блокируют действие вентрализующих агентов.

Разносторонняя подготовка клеток к гаструляции осуществляется в период дробления. На материнских матрицах синтезируются важнейшие для процессов дробления белки: гистоны, тубулии, рибонуклеотидредуктазы и др. Активация яйца запускает также циклические процессы, отныне отсчитывающие индивидуальное время жизни зародыша. В начале развития все они связаны с циклами деления оплодотворенного яйца. В регуляции клеточных делений важную роль играют белки «циклины» (Evans е.а., 1983), синтез которых идет на материнских и-РНК и запускается белковым фактором созревания. Циклины разрушаются в ходе митоза и вновь транслируются в S-фазев регуляции каждого цикла участвует также фактор созревания (он также синтезируется на материнских и-РНК), его присутствие необходимо для деструкции ядерной оболочки и начала митозапосле завершения митоза фактор созревания блокируется фосфорилированием. В регуляции клеточных циклов участвует также Ca.

Механизмы регуляции клеточного цикла универсальны, и их нарушение ведет к началу опухолевого роста. В настоящее время показано, что все онкогены', а также протоонкогены" являются компонентами общих сигнальных путей, контролирующих клеточный цикл, апоптоз, морфогенетические процессы и диффе-ренцировку клеток. «Мотором» клеточного цикла служат активности сменяющих друг друга циклин-зависимых киназ. Циклин-зависимая киназа — каталитическая субъединица холоферментного комплекса, для которой циклин является актива-торной субъединицей. Активность всего комплекса регулируется также фосфорилированием — дефосфорилированием регуляторных белков, ответственных за начало фазы G| или за переход в митоз. Действие многих протоонкогенов направлено на регуляцию этого комплекса. Продукты известных онкогенов часто являются факторами роста, клеточными рецепторами или белками внутриклеточ онкогены — клеточные или вирусные (вносимые вирусом) гены, экспрессия которых может вести к развитию новообразования. протоонкогены — клеточные гены, усиление функции которых превращает их в онкогены ных сигнальных путей (Olsson, Pfeifer-OIsson, 1987). Также и многие протоонко-гены являются компонентами сигнальных путей, ответственных за активацию циклиновых комплексов в ответ на действие пептидных факторов роста. При этом запускаются также каскады фосфорилирования, ведущие к транслокации сигнальных молекул из цитоплазмы в ядро, где они также фосфорилируют и активируют множество субстратов, в т. ч. факторы транскрипции. В результате при опухолевом росте и при действии митогенов повышается экспрессия гена цикли-на. Если этот процесс идет с положительной обратной связью (самоускорением) — возникает опухоль. Сейчас идентифицирован целый ряд генов и их продуктов, участвующих наряду с циклинами в регуляции клеточных циклов.

На ранних стадиях у Xenopus отсутствуют фазы Gl и G2. Фактор, стимулирующий созревание (MPF), побуждает клетку к переходу из S-фазы в М-фазу, а цитостатический фактор (CSF) может удерживать клетку в состоянии митоза, стабилизируя MPF. При инактивации CSF ионами кальция инактивируется и MPF, тогда клетка переходит в S-фазу. Видимо, MPF действует путем изменения структуры ядерной оболочки: он гиперфосфорилирует три основные белка ядерной оболочки, при этом оболочка деполимеризуется и разрушается и происходит конденсация хроматина. Примерно после 12-ти клеточных циклов скорость деления клеток резко снижается, т.к., видимо, появляются недостающие фазы цикла, нарушается синхронность делений и начинается транскрипция генома зародыша (Newport, Kirschner, 1982, a, b, 1984).

Рецепторы факторов роста характеризуются тирозиназной активностью, резко возрастающей при связывании с фактором роста. При этом активируется фосфоинозитольный путь к делению клетки (Margolis е.а., 1989, Berrige, 1993). Появление способности клеток реагировать на действие факторов роста может иметь большое значение в развитии.

Таким образом, возникает регуляторная петля, поддерживающая активность транскрипционных факторов и контролируемых ими генов, обеспечивающих репликацию ДНК.

Можно перечислить этапы регуляции митогенного сигнала: ростовые факторы, рецепторные тирозинкиназы, адаптеры, белки семейства Ras, эффекторы Ras, киназы, транскрипционные факторы, циклин. Упоминавшиеся уже продукты TGF-? являются ключевыми факторами передачи ингибиторных сигналов, связывая циклин-зависимые киназы, ответственные за начало S-фазы.

Кроме этих специфических факторов регуляции клеточного цикла, в работе часов дробления участвуют и другие процессы, связанные с энергообменом. Это глютатиоповый окислительно-восстановительный цикл, который определяет периодичность синтеза белка через периодичность образования полисом, а также периодическое перемещение в ядро и активацию ДНК-полимеразы (Mano, 1968, 1975). SH-белки участвуют также в возбуждении волн сокращения поверхности яйца при дроблении (Нага, 1977).

Важную роль в циклах дробления играет такой внутриклеточный универсальный посредник как кальций, основные пути мобилизации которого связаны с фосфоинозитидной системой (De Lisie, Welsh, 1992). Периодическое связывание Са осуществляется при сборке микротрубочек веретена деления. При разборке веретена Са освобождается и направляется к кортексу, где активирует динеин-подобную АТФ-азу, что необходимо для сокращения микрофиламентов при прохождении борозд дробления.

Окислительно-восстановительный цикл клетки связан также с процессами перекисного окисления липидов в мембранах. Эти процессы идут с образованием свободных радикалов. Свободнорадикальные реакции также вносят вклад в неспецифическую регуляцию клеточного цикла: чем активнее они идут, тем более замедляются циклыобразование свободных радикалов ведет к удлинению фазы Gj в клеточном цикле (Бурлакова, 1967; Алесенко и др., 1975,1984).

На стадии средней бластулы клетки приобретают дифференциальную подвижность (Davidson, 1986). Первыми ее приобретают будущие клетки мезодермы. Таким образом, стадия средней бластулы в развитии амфибий имеет важнейшее формообразовательное значение.

Гаструляцию Xenopus в первом приближении считать обусловленной тремя процессами — инвагинацией, инволюцией и эпиболией.

При индукции мезодермы у Xenopus непосредственный контакт между клетками необязателен, они могут располагаться на некотором расстоянии друг от друга. Отсюда следует, что индуцирующим агентом является диффундирующее вещество. Оказалось, что вместо бластомеров вегетативного полушария можно использовать фактор роста фибробластов (FGF), который индуцирует клетки из области анимального полюса к развитию по мезодермальному пути. Образование мезодермы можно также индуцировать трансформирующим фактором /?2 (TGF-p2). Действие FGF, как правило, вызывает развитие вентральных производных мезодермы (например, клеток крови), a TGF-p2 в основном индуцирует дорсальные производные (например, мышцы). Нормальные эмбрионы Xenopus содержат мРНК, кодирующую FGF, а мРНК белка Vgl, относящегося к семейству TGF-p2, не только присутствует в яйцеклетке, но, как было показано, локализована в области вегетативного полушария яйцеклетки и ранних эмбрионов.

Во время гаструляции у позвоночных происходят значительные изменения в клеточной морфологии, клеточной адгезии и клеточных движениях. Они приводят к образованию трех зародышевых листков — внешнего (эктодермы), внутреннего (эндодермы) и мезодермы между ними. У амфибий, в начале гаструля-ции дорсальная мезодерма инволюирует через дорсальную губу и движется к анималыюму полюсу по внутренней стороне крыши бластоцеля. Эндодерма втягивается внутрь, а эктодерма к концу гаструляции покрывает весь зародыш снаружи. Процесс гаструляции направляют регионально-специфичные клеточные движения: 1) эпиболия клеток анимального полюса- 2) конвергентные растяжения и латеро-медиальная интеркаляция клеток маргинальной зоны и 3) миграция клеток мезодермы по крыше бластоцеля (Keller and Tibbets, 1989; Winklbauer, 1990; Wilson and Keller, 1991).

Факторами активации адгезии к внеклеточному матриксу являются белки интегрины (рецепторы фибронектипа (Winklbauer, 1990, 1996), их антагонистами являются SPARC и тепасцин (Engel, 1987; Sage, 1989).

За межклеточную адгезию ответственна группа белков кадгеринов (Takeichi, 1995). В яйце обнаружены материнские кадгерины (Choi, 1990; Ginsberg, 1991; Herzberg, 1992), экспрессируемые в области всех будущих зародышевых листков. Зиготические кадгерины начинают экспрессироваться после активации зародышевого генома, они влияют на клеточную подвижность, адгезивные свойства клеток и участвуют в процессе нейральной и эпидермальной дифферен-цировки (Choi a. Gambiner, 1989; Detrick, 1990).

Продукты некоторых генов Шпеманновского организатора определяют способность клеток к миграции и поляризации: так, продукты генов семейства Wnt ингибируют элонгацию, а активин — (индуктор мезодермы) является индуктором элонгации и движения клеток (Moon, 1993; Slack, 1994). Активин в неактивном состоянии имеется уже в яйце и содержится в желточных пластинках (Asashima, 1998).

1.6. Факторы запуска дифференцировки.

Современный этап создания теорий дифференцировки связан с изучением молекулярно-генетического контроля индивидуального развития (обзоры: Михайлов, 1993; Корочкин, 1997, 2002).

Основная проблема, решаемая при этом, состоит в установлении механизмов возникновения разнообразия клеточных типов, в каждом из которых обнаруживаются специфические белки и, следовательно, работают специфические группы генов, на основе единого наследственного аппарата оплодотворенной яйцеклетки. Центральным вопросом современной эмбриологии является расшифровка сложного пути от активации экспрессии генов до формирования признака организма в онтогенезе. Типы дифференцированных клеток отличаются друг от друга не только по специфическим белкам («белкам роскоши»), обеспечивающим специализацию клеток, но также и по особенностям обязательного метаболизма (и, соответственно, по «белкам домашнего хозяйства»), по способности к делению, движению, восприятию сигналов из макрои микросреды (т.е. по рецептор-ным белкам) (Трумэн, 1976; Туманишвили, 1977; Гилберт, 1993 — 95- Белоусов, 1993; Корочкин, 2002 и др.). Процесс дифференцировки эмбриональных клетокдлительный, многоступенчатый, и начинается с неспецифического «созревания». Уже в течение первых делений дробления цитоплазма вентральных и дорсальных бластомеров различается по специфическому маркеру эпидермиса (Epi-1), обнаруженному только на вентральной стороне (Phillips е.а., 1989). В то же время, клетки дорсальной эктодермы еще до контакта с хордомезодермой синтезируют специфический нейральный маркер — гликопротеид адгезии N-CAM (Dixon, Kint-ner, 1989).

Наряду со специфическими факторами, известны также заведомо неспецифические искусственные факторы индукции. Например, сильное вегетализирую-щее влияние оказывает белок-лектин конканавалин А, действующий на клеточную поверхность и связывающий мембранные гликопротеины. Значительный сдвиг развития эмбриональных тканей в сторону переднедорсальной мезодермы вызывают ионы лития, действие которых связано с подавлением некоторых звеньев фосфоинозитолыюго пути внутриклеточной регуляции. Имеются данные о нейрализующем действии форболового эфира, также влияющего на эту систему регуляции (нарушающего ресинтез фосфоинозитидов) (Берридж, 1985). Получены данные о возрастании в клетках эктодермы концентрации универсального фермента системы внутриклеточной регуляции — протеинкиназы СцАМФ также способствует нейральной индукции. Надо отметить, что любые воздействующие извне па клетку факторы влияют в конечном счете на регуляторные контуры, связанные с универсальными посредниками — фосфатидил-инозитольной системой, Са, цАМФ. Поэтому специфика реакций во многом определяется свойствами реагирующих клеток.

Программа (направление) дифференцировки эмбриональных клеток определяется при детерминации. Л. И. Корочкин (2002) выделяет в пути дифференцировки клеточных популяций в эмбриогенезе следующие этапы:

• Компетенция (способность к детерминации) — определенное физиологическое состояние клеток зачатка, позволяющее воспринимать сигналы индуктора. Созревание компетенции происходит автономно и компетенция зависит от времени.

• Детерминация и преддифференцировка — установление транскрипционного паттерна, включение определенных генетических локусов и, соответственно, ограничение проспективных потенций зачатка, т. е. выбор пути будущей дифференцировки. В этом периоде специфические транскрипты появляются, но транскрипция не происходит, т.к. матрицы заблокированы (Сергеев, Ениколопов, Кузин, Корочкин, 1990).

• Протодифференцировка: активно строится неспецифическая система синтеза белка, ограничивается митотическая активность, обнаруживаются следы специфического синтеза.

• Дифференцировка: утрата митотической активности, резкий рост концентрации специфических продуктов.

• Терминальная дифференцировка: максимальная активность синтеза специфических продуктов, образование специфических структур, формирование гистотипического фенотипа.

Таким образом, в эмбриогенезе выявляются два типа детерминационных процессов, соответствующих различным этапам пути клеточной дифференцировки.

Первый характеризует клеточную популяцию зародышевого листка и определяет поведение клеток в гаструляции, их «физиологическое созревание»: мембранные и рецепторные системы, продолжительность клеточных циклов, способность к перемещению. Выявленные гены этого этапа кодируют протеазы, необходимые для деблокирования материнских матриц, и киназы — для внутриклеточной передачи сигналов. При этом регуляция экспрессии материнских генов происходит на уровне трансляции.

Второй этап детерминации связан с регуляцией транскрипции и трансляции тканеспецифичных генов, причем заметное появление специфичного продукта предваряется подготовкой субклеточных структур к синтезу белка. При этом критерием детерминации является появление специфических транскриптов, а развитие процесса трансляции, возможно, требует дополнительного сигнала (Корочкин и др., 1990; Eguchi, Watanabe, 1986).

По нашим данным, в обоих случаях маркером детерминации является развитие свободнорадикальных реакций, свидетельствующее об ускорении «энергетического протока» в эмбриональных клетках и обновлений мембранных структур.

A.A. Караванов (1990) отмечает, что маркерами детерминации являются: метилирование определенных групп геновпоявление в ДНК участков гиперчувствительности к эндонуклеазе (Weintraub, Groudine, 1976) — специфические факторы включения и выключения генов.

Критерием детерминации является специфическая транскрипция (Gurdon, 1987). Однако транскрипты не проходят процессинг (Eguchi, Watanabe, 1986) без дополнительного сигнала. Работами Слотера и Триплета (1975) показана связь такого сигнала с распадом желточных гранул.

Нашими работами (Мелехова, 1976, 1977) показано на глазном зачатке амфибий, что маркером детерминации также является самоускоряющееся развитие свободнорадикальных процессов.

Детерминация — центральное событие в раннем развитииэтим термином определяют последовательное сужение широких проспективных потенций эмбриональной клетки вплоть до единственной программы терминальной диффе-ренцировки. Состояние детерминации экспериментально определяется методами трансплантации или эксплантации исследуемого зачатка. Изучение детерминации как феномена, определяющего ход развития, составляло основной предмет экспериментальной эмбриологии (Ру, 1988; Шпемани и Мангольд, 1924; Филатов, 1929; Светлов, 1978; Корочкин и мн.др. Обзоры: Светлов, 1978; Корочкин, 2002).

Физиологические методы изучения детерминации вошли в употребление в XX в.- они связаны с повышенной реактивностью детерминирующихся зачатков. Применяются внешние факторы, модифицирующие развитие. Это направление работ начато с исследований П. Чайлда, продолжено и разработано П. Г. Светловым и А. П. Дыбаном (обзор: Светлов, 1978). По существу, это направление в своих истоках связано с тератологией (Сент-Илер, 1830 и мн. др.) и современной концепцией критических периодов развития (Стоккард, 1920, Светлов, 1978).

Первые и решающие для жизнеспособности эмбриона детерминационные события связаны с установлением плана строения и происходят во время дробления и гаструляции: это детерминация мезодермы и затем — детерминация ней-рального зачатка, происходящие путем индукционных взаимодействий.

Как уже было сказано, накопление описательной молекулярной информации и опытов с генетическим манипулированием развитием привело к изменению системы представлений о нейральной индукции и о механизмах выбора эмбриональными клетками нейрального пути развития (т.е. детерминации). Но и теперь проблемы индукции и детерминации полностью не решены.

Большая часть информации о нейральной индукции получена на амфибиях и в частности на зародышах шпорцевой лягушки.

Опыты Г. Шпеманна и X. Мангольд (1924) показали, что имплантированная на вентральную сторону зародыша-реципиента дорсальная губа бластопора способна рекрутировать эктодермальные клетки реципиента к началу несвойственной им в норме нейральной дифференцировки. В результате трансплантации дорсальной губы бластопора в пределах эктодермального поля формируются зачаток центральной нервной системы, а также сомиты и вторичная кишка. При этом дорсальная губа бластопора задает также и передне-заднюю полярность зародыша-двойника (отсюда название — «Шпеманновский организатор»).

Вентральная эктодерма еще до наступления гаструляции коммитирована к развитию в эпидермис. Под влиянием «организатора» она утрачивает способность к синтезу эпидермальных маркеров (например, эпимуцина, цитокератинов) и в ней начинают обнаруживаться транскрипты нейроспецифических генов (т.н. архэнцефалическая индукция). Часто это явление называют «директивной» индукцией, так как изолированная эктодерма гаструлы амфибий в эксплантате способна к самодифференцировке в эпидермис. Индуктор же отменяет эту программу и включает «нейральный» путь развития.

По-видимому, «Шпеманновский организатор» секретирует целый набор различных сигнальных молекул, что приводит к двум сопряженным процессам: ингибированию эпидермальной дифференцировки и активации нейрального пути развития в дорсальной эктодерме. В то же время «организатор» обладает и мезо-дермализирующим действием.

Феномен «гетерогенной индукции», открытый в ЗОе годы XX в. поставил под сомнение возможность узкой специфичности действия эмбриональных индукторов. Многие экспериментальные данные (в т.ч. полученные группой Г. Шпеманна) позволили предполагать, что индуцирующий неспецифический сигнал лишь активирует программу, заложенную в самих реагирующих клетках (опыты Шпеманна и Шоттэ по индукции ротового аппарата, нейрализующее действие сублетального цитолиза, открытое Гольтфреттером).

Неудачи первых попыток идентификации индуцирующих веществ привели к необходимости исследования молекулярно-биохимических свойств самих реагирующих клеток до и после воздействия индукторов (Михайлов, 1984, 1988,1990; Saxen, 1979, 1989),.

Новый подход к исследованию эмбриональной индукции был основан на поиске функциональных аналогов эмбриональных индукторов среди известных биологически-активных факторов. Было показано, что фактор роста фибробла-стов млекопитающих — охарактеризованный ранее индивидуальный полипептид, оказывает сильное индуцирующее действие на эктодерму гаструлы, вызывая в ней формирование мезодермальных производных (Slack е.а., 1987; Slack, 1991). Вскоре было показано, что супернатанты из-под различных клеточных линий также характеризуются мезодермализующей активностью. Это позволило идентифицировать соответствующие белки.

По аналогии были получены из супернатантов от клеточных линий и идентифицированы белки, обладающие нейрализующим действием. Это позволило идентифицировать и клонировать соответствующие гены, с помощью метода гибридизации in situ изучить их экспрессию в «Шпеманновском организаторе», индуцировать или блокировать их активность в развитии и т. д.

Таким образом, биология развития вступила в новую фазу, связанную с успехами генетического анализа (Тидеман и др., 1993; Grunz, 1997; Harland, 1997 и ДР-).

Опыты с трансфильтровой индукцией показали, что нейрализующие факторы «Шпемапновского организатора» — секретируемые и способные к диффузии сигнальные молекулы (Saxen, 1961, 1979, 1989). Методом гибридизации in situ показана первоначальная их экспрессия в области организатора Шпеманна. Одним из первых естественных агентов, секретируемых в «Шпеманновском организаторе», оказался полипептид ноггин. В яйце имеется его материнская иРНК. Зи-готическая экспрессия начинается в дорсальной губе бластопора («организатора»). Инъекции м-РНК ноггина в оплодотворенные яйца шпорцевой лягушки или в бластоцель приводили к преобладанию головных структур в первом случае и к эффектам нейрализации эктодермы во втором (Zimmermann, 1996, Kelly, 1995, Hawley, 1996).

Другими нейрализующими факторами, секретируемыми в «организаторе», оказались фоллистатин — ингибитор эпидермальной дифференцировки (Hawley, 1995, Kelly, 1995), первые транскрипты которого были обнаружены в начале га-струляции, и активип (Kelly, 1995). Активин в неактивной форме обнаружен в яйце в желточных пластинках (Asashima, 1998), экспрессия его начинается со стадии средней бластулы в зоне организатораон поляризует клетки при инъекции, активирует их движение (Smith, Howard, 1992).

Так же в «Шпеманновском организаторе» экспрессируется секретируемый полипептид хордин, дорсо-специфичный фактор, впервые обнаруживаемый на стадии поздней бластулы в той же области — «презумптивного организатора», где и продолжается его экспрессия в течение гаструляции (Hawley, 1996, Sasai, 1995). Инъекции м-РНК хордина в вентральную область бластулы амфибий приводит к образованию вторичного осевого комплекса. В эксплантатах эктодермы гаструлы хордин вызывает пейрализующий эффект. Специфичным ингибитором хордина является секретируемая металлопротеаза Xolloid. Инъекция мРНК хордина ведет к экспрессии нейральных маркеров N-CAM и NF-M в отсутствии мезодермы (Sasai, 1995).

Нейрализующее действие хордина связано с его способностью инактивиро-вать ВМРз-фактор, способствующий эпидермальной дифференцировке (Willson, Hemmati-Brivanlon, 1995,1997).

К дорсо-специфичным белкам относится также церберус (Salic, 1997), введение мРНК которого в ранние зародыши способствует образованию дополнительных голов. Экспрессия этого гена также связана с «Шпеманновским организатором». В том же районе зародыша идентифицированы еще несколько ростовых факторов млекопитающих, которые в опытах с эксплантатами нейрализуют эктодерму гаструлы амфибий. Одни из них принадлежат к семейству трансформирующих факторов роста (TGFS), другие — к семейству факторов роста фиброб-ластов (FGF). Отметим, что факторы TGF —? являются ингибиторами пролиферации (Lawrence, 1984, Roberts е.а., 1985, Heine е.а., 1987) — факторы FGF также обусловливают утрату рецепторов к митогенным сигналам (Olwin, Hauschka, 1988).

В том же районе зародыша отмечена экспрессия гомеобокс-содержащих генов Xlim-1 и Siamois, которые способствуют индукции головных структур.

В общей сложности в зоне Шпеманновского организатора удалось идентифицировать семь секреторных протеинов и около десяти генов, которые можно разделить на следующие группы: гены, кодирующие секреторные протеины, го-меобоксные гены и гены, включающие Т-домен (Stennard, 1997). Все они участвуют в ранних этапах дифференцировки зародыша.

Таким образом, по современным представлениям, нейральная индукция является многоступенчатым процессом, в котором участвует ряд различных по своей природе и эффектам сигнальных агентов, синтезируемых именно «Шпеманновским организатором». При этом детерминация нейрального пути развития в эктодерме представляет собой результат антагонистических взаимодействий между активаторами и ингибиторами, препятствующими нейрализации. Это, в частности, было показано в опытах, где концентрированные среды из-под эктодер-мальных клеточных суспензий предотвращали нейрализацию целых фрагментов эктодермы в «сэндвичах» с дорсальной губой бластопора. Интересно, что дезагрегация клеток и вентральной, и дорсальной эктодермы без дополнительных воздействий способствует нейральной дифференцировке (превращению в нейроны) (Grunz, 1997).

В настоящее время наиболее признанным из представлений о механизмах нейральной индукции является модель «нейрального уклонения». Это означает, что эктодерма ранней гаструлы амфибий изначально детерминирована к эпидер-мальному пути развития. Если нарушить процесс эпидермальной дифференцировки диссоциацией эктодермы, инактивацией рецепторов ВМР4 и т. п., то эктодерма уклоняется от эпидермального пути и способна осуществить нейральный путь дифференцировки.

Многие исследователи считают, что основная функция различных нейраль-ных индукторов «Шпеманновского организатора» состоит в ингибировании эпидермальной дифференцировки.

Однако, А. Т. Михайлов отмечает, что при этом упускается из виду, что эксплантаты эктодермы гаструлы амфибий способны к самонейрализации — при сохранении клеточных контактов (у аксолотлей), при изменении свойств клеточных мембран под действием некоторых лектинов, например, конканавалина А, при активации внутриклеточных протеинкиназ и аденилатциклаз. Эти факты обращают наше внимание на участие неспецифичных факторов в механизмах индукции и активации эндогенных нейрализующих факторов в эктодерме.

Обнаруженное в последние годы многообразие нейральных индукторов может быть связано не только с различными функциями ингибирования эпидер-малы-юй и активацией нейральной дифференцировки, но также и с формированием компетенции эктодермальных клеток и пространственно-временными векторами.

Эмбриональные клетки кардинально отличаются от дифференцированных соматических клеток многими чертами своей структуры и метаболизма.

В раннем развитии клетки амфибий содержат многочисленные желточные гранулы, цитоплазма содержит многие регуляторные молекулы в зарепрессиро-ванном состоянии, ядро транскрипционно неактивно, объем цитоплазмы велик (ядерно-плазменное отношение нарушено), двухфазные клеточные циклы проходят очень быстро, эндомембранный комплекс менее развит, синтез белка не активен.

Поэтому первый этап подготовки к началу дифференциации — это неспецифическая активация и «созревание» клеток: синтез или демаскировка мембранных рецепторов, активация внутриклеточных сигнальных путей, включение транскрипционной функции ядра и активация аппарата синтеза белка.

Второй этап детерминации связан уже с активацией тканеспецифических генов, причем это происходит поэтапно через последовательные бифуркации (дивергенцию клеточных популяций) и постепенное сужение потенций к развитию. Гомеостатические и координирующие механизмы при этом различны: первый этап — «предетерминации» — управляется на эпигенетическом уровне: продукты материнских генов, ремоделирование хроматина ядер, активация транскрипционных факторов, инициация трансляции.

Концепция параметрического управления дифференцировкой (Чернавский, Соляник, Белоусов, 1980) акцентирует внимание на возможной роли неспецифического метаболизма в начальной дивергенции эмбриональной клеточной популяции. Математическая модель показывает, что при выходе популяции из неустойчивого состояния в некоторых условиях спонтанно возникает «бифуркация» работы генома на два устойчивых состояния — т. е. дифференцировка. В этой модели в качестве исходных использованы наши данные о повышении интенсивности свободнорадикальиых реакций в периоды соответствующие компетенции и детерминации эмбриональных зачатков у амфибий (Мелехова, 1976, 1977) и данные Т. В. Остроумовой (Остроумова, Белоусов, Михайлова, 1977).

Достижения молекулярной генетики развития ставят перед нами актуальную задачу выяснить механизмы связи свободнорадикальиых реакций как параметра окислительно-восстановительного гомеостаза клетки с процессами регуляции экспрессии генов, непосредственно участвующих в специализации клеток. Эти явления развертываются на микроуровне, во временных масштабах отдельных стадий развития. Система окислительно-восстановительного гомеостаза клетки по современными представлениям включает мембранные системы, от фазового состояния которых зависит активность мембраносвязанных ферментов. Такие явления как фазовое состояние фосфолипидов мембран, генерация АТФ, индукция нестабильности генома и реактивность клетки связаны с системой окислительно-восстановительного гомеостаза, частью которой является свобод-норадикальное окисление.

1.7. Некоторые принципы регуляции метаболизма. Свободнора-дикальные процессы как параметр окислительно-восстановительного гомеостаза клетки.

Метаболические процессы в живых клетках упорядочены во времени и во внутриклеточном пространстве. Клетка является открытой неравновесной системой, постоянно создающей и поддерживающей характерные структуры, что необходимо для роста и выживания. С термодинамической точки зрения для этого необходим постоянный проток энергии через систему. В клетках животных энергия получается при окислении органических веществ в ряде ферментативных реакций, сопряженных с синтезом АТФ. Окисление — общий процесс удаления электронов. Перенос электронов от углерода и водорода к кислороду энергетически выгоден. Обычно такой перенос электронов происходит ферментативным путем, постепенно. Макромолекулы находятся в метастабилыюм состоянии и нуждаются в энергии активации для перехода в более стабильную форму. Это осуществляется ферментами. Для ферментативных процессов важным моментом является узнавание субстрата и образование фермент-субстратного комплекса, которое происходит благодаря конформационному взаимодействию. Это значительно увеличивает скорость реакции. Большая часть энергии, выделенной в реакциях окисления, расходуется на образование АТФ в процессе митохондриального окислительного фосфорилирования. Сопряжение эндергонических реакций синтеза с экзэргоническими реакциями окисления осуществляется через порционный гидролиз АТФ, что и обеспечивает упорядоченность реакций в клетке (поддержание специфического состава внутриклеточной среды, перенос информации и организацию структур, самоорганизация цитоплазмы, способность клетки к перемещениям). Однако существует и иной путь — неферментативного окисления (см. ниже).

Можно отметить две стороны регуляции клеточного метаболизма: специфическую (через конформационные взаимодействия и узнавание) и тоническую (через порционную подачу энергии).

По современным представлениям, в регуляции метаболизма в эукариотиче-ских клетках ключевое участие принимают мембраны. Мембраны ответственны за компартментализацию (направленность во времени и пространстве) метаболических реакций, их интеграцию, активный транспорт ионов и ряда веществ, а также за явления возбудимости и передачу информационных сигналов. Благодаря компонентам плазматических мембран осуществляется прием информации: внешний сигнальный фактор действует на рецепторы мембраны, активируя их, и начинается каскад передачи сигнала с участием фосфорилирования: от белков-преобразователей в мембране к ферментам-усилителям, активирующим вторичные внутриклеточные мессенджеры (малые молекулы и ионы: цАМФ, цГМФ, инозитол-1,4,5-трифосфат (1Рз), диацилглицерол, ионы Са2+). В частности, контакт спермия с мембраной яйцеклетки вызывает триггерную реакцию с участием.

2+ фосфоинозитидной системы и Са, которая приводит к быстрой физиологической перестройке (активации) яйцеклетки (Berrige, Irvine, 1984; Гилберт, 1993). Помимо роли белков-рецепторов, ионных каналов и насосов, важной частью регуляции метаболизма является состав и фазовое состояние фосфолипидов мембран (Бурлакова, Эммануэль, 1965; Козлов, 1973; Бурлакова и др., 2001). В биомембранах локализованы важнейшие ферментные системы клетки, и от состояния фосфолипидных мицелл зависит скорость многих ферментативных процессов. Содержание фосфолипидов в мембранах органелл и клеток разных тканей специфично. В мембранных структурах происходит превращение и аккумуляция энергии. Фосфолипиды мембран играют большую роль в процессах гидролиза АТФ и, возможно, синтеза АТФ (Козлов, 1975; Каюшин, 1961, 1967; Кометиани, 1962, 1963; Бржевская и др., 1967, 1968; Дмитриев, 1997). Митохондриальные мембраны содержат большое количество ненасыщенных фосфолипидов, что делает их особенно чувствительными к прямому воздействию кислорода. Предполагается, что циклы свободнорадикального перекисного окисления-восстановления липидов митохондриальных мембран влияют на скорость процессов окислительного фосфорилирования (Дмитриев, 1986, 1997). В микросомах обнаружены ферментативная (НАДФ*Н-зависимая) и неферментативпая (аскор

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА бат-зависимая) системы ПОЛ, характеризующие состояние электрон-транспортной цепи этих органелл и их функциональное состояние (Рис. 2).

Система окислительно-восстановительных процессов составляет основу жизнедеятельности клетки и организма. Кислород играет ключевую роль в энергетике аэробных клеток. Основное количество кислорода расходуется в ферментативных реакциях окислительного фосфорилирования (клеточного дыхания) в митохондриях и в процессах микросомального окисления.

Небольшая часть поглощаемого кислорода восстанавливается нефермента-тивпым путем, через образование активных форм кислорода (АФК), являющихся свободными радикалами (СР) или быстро порождающими СР. Молекула кислорода в исходном состоянии является триплетпой, т. е. имеет на валентных орбита-лях два электрона с параллельными спинами. Прямая реакция такой молекулы с сипглетной (какими являются основные доноры электронов в клетке) невозможна. Для активации кислорода необходим переход его в возбужденное синглетное состояние.

Это происходит при участии металлов с переменной валентностью или при взаимодействии со свободными радикалами. При этом кислород превращается в свободный радикал. При возбуждении кислорода и его превращениях образуются активные формы кислорода (АФК). При взаимодействии органических молекул с АФК возникают органические свободные радикалы (СР) (Герасимов и др., 1998). СР характеризуются наличием неспаренного электрона на молекулярной или внешней атомной орбите, что придает им парамагнитные свойства и исключительно высокую реакционную способность. Рекомбинация СР энергетически выгодна, и участие СР в промежуточных этапах биохимических реакций снижает энергию активации (Козлов, 1973; Нонхибел, 1982). В нормальном метаболизме интактных клеток часть молекулярного кислорода генерирует эндогенные АФК. Важнейшими из них являются супероксидный анион-радикал (Ог5), синглетный кислород (О21), пероксид водорода (Н2О2), гидроксидный радикал (ОН*), а также оксид азота (N0) (рис.-схема). АФК закономерно возникают в процессах мито-хондриального (оксидазного) и микросомального (оксигеназного) окисления, при функционировании НАДФ*Н-оксидаз. Основными местами их образования в клетке являются митохондрии, эндоплазматический ретикулюм и ядерная мембрана (обзор: Бурлакова и др., 2001).

СР могут атаковать молекулу ДНК и вызывать в ней образование радикалов, что может приводить к копформационным изменениям.

Воздействие АФК на липиды мембран вызывает в них активацию перекис-ного окисления с образованием высокореакционных перекисных радикалов. Субстратами свободнорадикального перекисного окисления липидов (ПОЛ) являют.

УЛг.

ШнкАЫ егидрогеназ;

АТФ Ж синтазг цитохрои с убнхинон супероксиддисмутаза ксантиноксндаза гипоксантин ксантин.

Оз 02 флавинОНЧ-ОН-4^/^: оксид*"/ X/ Си 1-е, ии / Ог + ОН +ОН" .

НАД (Ф)Н оксидаза.

ЙзОгГ^^— н.

4—глутатнокпероксидаза супероксиддисмутаза.

Н+.

ОН + N03.

I Н+ огюо.

N0.

НАДН НАД+ Н2°" ~-^ глутатионпероксидаза.

АДФ АТФ.

Рис. 2. Метаболическая генерация активных форм кислорода в клетке. В заштрихованных овалах — сенсорные молекулы, в светлых кругах — молекулы проокси-дантов (по Е. Б. Бурлаковой и др., 2001 г.).

Рис. 3. Схема цепных СР процессов перекисного окисления липидов (липоперок-сидации) в клетке. Обозначения: ЬН — восстановленные молекулы липида, Ь — радикал липида, ЬО — алкоксил-радикал, ДН — донор водорода (по Ю. Б. Кудряшову, 2004) ся прежде всего полиненасыщенные ацилы фосфолипидов — важнейших структурных компонентов биологических мембран (Козлов и сотр., 1965 — 1975). Определенная упаковка белков и фосфолипидов в мембране, наличие в ней биостабилизаторов и антиоксидантов препятствует чрезмерному развитию ПОЛ. Действие любых хаотропных агентов различных факторов, вызывающих разрыхление мембран и конформационные изменения в их компонентах, вызывает самоускоряющееся развитие ПОЛ (Рис. 3).

Результатом этих процессов являются изменения проницаемости мембраны и активности мембраносвязанных ферментов. Предполагается, что эти процессы лежат в основе биологического эффекта слабых доз излучений и других химических и физических факторов на клетки и организмы (Козлов, 1973; Бурлакова и др., 1975, 2001). Таким образом, мембранный механизм усиления слабых повреждающих воздействий может лежать в основе реакции биологических объектов на различные стрессорные факторы (Бурлакова, 1994). Быстрое развитие СР-реакций сдерживается стабилизирующим участием антиоксидантов. Антиокси-данты при этом переходят также в СР-состояние. Но такие СР быстро рекомби-нируют и образовывают цепь СР-реакций.

Многие годы развитие ПОЛ в мембранах изучали в основном в связи с патологическими процессами после облучения, при канцерогенезе и т. д. Было показано, что изменение уровня СР-процессов характеризует ранние этапы различных патологических процессов. Однако важнейшим обстоятельством является необходимость определенного уровня свободнорадикальных процессов, и в том числе перекисного окисления липидов, для осуществления метаболических процессов в интактной клетке. В последние годы развиваются представления о системе окислительно-восстановительного гомеостаза клетки и об информационной роли СР в этой системе. Речь идет о единой прооксидантно-антиоксидантной системе, включающей механизмы управления клеточным метаболизмом через физико-химические изменения мембран. Прооксидантная часть этой регуляционной системы включает все процессы, протекающие с участием молекулярного кислорода. Антиоксидантная часть представлена антиокислительными ферментами — ка-талазой, супероксиддисмутазой, глутатионредуктазой, глутатионпероксидазойи соединениями, содержащими БН-группы (глутатион, цистеин), а также такими антиоксидантами как токоферол, убихинон, витамины С, Е, К (Бурлакова, Храпо-ва, 1985; Бешепга, 1999; Бурлакова и др., 2001), присутствующие в мембране и стабилизирующие ее.

Важным компонентом системы окислительно-восстановительного гомеостаза клетки являются мембраны, физико-химическое состояние которых (пластичность, жидкостность) зависит от уровня свободнорадикального окисления липидов и накопления перекисей. Активация ПОЛ ведет к изменению липидов и накопления перекисей. Активация ПОЛ ведет к изменению проницаемости мембран и функциональной активности ассоциированных с ними ферментов. Адаптационной реакцией мембран является изменение состава липидов: ускорение выхода легко окисляемых, наиболее ненасыщенных и замену их более резистентными к окислению (Бурлакова, Храпова, 1985). Это снижает скорость ПОЛ и возвращает ее к стационарному уровню. Таким образом, изменения концентрации АФК связаны с функциональным состоянием клеток. В этой системе регуляции сенсорную роль играют молекулы, воспринимающие биологически значимые сигналы об оксигенированности среды. Это супероксидный радикал (О2″), Н2О2 и оксид азота (Волин и др., 1998; Semenza, 1999). Условия гипоксии увеличивают активность ферментных систем, генерирующих АФК в разных ком-партментах. Изменение уровня сигнальных АФК приводит к запуску митоген-активируемых протеинкиназ, активирующих факторы транскрипции и экспрессию генов, влияющих на перестройку метаболических процессов.

Некоторые авторы доказывают влияние окислительного стресса па активность генов. Предполагается, что АФК служат субклеточными посредниками в регуляции экспрессии генов, а также в трансдукции сигналов (Allen, Tresini, 2000, Somansundaram, 2000). При облучении и стрессовых воздействиях увеличение продукции АФК является сигналом к быстрым и долгосрочным адаптационным реакциям. Вначале активируются ранние регуляторные гены — протоонкогены и у, стресс-белки, а затем — поздние структурые гены, в т. ч. CaАТФ-азы, антиокси-дантных ферментов (Малышев, Манухина, 1998; Iyer, Lehnart, 2000).

При различных повреждающих воздействиях АФК запускают активацию предсуществующих транскрипционных факторов посредством их фосфорилиро-вания при помощи активируемых митогенами протеинкиназ (МАРК). Эти транскрипционные факторы взаимодействуют с хроматином, вызывая активацию экспрессии генов белков стресса. Таким образом, CP участвуют в передаче информационных сигналов в клетке, изменяя режим ее работы (переключение на деление или специфическую функцию).

Свободные радикалы участвуют в интеграции клеточного метаболизма также и благодаря энергетическим особенностям реакций с их участием. АФК генерируются во всех частях клетки, они быстро взаимодействуют друг с другом, взаимопревращаясь, а также индуцируя в химических компонентах клетки (белках, нуклеиновых кислотах, углеводах, липидах) образование свободнорадикаль-ных состояний и перекисей. При окислительных процессах генерируется энергия электронного возбуждения, которая при определенных условиях может безизлу-чательно переноситься по системе быстро, на значительные расстояния, и впоследствии либо излучаться, либо тратиться на совершение физической или химической работы (Сент-Дьерди, 1960). При поглощении энергии высокой плотности происходит фотомодуляция активности ферментов и запускаются те или иные физиологические процессы в клетках (Баскаков, Воейков, 1996). Открытие фундаментального значения генерации электронного возбуждения в регуляции клеток принадлежит А. Г. Гурвичу («митогенетическое излучение»). Обнаружено, что необходимым фактором возникновения этого излучения является контакт реакционных систем с кислородом (Белоусов, Воейков, Попп, 1997). Важно, что свободные радикалы в биологических системах могут вызывать развитие цепных разветвленных реакций, что является механизмом усиления первичного слабого воздействия, порождающего АФК. В последующих фазах клеточного ответа радикалы рекомбинируют, цепные процессы обрываются.

АФК, таким образом, оказывают регуляторное действие на биологические системы за счет особых энергетических свойств реакций с их участием, возможности миграции энергии электронного возбуждения внутри клетки и во внеклеточной среде и благодаря эффекту усиления исходно слабых сигналов.

1.8. Свободнорадикальные процессы в эмбриогенезе.

Свободнорадикальные процессы и регуляторная прои антиоксидантная система играют важную роль в репродукции и эмбриогенезе.

При оплодотворении возникают явления «дыхательного взрыва». Одно из первых событий при оплодотворении — активация НАДФ*Н-оксидаз в мембранах яйцеклетки и спермия. Супероксиддисмутаза присутствует в сперматозоидах, ее активность пропорциональна подвижности спермиев. Продукция CP и антиокси-даптов у млекопитающих значительно возрастает при овуляции, во время и после имплантации. Супероксид играет важную роль в усилении текучести мембран при имплантации (Duran Reyes G. е.а., 1998).

У млекопитающих внутриутробный период жизни проходит при низких значениях рОг. Использование аэробного гликолиза энергетически обеспечивает плод. Гиперпродукция АФК приводит к возникновению аномалий (Fantel, Persin, 2002; Johnson, Nasr-Esfahani, 1994). Защитную роль играют антиокислительные ферменты — супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза и др. Матричные РНК этих ферментов имеются в ооцитах, эмбрионах и яйцеводах (Guerin е.а., 2001).

Белок Вс1−2, защищающий митохондриальные и ядерные мембраны от повреждений, связанных с развитием CP-реакций, играет важную роль в эмбриогенезе (Korsmeyer, 1993). С возрастом эмбриона увеличивается усиление системы антиоксидантов. Важную роль в защите от АФК играет желточный мешок (Zaken е.а., 2000; Hyungsuk е.а., 2001). У эмбрионов мыши зоны гибели клеток совпадают с зонами активной продукции АФК (Salas-Vidal е.а., 1998). Тератогенный эффект многих ксенобиотиков реализуется при их активации эмбриональными ци-тохромами Р450 и другими прооксидантными ферментами с образованием сво-боднорадикальных интермедиатов. Предполагается, что CP-механизм вовлечен в общий механизм эмбриопатий (Wells е.а., 1997). АФК регулируют явления апоп-тоза, необходимые в развитии органов зародыша.

Для исследования CP в биологических системах применяются три основные группы методов. Радиоспектроскопические методы (метод электронного парамагнитного резонанса — ЭПР (Завойский, 1944), метод двойного электронно-ядерного резонанса — ДЭЯР (Hide, 1964, 1967), а также метод спин-меток (McConnell, 1967)) регистрируют большей частью долгоживущие СР. Эти методы дают возможность оценить не только количество CP в системе, но и получить сведения о структуре радикалов и идентифицировать CP различной природы. Метод ЭПР позволяет одновременно контролировать и изменение концентраций CP, и изменение валентности ионов металлов, что дает возможность при исследовании ферментных систем судить и о том, с какими изменениями валентности связана активность фермента, и о характере первичных и вторичных реакций в процессах ферментативного катализа (Ingram, 1969). Метод ДЭЯР позволяет исследовать электронную структуру и конформационные превращения СР-состояний биологических макромолекул. Применение спиновых зондов дает возможность получать информацию об участии CP в конформационных перестройках клеточных мембран (Кольтовер, 1972, 1974). CP-реакции в биологических системах изучают также по сопровождающей их люминесценции (Владимиров, Литвин, 1959; Шляпинтох и др., 1961). Методом хемилюминесценции может быть получена информация как об интенсивности окислительных деструктивных процессов в клетках, так и о наличии в них защитной ингибиторной системы эндогенных антиоксидантовпри этом исследуются CP-реакции с участием корот-коживущих продуктов липидного происхождения (Владимиров и Арчаков, 1972; Эммануэль и др., 1965; Иванов, 1966; Петрусевич, 1967; Тарусов и др., 1961; Владимиров, 2000). Наконец метод привитой сополимеризации (ПС) (Козлов, Тарусов, 1961; Козлов, 1970), основанный на высокой реакционной способности CP, в силу чего CP инициируют полимеризацию ненасыщенных мономерных соединений-индикаторов. При этом образуются сополимеры — комплексные соединения полимеризованного индикатора и инициирующего радикала. Этот метод позволяет оценить их относительную концентрацию в клетке in vivo и ее орга-пеллах, ее изменения при различных воздействиях на организм, а также выявить гистологическую локализацию меченых привитых сополимеров методом авторадиографии. Метод ПС высокочувствителен и дает возможность сравнивать относительные суммарные концентрации долгои короткоживущих CP в небольших группах клеток, что обуславливает перспективность его применения на эмбриологических объектах.

Этим методом было показано участие CP-процессов в работе Na, К-АТФазы, в транспорте Са через мембрану, в передаче нервного импульса, по нервному волокну, в процессах микросомального окисления ксенобиотиков, явления индукции CP-окисления липидов, в зрительной рецепции (работы лаборатории физико-химии мембран МГУ: Гулак, Данилов, Каган, Козлов, Коссова, Ко-телевцев, Лимаренко, Новиков, Ситковский, Третьяк и др., обзор: Козлов, 1973).

В наших работах с применением этого метода было показано участие СР-процессов в детерминации эмбрионального глазного зачатка и характерная их локализация в индукционных системах (Мелехова, 1976а, б, 1977).

Заключение

.

• Основные термодинамические теории развития связывают управляющие факторы эмбриогенеза с процессами энергообмена.

• В эмбриогенезе сочетаются принципы генетического детерминизма и самоорганизации.

• Генетический анализ развития показал, что в эмбриогенезе экспрессия сложной системы генов осуществляется на основе взаимодействия активирующих и тормозящих влияний.

• До начала экспрессии собственного генома зародыша регуляция развития осуществляется на уровне трансляции материнских матриц.

• В дальнейшем развитии регуляция на уровне трансляции заранее синтезированных матриц также играет большую роль.

• По мере развития в зародыше возникают центры активации экспрессии генов, локализованные в известных индукционных системах.

• Современные представления о природе и метаболической роли свободно-радикальных процессов в клетке позволяют предполагать их ключевую роль в пространственно-временной организации эмбриогенеза.

• Метод выявления свободных радикалов по реакции привитой сополимери-зации меченого индикатора в сочетании с гиставторадиографией позволяет исследовать свободные радикалы в зачат ках органов in situ.

• Нами ранее показано участие свободнорадикальных процессов в процессах детерминации зародышевых клеточных популяций и повышение их чувствительности к повреждающим слабым воздействиям.

Исходя из этого, задачами нашей работы являются: получение карт распределения относительных концентраций CP в клеточных популяциях зародыша на последовательных стадиях развитияисследование субклеточной локализации и биохимических субстратов СР-реакций, а также исследование механизмов дифференциальной чувствительности эмбриональных зачатков к повреждениям. Полученные данные применить для биотестирования качества водной среды.

Эти сведения должны послужить обоснованию развиваемых нами представлений о координирующей роль свободнорадикальных процессов в эмбриогенезе.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

выводы.

В работе выдвинута и экспериментально обоснована гипотеза «эпигенетической программы» эмбриогенеза. Подробно исследовано поведение одного из параметров окислителыю-восстановителыюго гомеостаза — общего уровня свободных радикалов. Для выявления свободных радикалов применен метод привитой сополимеризации в сочетании с гистоавторадиографией и радиометрией.

1. Получены карты распределения относительных концентраций свободных радикалов в зародышах бесхвостых амфибий на последовательных стадиях развития.

2. Локальное повышение уровня СР, опосредующее скорость энергетического обмена, соответствует формированию компетенции эмбриональных зачатков, и характеризует предбифуркационный период детерминации.

3. Временная организация СР-процессов в эмбриогенезе определяется трех-вершинными суточными ритмами СР-процессов в зародышах, общим повышением уровня СР-реакций в периоды, предшествующие смене гомеостатических механизмов, а также локальными различиями уровня СР в отдельных зачатках, характеризующими их «биологический возраст» и участие в индукционных системах.

4. В эмбриональном периоде высокий уровень радикалообразования в ядрах и желточных гранулах предшествует началу транскрипции и сопровождает детерминацию зародышевых листков.

5. В личиночном периоде, при дифференцировке зачатков, наиболее высокий уровень радикалообразования обнаружен в митохондриях.

6. При измерении уровня радикалообразования в различных биохимических фракциях обнаружено преимущественное участие СР-реакций в липидпом обмене (главным образом во фракции полифосфоинозитидов).

7. Наибольшая чувствительность зародыша и его зачатков к повреждающим факторам (рентгеновскому и лазерному облучению, химическим и гравитационным воздействиям) характеризует детерминирующиеся группы клеток, отличающиеся в норме повышенным уровнем радикалообразования.

8. Характер аномалий развития, возникающих после повреждающих воздействий на эмбрионы и личинки, отражает поражение наиболее уязвимых — детерминирующихся — зачатков, и может служить как для детекции слабых доз повреждающих факторов, так и для изучения механизмов развития.

9. Предложены принципы эмбриомониторинга качества водной среды, разработаны и внедрены способы оценки ее токсичности, основанные на применении эмбриональных тест-объектов в критических фазах развития и тест-реакции.

— измерении адаптационного стресса с помощью выявления изменений уровня свободнорадикальпых реакций.

10. Разработанные и запатентованные методы применены в комплексной экологической экспертизе природных вод. Полученные результаты сопоставлены с результатами определения качества вод другими биологическими и аналитическими методами.

11. На основе полученных данных на примере амфибий предложена гипотеза «эпигенетической программы» эмбриогенеза, заложенной в цитоплазме зиготы соотношением субстратов, промоторов и ингибиторов свободнорадикального окисления. Согласно этой гипотезе, самоорганизация энергетических процессов в раннем развитии может определять формирование свойства компетенции и затем подготавливает бифуркационное поведение детерминирующихся зачатков. Параметром порядка, определяющим общую динамику этих процессов, может служить уровень свободнорадикальных окислительно-восстановительных реакций.

5.6.

Заключение

.

В 5 части работы представлены данные биотестирования сточных и природных вод, полученные запатентованными нами методами, включенные в регламент проведения комплексной экологической экспертизы. По результатам работы можно заключить, что паши данные в основном хорошо согласуются с данными долгосрочных наблюдений видового состава гидробиоптов в загрязненных и чистых водоемах. Таким образом, метаболический экспресс-анализ на простых биотестах дает возможность сделать первичное заключение о наличии опасных для биоты загрязнений. Однако в дальнейшем требуется идентифицировать источник опасности с применением аналитических методов. Необходимо отметить, что предложенный нами метод мониторинга дает возможность выявить интегральное действие на биотесты различных комбинаций поллютаптов.

Включение биотестирования в комплексную экспертизу экологического состояния промышленного района позволило отметить также резкое ухудшение состояния здоровья людей на территории, где результаты биотестирования и биоиндикации указывают на токсичность воды в природных и питьевых водоисточниках (см. раздел «Экологический диагноз города Зыряновска»),.

Глава 5.

ЯВЛЕНИЯ САМООРГАНИЗАЦИИ В ЭМБРИОГЕНЕЗЕ. РОЛЬ ДИНАМИЧЕСКОГО ХАОСА В РАЗВИВАЮЩИХСЯ СИСТЕМАХ.

5.1. Явления самоорганизации в эмбриогенезе.

Согласно теории самоорганизации внутреннее пространство эмбриона можно рассматривать как активную нелинейную среду, проявляющую неравномерную чувствительность к внешним воздействиям и демонстрирующую пороговые эффекты и характерные метаболические параметрыэти параметры флуктуируют под воздействием возмущений, способных самопроизвольно усиливаться или исчезать (диссипировать). В таких средах возможны необратимые процессы, которые могут быть локализованы в пространственно-временные структуры.

Клетки ведут себя и согласно специфическим химическим сигналам, и в соответствии с энергетической регуляцией, которая определяет, возможны ли вообще восприятие управляющего сигнала и реакция на него со стороны клеток. Таким образом, в начальный период индивидуального развития, то есть до того как включено функционирование собственного генома, вероятность управляющей роли энергетических параметров высока. Мы избрали один из метаболических индикаторов, — уровень свободиорадикальиых реакций. Свободные радикалы (СР) формируются как промежуточный продукт различных окислительно-восстановительных реакций, в том числе характеризующих синтез АТФ (Коме-тиани, Каюшин, 1964) и фазовое состояние фосфолипидов митохондриальных мембран (Дмитриев, 1997). Их общий уровень может считаться одним из параметров окислительно-восстановительного гомеостаза. По своей природе такой индикатор интегрален, то есть, представляет общую концентрацию СР в испытуемом объекте. Представляется, что СР могут послужить мерой для скорости энергообмепа (запасения и расходования энергии) в клетке.

Установлено, что в результате оплодотворения возникало неравномерное распределение СР реакций (плотность треков). Вслед за этим в результате дробления появлялась многоклеточная область, в которой СР реакции носили признаки самоускорения (рис. 1). В этой области относительная концентрация СР проявляла резкие беспорядочные (не привязанные к какой-либо определенной клетке) флуктуации. Очень скоро плотность СР в этой области увеличивалась на порядок. Затем, клеточные циклы замедлялись и начиналась экспрессия генов, указывая на возникновение дифферепцировки (рис. 4). В области эмбриона, которая осталась «иизкоэнергетической», вышеуказанные события наступали позже, но также начинались с нарастанием энергообмена (ростом уровня СР).

В любой из последующих фаз развития детерминация (бифуркация) клеточных типов всегда начинается с разделения на области пониженной и области повышенной СР-активности (рис. 21). В фазе органогенеза эмбриональная индукция становится главным механизмом координирующим расположение дифференцируемых клеточных типов по отношению друг другу. Подобный «энергетический паттерн» был обнаружен в различных индукционных системах: индуктором оказывался старший (по биологическому возрасту) зачаток, отличавшийся более высоким уровнем СР. В результате контакта с индуктором, в «младшем» зачатке повышался уровень СР-реакций, и это предшествовало дифференциров-ке.

Стадии развития.

Рис. 21. Бифуркации интенсивности СР реакций в зачатке хрусталика, предшествующие дифференцировке клеток и формированию зон хрусталика у травяной лягушки. Изменения ДС/Сср относительной концентрации СР происходят в хрусталике во время детерминации и дивергентной дифференцировки отдельных групп его клеток: о — линзообразующей эктодермы, • - переднего эпителия,? — первичных волокони ¦ - вторичных волокон.

На пике энергообмена, в период детерминации (когда выбирается один из альтернативных путей дифференцировки), клетки становятся неустойчивыми и высокочувствительными. Они реагируют даже на слабые повреждающие воздействия (включая воздействие загрязненной среды) нарушением дифференцировки.

Как результат, могут возникать аномалии развития. Эти эффекты носят статистический характер и ответ на повреждения индивидуален.

Таким образом, на пике энергетического метаболизма, в момент бифуркации — выбора одного из альтернативных путей дальнейшего развития клетки становятся высокочувствительными и способны резко реагировать нарушением дифференцировки на сверх-слабые химические или физические воздействия. Это состояние может быть названо «детерминированным хаосом» (Аршинов, Буданов, 1994). При загрязнении среды, окружающей зародыш, это приводит к возникновению характерных уродств. Проблема механизма тератогенеза (возникновения уродств) очень актуальна, т.к. например эмбриональная смертность у человека в результате нарушений развития достигает 50%, и в последние годы растет число детей с врожденными уродствами. У животных тератогенез приводит к снижению численности популяций и вымиранию.

В нормальном развитии эта повышенная чувствительность, видимо, является необходимым условием компетенции — спонтанно возникающей в определенный момент «внутреннего времени» способности к восприятию сигналов к началу дифференцировки.

На основе этих результатов нами разработаны новые способы биоиндикации загрязнений окружающей среды на эмбриональных биотестах, на которые получены авторские свидетельства. Тот же метод позволяет обнаруживать и исследовать влияние сверхмалых доз химических и физических факторов на эмбриональное развитие.

Представляется вероятным, что при нормальном развитии подобная повышенная чувствительность и неустойчивость клеточных популяций является критическим условием для явлений компетенции. Последние возникают самопроизвольно в определенные моменты индивидуального времени как способность воспринимать сигналы для начала дифференцировки.

6.2. Роль динамического хаоса в развитии.

Судя по экспериментальным данным, состояния неустойчивости, закономерно возникающие при эмбриогенезе, являются необходимым условием для дифференцировки и развития эмбриона. Энергетический метаболизм и изменения окислительно-восстановительного гомеостаза клетки представляют собой факторы, которые управляют наступлением состояния неустойчивости. Условием неустойчивости, судя по нашим данным, является повышение уровня и неравномерности распределения СР-реакций. Это предполагает определенную непредсказуемость судьбы каждой клетки, то есть коррелирует с понятием хаотического состояния (Ruelle, 2001). Заметная хаотическая компонента представляется необходимым элементом в явлении перехода между двумя различными гомеостатиче-скими состояниями развивающейся системы. По-видимому, области неустойчивости локализованы в индивидуальном времени и внутреннем пространстве эмбриона в соответствии с эпигеномной программой. Последняя должна быть изначально встроена в цитоплазму яйцеклетки через неравномерное распределение субстратов, промоторов и ингибиторов СР реакций. Эта программа реализуется через соотношение между уровнями энергообмена и свободиорадикальных процессов, присущими различным областям развивающегося эмбриона.

Можно ожидать, что критические количества субстратов, промоторов и ингибиторов свободиорадикальных реакций, а также соотношение этих количеств должны служить элементами, формирующими индивидуальное время, изначально зарезервированное для эмбриогенеза определенных видов. Индивидуальный возраст определенных клеточных популяций определяется потребленными долями энергосубстратов. Интенсивность окислительно-восстановительных СР реакций представляется тем параметром порядка, который может контролировать наступления событий дифференцировки в эмбриогенезе.

Таким образом, в развитии зародыша реализуются принципы как детерминизма, так и самоорганизации. Первый принцип выражен в генетической программе развития и всех биохимических возможностей организма. Второй принцип реализуется посредством цепных самоускоряющихся процессов СР-окисления, которые, изменяя состояние мембранного аппарата и энергетических систем клетки, приводят ее в неустойчивое состояние. Это определяет время и место активации экспрессии генов и начала морфогенетических событий.

Д.С. Чернавский (2004) считает, что параметрическое управление эмбриогенезом осуществляется на всех его стадиях. При этом дифференцировка начинается тогда, когда концентрация некоторого неспецифического фактора превышает пороговое значения (Чернавский, Соляник, Белоусов, 1980, 1985). Наши исследования (Мелехова, 1976, 1990, 2000, 2003) раскрывают конкретные пути реализации такого управления в эмбриогенезе низших позвоночных.