Диплом, курсовая, контрольная работа
Помощь в написании студенческих работ

Окислительное расщепление нуклеиновых кислот конъюгатами блеомицина с олигонуклеотидами

Диссертация: Окислительное расщепление нуклеиновых кислот конъюгатами блеомицина с олигонуклеотидами
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Реакционные смеси объемом 10 мкл содержали 5'-32Р-меченую мишень, конъюгат блеомицина с олигонуклеотидом, а также олигонуклеотиды — эффекторы (концентрации мишени, конъюгата и эффекторов указаны в каждом конкретном случае). Реакцию проводили в буферном растворе 0.2 М LiCl, 0.01 М трис-HCI pH 7.5. Реакцию инициировали одновременным добавлением раствора 2-меркаптоэтанола до концентрации 0.05… Читать ещё >

Содержание

  • Список сокращений
  • 1. Введение
  • 2. Взаимодействие блеомицина и его олигонуклеотидных производных с нуклеиновыми кислотами (обзор литературы)
    • 2. 1. Общая характеристика блеомицинов
    • 2. 2. Структура блеомицинов
    • 2. 3. Активация комплексов блеомицина с ионами железа
    • 2. 4. Связывание блеомицина с нуклеиновыми кислотами
    • 2. 5. Специфичность расщепления нуклеиновых кислот блеомицином
    • 2. 6. Эффективность расщепления РНК блеомицином
      • 2. 6. 1. Сравнение эффективности расщепления различных РНК
      • 2. 6. 2. Зависимость эффективности расщепления от концентрации ионов магния
    • 2. 7. Продукты расщепления нуклеиновых кислот блеомицином
    • 2. 8. Свойства конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами
      • 2. 8. 1. Синтез конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами
      • 2. 8. 2. Стабилизация комплементарных комплексов конъюгат-мишень остатком блеомицина
      • 2. 8. 3. Сайт-специфическое расщепление одноцепочечных ДНК
      • 2. 8. 4. Каталитическое расщепление одноцепочечной ДНК олигонуклеотидным конъюгатом блеомицина
      • 2. 8. 5. Расщепление двуцепочечной ДНК в составе триплекса
  • 3. Расщепление нуклеиновых кислот блеомициновыми производными олигонуклеотидов (Результаты и обсуждение)
    • 3. 1. Синтез блеомициновых производных олигонуклеотидов
      • 3. 1. 1. Синтез стандартных конъюгатов
      • 3. 1. 2. Синтез линкерсодержащих конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами
    • 3. 2. Расщепление одноцепочечных ДНК конъюгатами блеомицина с олигонуклеотидами
      • 3. 2. 1. Расщепление одноцепочечных ДНК конъюгатами блеомицина с протяженной олигонуклеотидной частью
      • 3. 2. 2. Расщепление ДНК конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотидами в присутствии олигонуклеотидных эффекторов
        • 3. 2. 2. 1. Факторы, определяющие эффективность расщепления одноцепочечных ДНК конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотидами в составе тандемных комплексов

        3.2.3. Влияние гидрофобных и гетероциклических группировок в составе конъюгата и эффекторов на эффективность расщепления одноцепочечной ДНК конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотидами в составе тандемных комплексов.

        3.3. Субстратные свойства гибридных дуплексов, образованных с участием тандемов производных коротких олигонуклеотидов по отношению к рибонуклеазе Н Е. coli.

        3.3.1. Гидролиз РНК рибонуклеазой Н Е. coli в составе гибридного дуплекса, образованного с участием немодифицированного тандема коротких олигодезоксирибонуклеотидов

        3.3.2. Субстратные свойства тандемных гибридных дуплексов, содержащих конъюгаты блеомицина с короткими олигонуклеотидами, по отношению к рибонуклеазе Н Е. coli.

        3.4. Расщепление РНК конъюгатами блеомицина с олигодезоксирибонуклеотидами.

        3.5. Расщепление двуцепочечной ДНК конъюгатами блеомицина с триплекс-формирующими олигонуклеотидами (ТФО).

Окислительное расщепление нуклеиновых кислот конъюгатами блеомицина с олигонуклеотидами (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Реакционноспособные производные олигонуклеотидов (РПО) широко применяются в исследовательской практике для изучения структуры и функций важнейших биополимеров — белков и нуклеиновых кислот. Направленная модификация нуклеиновых кислот при помощи РПО является одним из основных подходов к решению целого ряда задач. В их числе — исследование нуклеиново-белковых взаимодействий, манипулирование генетическим материалом, регуляция экспрессии гена, генная конверсия. К настоящему времени создан широкий спектр РПО, включающий олигонуклеотиды, несущие различные алкилирующие группы, фотоактивные остатки, металлокомплексы. Среди последних наибольший интерес представляют металлокомплексы, принимающие участие в циклических процессах окислениявосстановления. К числу таких группировок принадлежит остаток гликопептидного антибиотика блеомицина, обладающий рядом уникальных свойств. Наиболее важными из них являются:

— способность вызывать прямое (наблюдаемое без дополнительных обработок) расщепление ДНК и РНК;

— высокая селективность окисления дезоксирибозы и рибозы (гетероциклические основания практически не модифицируются);

— относительно низкая токсичность, позволяющая применять антибиотик как противоопухолевое средство в терапевтической практике.

В ЛХНК НИБХ СО РАН впервые были созданы блеомициновые производные олигонуклеотидов. Был разработан способ конъюгирования блеомицина А5 и олигонуклеотидов с сохранением способности олигонуклеотидов образовывать комплементарные комплексы, а остатка блеомицина — осуществлять селективное расщепление ДНК. Первые исследования показали, что конъюгаты блеомицина с олигонуклеотидами обладают рядом уникальных свойств. Они могут эффективно расщеплять одноцепочечные ДНК в составе комплементарных дуплексов. В зависимости от условий одна молекула конъюгата может повреждать до трех молекул ДНК или наносить несколько повреждений одной молекуле мишени. Кроме того, было выявлено, что остаток блеомицина в составе олиготимидилата способен осуществлять прямые разрывы двуцепочечных ДНК в триплексах. До сих пор неизвестны другие конъюгаты олигонуклеотидов, обладающие столь уникальными свойствами. Полученные результаты безусловно свидетельствовали о том, что конъюгаты блеомицина с олигонуклеотидами являются одними из наиболее перспективных реакционноспособных производных олигонуклеотидов. Такие конъюгаты могут найти применение в антисенси антигенном подходах к регуляции экспрессии гена, для генной конверсии, а также могут быть использованы в молекулярно-биологических исследованиях в качестве эффективных искусственных нуклеаз с уникальной специфичностью. Низкая токсичность блеомицина позволяет также надеяться на возможность использования его конъюгатов с олигонуклеотидами в качестве терапевтических средств.

В данной работе исследовано взаимодействие блеомициновых производных олигонуклеотидов в составе тандемных комплексов с одноцепочечной ДНК, в составе триплексов с двуцепочечной ДНК и впервые показана возможность расщепления РНК конъюгатами блеомицина с олигодезоксирибонуклеотидами. Также в работе показано, что остаток блеомицина не препятствует гидролизу РНК РНКазой Н Е. соИ в составе гибридных дуплексов.

Научная новизна и практическая ценность.

В настоящей работе впервые исследовано расщепление фрагментов ДНК конъюгатами блеомицина с олигонуклеотидами в тандемных комплексах с олигонуклеотидными эффекторами. Показано, что в тандемных комплексах одна молекула конъюгата блеомицина с тетрануклеотидом может расщепить свыше 6 молекул ДНК-мишени. Обнаружено, что максимальную эффективность проявляют конъюгаты с коротким олигонуклеотидным адресом (4−5 нуклеотидов), повреждающие ДНК-мишень в сайте связывания конъюгата.

Впервые показана возможность расщепления РНК (30-звенного фрагмента) конъюгатами блеомицина с олигодезоксирибонуклеотидами.

Разработан метод синтеза новых конъюгатов блеомицина с олигонуклеотидами, содержащих линкеры на основе гексаэтиленгликольфосфата. Показано, что такие конъюгаты более эффективно расщепляют двуцепочечные ДНК в составе триплексов. Также показано, что использование линкерсодержащих конъюгатов позволяет существенно повысить эффективность направленного расщепления РНК за счет формирования в цепи РНК однонуклеотидных петель, являющихся сайтами предпочтительного связывания остатка блеомицина, и его доставки к таким сайтам при помощи линкера оптимальной длины.

Выявлено, что субстратные свойства блеомициновых производных коротких олигонуклеотидов в составе тандемных гибридных дуплексов по отношению к рибонуклеазе Н Е. соИ близки к таковым для протяженных олигонуклеотидов. Результаты этого исследования позволяют рассчитывать на успешное применение разработанных конъюгатов в качестве искусственных нуклеаз, а также эффективных ген-направленных соединений.

Публикации и апробация работы.

По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

5. Выводы:

1. Созданы и исследованы тандемные системы, содержащие конъюгаты коротких олигонуклеотидов с блеомицином As и олигонуклеотидные эффекторы.

Показано, что независимо от длины и последовательности олигонуклеотидного адреса, все исследованные конъюгаты в составе тандемных комплексов сайт-специфически взаимодействуют с комплементарными ДНК-мишенями, многократно вызывая расщепление мишени в области связывания конъюгата. Наибольшую эффективность (деструкция более 6 молекул ДНК-мишени одной молекулой конъюгата в составе тандема) проявляют конъюгаты блеомицина с тетрануклеотидами, расщепляющие ДНК-мишень в собственном сайте связывания. Установлено, что ключевыми факторами, определяющими эффективность таких конъюгатов в составе тандемов являются, с одной стороны, высокая степень ассоциации комплекса конъюгагДНК-мишень, обеспечиваемая эффекторами, и, с другой стороны, быстрая диссоциация реагента из комплекса с поврежденной ДНК мишенью.

2. Синтезированы конъюгаты нового типа, в которых остаток блеомицина As присоединен к олигонуклеотиду через линкер, состоящий из остатков гексаэтиленгликольфосфата (от одного до четырех остатков). Показано, что линкерсодержащие конъюгаты блеомицина с гексадекатимидилатом более эффективно расщепляют обе цепи ДНК в составе триплекса по сравнению со стандартными конъюгатами.

3. Впервые продемонстрировано, что конъюгаты блеомицина с олигодезоксирибонуклеотидами способны вызывать сайт-специфическое расщепление фрагмента РНК.

Показано, что эффективность расщепления РНК линкерсодержащими конъюгатами может быть существенно (до 3 раз) повышена за счет формирования олигонуклеотидной частью конъюгата в цепи РНК однонуклеотидных петель, являющихся сайтами предпочтительного связывания остатка блеомицина.

4. Исследовано расщепление РНК рибонуклеазой Н Е. coli в непрерывных и тандемных гибридных дуплексах с олигонуклеотидами, несущими на 5'-концевой фосфатной группе остаток блеомицина. Показано, что наличие остатка блеомицина не препятствует гидролизу РНК мишени рибонуклеазой Н в тандемных комплексах, и снижает его скорость в 3−4 раза в случае непрерывных комплексов.

3.6.

Заключение

.

Результаты данного исследования позволяют заключить, что конъюгаты блеомицина с олигопуклеотидами способны эффективно расщеплять ДНК (как, а дуплексах так и в триплексах) и РНК в гибридных дуплексах. Таким образом, конъюгаты блеомицина с олигонуклеотидами могут быть использованы в качестве искусственных нуклеаз РНК и ДНК, а также могут рассматриваться в качестве потенциальных антисенс-агентов для подавления экспрессии патогенных ДНК и в качестве индукторов гомологичной рекомбинации для конверсии мутантных генов.

4. Экспериментальная часть.

4.1. Исходные материалы.

В работе были использованы следующие реактивы и растворители: трифенилфосфин, 2,2'-дипиридилдисульфид, Ы, Ы, ЫЫ'-этилендиаминтетрауксусная кислота, цетилтриметиламмония бромид, ^^К'^'-тетраметилэтилендиамин, гидразин-гидрат (Fluka AG, Швейцария), 2-меркаптоэтанол, трис (оксиметил)аминометан (Merck), аденозин-5'-трифосфат, акриламид,М-метиленбисакриламид, Stains-all (Acros Organics, США), карбамид, аммония персульфат, 4-Ы, М-диметиламинопиридин-1-оксид (Frinton Laboratories, США), железа (П)-аммония сульфата гексагидрат (х.ч.), ацетон (о.с.ч.), ацетонитрил (о.с.ч.), полинуклеотидкиназа фага Т4 (КФ 2.7.1.78) (Сибэнзим, Россия), рибонуклеаза Н Е. coli (КФ 3.1.26.4) (Promega, США).

Олигодезоксирибонуклеотиды (в т.ч. и линкерсодержащие) были синтезированы твердофазным фосфитамидным методом на автоматических синтезаторах Виктория 8 М (Россия) и ASM700 (Биоссет, Россия) и любезно предоставлены А. С. Левиной, Д. В. Пышным и И. А. Пышной (ИХБФМ СО РАН). Эстрони холестеринсодержащие тетрануклеотиды, а также дифеназиниевые производные октануклеотидов были синтезированы модифицированным триэфирным методом [130] и любезно предоставлены И. А. Пышной (ИХБФМ СО РАН). Эйкозарибонуклеотид UGCCUGGAGCUGCUUGAUGC синтезирован по методу [131] и любезно предоставлен А. Г. Веньяминовой и М. Н. Репковой (ИХБФМ СО РАН).

Гидрохлорид блеомицина А5 (95% основного вещества) производства опытного завода Института органического синтеза (Латвия).

4.2. Основные методы работы.

Выделение нуклеотидного материала из водных растворов проводили при помощи осаждения 10-кратным объемным избытком 2% раствора L1CIO4 в ацетоне. Осадок отделяли центрифугированием на микроцентрифугах D 5414 или Minispin Plus (Eppendorf, ФРГ) при 14 ООО об/мин. После удаления супернатанта осадок промывали ацетоном, ацетон удаляли высушиванием в вакуум-эксикаторе при остаточном давлении 15−20 мм. рт. ст.

Для концентрирования водных растворов использовали ротационные испарители RE-120 и R-200 (Biichi, Швейцария) а также концентратор 5301 (Eppendorf, ФРГ). Концентрирование проводили при температуре не выше 45 °C.

4.2.1. Хроматографические методы.

Обращенно-фазовая ВЭЖХ проводилась на хроматографе Waters 600Е на колонках 4×250мм.

Синтезированные олигонуклеотиды, содержащие диметокситритильную защитную группу, после удаления прочих защитных групп и полимерного носителя выделяли обращенно-фазовой хроматографией на носителе LiChroprep RP-18 (5−20 мкм) (Merck, ФРГ) в градиенте ацетонитрила 0−30% в 0.05 М LiC104. Диметокситритильную защитную группу удаляли обработкой 80% уксусной кислотой в течение 5 мин.

Олигонуклеотиды, содержащие концевую фосфатную группу, после деблокирования выделяли ионообменной хроматографией на сорбенте Полисил СА [132] в градиенте КН2РО4 0−0.3 М в 30% ацетонитриле.

Олигонуклеотиды после удаления диметокситритильной группы либо после ионообменной хроматографии дополнительно очищали обращенно-фазовой хроматографией на носителе LiChroprep RP-18 (5−20 мкм) (Merck, ФРГ) в градиенте ацетонитрила 0−20% в 0.05 М L1CIO4.

Медьсодержащий комплекс блеомицина выделяли обращенно-фазовой хроматографией на носителе LiChroprep RP-18 (5−20 мкм) (Merck, ФРГ) в градиенте ацетонитрила 0−40% в 0.05 М LiC104.

Конъюгаты блеомицина с олигонуклеотидами выделяли ионообменной хроматографией на колонке Resource Q, 1 ml (Amersham Pharmacia Biotech AB, Швеция) в градиенте LiC104 0−0.5 M в 0.01 М LiOH, затем обращенно-фазовой хроматографией на сорбенте PRP-1 (10 мкм) (Hamilton, США) в градиенте ацетонитрила 0−30% в 0.05 М LiC104.

4.2.2. Электрофорез.

Все электрофоретические разделения проводили в 20%-ном денатурирующем полиакриламидном геле в присутствии 8 М мочевины, 0.89 М Трис-НзВОз рН 8.3, 0.001 М о.

ЭДТА при напряженности электрического поля 40−60 В/см и температуре 30−40 С.

Для анализа гомогенности олигонуклеотидов и конъюгатов использовали гель толщиной 0.4 мм. По окончании разделения гели окрашивали 0.1% раствором Stains-all в 50% водном формамиде.

Препаративную очистку олигонуклеотидов и конъюгатов проводили при толщине геля 1−1.5 мм. По окончании разделения для визуализации гель помещали под ультрахемископ. В качестве фона использовали пластину с флуорофором для тонкослойной хроматографии Kieselgel 60 F254 (Merck, ФРГ). Полосы геля, содержащие олигонуклеотиды, вырезали и трижды элюировали 1 М раствором LICIO4. Фракции, полученные после элюции объединяли и очищали от солей флэш-хроматографией на сорбенте RP-18 (Waters, США). Олигонуклеотиды с сорбента элюировали 50% ацетонитрилом.

Разделение продуктов деструкции радиоактивно меченых олигонуклеотидов-мишеней проводили в 20%-ном денатурирующем полиакриламидном геле толщиной 0.4 мм. По окончании реакции нуклеотидный материал осаждали, прибавляли 50 мкл 0.1 М раствора 1-бутиламина и инкубировали при 90 °C в течение 8 мин. По окончании обработки нуклеотидный материал вновь осаждали, используя в качестве носителя полиуридиловую кислоту (1мкл раствора, содержащего 0.1 мг в 1мл). Полученный осадок растворяли в 2−5 мкл 8 М раствора мочевины, содержащего 0.02% бромфенолового синего и ксиленцанола FF, и наносили на полиакриламидный гель. По окончании разделения гели высушивали на установке FB GD 45 (Fisher Biotech, США).

Гели радиоавтографировали на пленку CP-BU NIF 100 (AGFA, Бельгия). Интенсивность сигналов на радиоавтографах оценивали с помощью программного пакета GelPro (Media Cybernetics, США) после предварительной калибровки по жидкостному сцинтилляционному счетчику Rackbeta (Wallac LKB, Finland) в воде по Черенкову. Относительная погрешность определения во всех опытах не превышала 20%. За степень расщепления принимали отношение интенсивности определяемой полосы к суммарной интенсивности всех полос в дорожке.

4.2.3. Спектрофотометрия.

Электронные спектры поглощения регистрировали при помощи спектрофотометра UV-2100 (Shimadzu, Япония) в буферном растворе 0.2 LiCl, 0.01 М трис-HCI pH 7.5 при комнатной температуре.

Концентрации олигонуклеотидов и их производных определяли спектрофотометрически в буферном растворе 0.2 LiCl, 0.01 М трис-HCI pH 7.5 при комнатной температуре с использованием УФ-детектора жидкостного хроматографа «Милихром» (Россия). Молярные коэффициенты поглощения при длине волны 260 нм (в2бо) для олигонуклеотидов были рассчитаны по методу [133].

Молярные коэффициенты поглощения для блеомициновых производных олигонуклеотидов полагали равными сумме в2бо соответствующего олигонуклеотида и остатка антибиотика. Коэффициент экстинкции медьсодержащего остатка антибиотика считали равным 16 000 М^см'1 [39].

Эксперименты по термической денатурации были выполнены Д. В. Пышным (ИХБФМ СО РАН). Термическую денатурацию ДНК-дуплексов исследовали в растворе, содержащем 0.1 М ЫаС1, 0.01 М какодилат натрия рН 7.4, при концентрации каждого олигонуклеотидного компонента 1.3'10″ 5 М. Термическую денатурацию гибридных дуплексов исследовали в растворе, содержащем 0.05 М КС1, 0.01 М какодилат натрия рН 7.4, 0.01 М М§ СЬ, при концентрации каждого олигонуклеотидного компонента 1.3−10″ 5 М. Перед плавлением буферные растворы, содержащие комплементарные олигонуклеотиды в эквимолярных количествах, нагревали до 80−90 °С и медленно охлаждали до 4−5 °С. Кривые оптического плавления регистрировались на установке с терморегулируемой оптической кюветой на базе УФ-детектора жидкостного хроматографа «Милихром» (Россия) с одновременной детекцией на длинах волн 260, 270, 280, 300, и 320 нм. Скорость нагрева образцов не превышала 0.7−1 °С/мин. Кривые нагревания всех исследованных образцов совпадали с кривыми охлаждения.

4.3. Методики эксперимента.

Получение медьсодержащего комплекса блеомицина А5 (Си (П)В1ш).

15.5 мг (10 мкмоль) гидрохлорида блеомицина А5 растворяли в 1 мл бидистиллированной воды и добавляли 150 мкл 0.1 М раствора Си504 (15 мкмоль). Образование медьсодержащего комплекса блеомицина А5 сопровождается появлением интенсивной синей окраски раствора. Полученный комплекс выделяли обращено-фазовой ВЭЖХ, концентрировали и осаждали 10-кратным объемным избытком ацетона. Выход 14.5 мг (90%).

Получение цетилтриметиламмонийных солей олигонуклеотидов.

0.1 мкмоль олигонуклеотида растворяли в 40 мкл бидистиллированной воды и добавляли по 2 мкл 8% раствора цетилтриметиламмоний бромида до прекращения выпадения осадка (-10 мкл раствора). Осадок отделяли центрифугированием, супернатант отбирали, осадок промывали диэтиловым эфиром и сушили в вакуум-эксикаторе при остаточном давлении 5 мм. рт. ст. в течение 1 ч.

Синтез коньюгатов блеомицина с олигонуклеотидами (в т. ч. эстронсодержащих и линкерсодержащих).

0.1 мкмоль цетилтриметиламмонийной соли олигонуклеотида растворяли в 40 мкл абсолютного ДМСО, добавляли 3,5 мг (13.5 мкмоль) трифенилфосфина, 3 мг (13.5 мкмоль) дипиридилдисульфида и 5 мкл 0.1 М раствора DMAPO в абсолютном ДМСО. После 20 мин инкубации промежуточное цвиттер-ионное производное олигонуклеотида отделяли от остальной реакционной смеси осаждением. К высушенному осадку добавляли 1.5 мг (1 мкмоль) медьсодержащего комплекса блеомицина As в 40 мкл 0.2 М раствора NaHC03 рН 8.5. Реакционную смесь инкубировали в течение 6 часов. Продукт выделяли ионообменной и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Выход 55−70%.

Полученные стандартные конъюгаты (в т.ч. эстронсодержащие) идентифицировали по хроматографической и электрофоретической подвижности, а также по соотношению интенсивностей полос с >.Мах=260 и 310 нм в УФ-спектрах конъюгатов.

Линкерсодержащие конъюгаты идентифицировали методом MALDI масс-спектрометрии. Экспериментально полученные значения массы практически совпадают с расчетными: для Ni6(pL)2pBlm — 6982.6/6985.8, для Ni6(pL)3pBlm — 7330.7/7330.1 и для N, 6(pL)4pBlin — 7688.0/7674.4.

Введение

радиоактивной метки в РНКи ДНК-мишени проводили с использованием полинуклеотидкиназы фага Т4 (5 ед.акт.), 0.1 mCi [у-32Р] АТР в буферном растворе, содержащем 50 мМ трис-HCl (рН 7.6), ЮмМ MgCb, 0.1 мМ спермидин, 0.1 мМ EDTA, 5 мМ дитиотреит (общий объем 15 мкл). Меченую РНК-мишень выделяли при помощи электрофореза в 20%-ном ПААГ, элюировали из геля буферным раствором, содержащим 0.25 М CH3COONH4, 0.5 мМ EDTA, 0.1% додецилсульфата натрия. Окончательно продукт выделяли при помощи флэш-хроматографии на сорбенте Preparative С18 125А (55−105 мкм) (Waters, США).

Расщепление одноцепочечных ДНКи РНК-мишеней коньюгатами блеомицина с протяженными олигонуклеотидами.

Реакционные смеси объемом 10 мкл содержали 5'-32Р-меченую мишень и конъюгат блеомицина с олигонуклеотидом (концентрации мишени и конъюгата указаны в каждом конкретном случае), 0.2 М LiCI, 0.01 М трис-HCl рН 7.5. Реакцию инициировали одновременным добавлением 1 мкл 0.5 М 2-меркаптоэтанола и 1 мкл раствора М0″ 3 М Fe (NH4)2(S04)2, приготовленного в насыщенной аргоном бидистиллированной воде.

Реакционные смеси инкубировали при температуре 20 °C в течение 4 ч (при эквивалентном соотношении концентраций конъюгата и мишени и при избытке конъюгата) либо в течение 16 ч (при избытке мишени по отношению к конъюгату).

Расщепление одноцепочечных ДНК-мишеней конъюгатами блеомицина с короткими олигонуклеотидами в присутствии эффекторов.

Реакционные смеси объемом 10 мкл содержали 5'-32Р-меченую мишень, конъюгат блеомицина с олигонуклеотидом, а также олигонуклеотиды — эффекторы (концентрации мишени, конъюгата и эффекторов указаны в каждом конкретном случае). Реакцию проводили в буферном растворе 0.2 М LiCl, 0.01 М трис-HCI pH 7.5. Реакцию инициировали одновременным добавлением раствора 2-меркаптоэтанола до концентрации 0.05 М и раствора Fe (NH4)2(SC>4)2 до концентрации МО" 4 М, приготовленного в насыщенной аргоном бидистиллированной воде. Реакционные смеси инкубировали при температуре 20 — 45 °C в течение 2−18 ч. в зависимости от температуры проведения реакции и соотношения концентраций конъюгата и мишени.

Расщепление двуцепочечной ДНК-мишени конъюгатами блеомицина с триплекс-формирукнцими олигонуклеотидами.

Триплексы преформировали при 4 °C в течение 18 часов в 30 мкл раствора 1 М LiCl, 0.1 М трис-HCI pH 7.5, 10 мМ MgCb. Концентрация каждой из цепей ДНК-мишени составляла ЗМО^М, конъюгатов 1.5'10″ 5 М. Реакцию инициировали одновременным добавлением 1 мкл 0.5 М 2-меркаптоэтанола и 1 мкл раствора Н03М Fe (NH4)2(S04)2, приготовленного в насыщенной аргоном бидистиллированной воде. Реакционные смеси инкубировали при 20 °C в течение 4 ч.

Гидролиз рибонуклеазой Н Е. coli проводили в растворе, содержащем 20 мМ HEPES (pH 8.0), 50 мМ KCl, ЮмМ MgCl2 и 1 мМ дитиотреит. Концентрация РНК-мишени во всех экспериментах составляла 1−10'7М, олигодезоксирибонуклеотидов -2'10″ бМ. Реакционные смеси (10 мкл) инкубировали при 20 °C в течение 15 мин, затем добавляли 0.15 ед.акт. рибонуклеазы Н. Через необходимое время добавляли 1 мкл раствора полиуридиловой кислоты (0.1 мг/мл) и осаждали олигонуклеотиды 2% раствором перхлората лития в ацетоне.

Начальную скорость гидролиза Vo определяли по начальным участкам кинетических кривых (0−5 мин).

Показать весь текст

Список литературы

  1. Umezawa Н., Maeda К., Takeuchi Т., Okami Y. New antibiotics, bleomycin A and В.// J. Antibiot. (Tokyo). 1966. V. 19, № 5, P. 200−209.
  2. Lazo J.S., Chabner B.A. Bleomycin.// Cancer Chemotherapy and Biotherapy: Principles and Practice./ Eds. B.A. Chabner and D.L. Longo Philadelphia, PA: Lippincott-Raven, 1996. P. 379.
  3. Bennett J.M., Reich S.D. Bleomycin.// Ann. Intern. Med. 1979. V. 90, № 6, P. 945−948.
  4. Carlson R.W., Sikic B.I., Turbow M.M., Ballon S.C. Combination cisplatin, vinblastine, and bleomycin chemotherapy (PVB) for malignant germ-cell tumors of the ovary.//J. Clin. Oncol. 1983. V. 1, № 10, P. 645−651.
  5. Nagai K., Yamaki H., Suzuki H., Tanaka N., Umezawa H. The combined effects of bleomycin and sulfhydryl compounds on the thermal denaturation of DNA.// Biochim. Biophys. Acta. 1969. V. 179, № 1, P. 165−171.
  6. Stubbe J., Kozarich J.W., Wu W., Vanderwall D.E. Bleomycins: A structural model for specificity, binding, and double strand cleavage.//Acc. С hem. Res. 1996. V. 29, № 7, P. 322−330.
  7. Petering D.H., Mao Q., Li W., DeRose E" Antholine W.E. Metallobleomycin-DNA interactions: structures and reactions related to bleomycin-induced DNA damage.//Met. Ions. Biol. Syst. 1996. V. 33, №, P. 619−648.
  8. Stubbe J., Kozarich J.W. Mechanisms of bleomycin-induced DNA degradation.// Chem. Rev. 1987. V. 87, № 5, P. 1107−1136.
  9. D’Andrea A.D., Haseltine W.A. Sequence specific cleavage of DNA by the antitumor antibiotics neocarzinostatin and bleomycin.// Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1978. V. 75, № 8, P. 3608−3612.
  10. Takeshita M., Grollman A.P., Ohtsubo E., Ohtsubo H. Interaction of bleomycin with DNA.// Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V. 75, № 12, P. 5983−5987.
  11. Mirabelli C.K., Huang C.H., Crooke S.T. Role of deoxyribonucleic acid topology in altering the site/sequence specificity of cleavage of deoxyribonucleic acid by bleomycin and talisomycin.// Biochemistry. 1983. V. 22, № 2, P. 300−306.
  12. Barranco S.C., Humphrey R.M. The effects of bleomycin on survival and cell progression in Chinese hamster cells in vitro.// Cancer Res. 1971. V. 31, № 9, P. 1218−1223.
  13. Hittelman W.N., Rao P.N. Bleomycin-induced damage in prematurely condensed chromosomes and its relationship to cell cycle progression in CHO cells.// Cancer Res. 1974. V. 34, № 12, P. 3433−3439.
  14. Barlogie B., Drewinko B., Schumann J., Freireich E.J. Pulse cytophotometric analysis of cell cycle perturbation with bleomycin in vitro.// Cancer Res. 1976. V. 36, № 3, P. 1182−1187.
  15. Berry D.E., Chang L.H., Hecht S.M. DNA damage and growth inhibition in cultured human cells by bleomycin congeners.// Biochemistry. 1985. V. 24, № 13, P. 3207−3214.
  16. Suzuki H., Nagai K., Yamaki H., Tanaka N., Umezawa H. Mechanism of action of bleomycin. Studies with the growing culture of bacterial and tumor cells.// J. Antibiot. (Tokyo). 1968. V. 21, № 6, P. 379−386.
  17. Muller W.E., Yamazaki Z., Breter H.J., Zahn R.K. Action of bleomycin on DNA and RNA.// Eur. J. Biochem. 1972. V. 31, № 3, P. 518−525.
  18. Haidle C.W., Bearden J., Jr. Effect of bleomycin on an RNA-DNA hybrid.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. V. 65, № 3, P. 815−821.
  19. Krishnamoorthy C.R., Vanderwall D.E., J.W. K. Degradation of DNA-RNA hybrids by bleomycin: Evidence for DNA strand specificity and for possible structural modulation of chemical mechanism.//J. Am. Chem. Soc. 1988. V. 110, № 6, P. 2008−2009.
  20. Murray V., Martin R.F. The sequence specificity of bleomycin-induced DNA damage in intact cells.//J. Biol. Chem. 1985. V. 260, № 19, P. 10 389−10 391.
  21. Moore C.W. Bleomycin-induced mutation and recombination in Saccharomyces cerevisiae.//Mutat. Res. 1978. V. 58, № 1, P. 41−49.
  22. Umezawa K., Haresaku M., Muramatsu M., Matsushima T. Mutagenicity of anthracycline glycosides and bleomycins in Salmonella assay system.// Biomed. Pharmacoter. 1987. V. 41, № 5, P. 214−218.
  23. Povirk L.F., Goldberg I.H. A role of oxidative DNA sugar damage in mutagenesis by neocarzinostatin and bleomycin.// Biochimie. 1987. V. 69, № 8, P. 815−823.
  24. Povirk L.F. DNA damage and mutagenesis by radiomimetic DNA-cleaving
  25. V agents: bleomycin, neocarzinostatin and other enediynes.// Mutat. Res. 1996. V.355, № 1−2, P. 71−89.
  26. Onishi T., Shimada K., Takagi Y. Effects of bleomycin on Escherichia coli strains with various sensitivities to radiations.// Biochim. Biophys. Acta. 1973. V. 312, № 2, P. 248−258.
  27. Levin J.D., Demple B. In vitro detection of endonuclease IV-specific DNAdamage formed by bleomycin in vivo.// Nucleic Acids Res. 1996. V. 24, № 5, P.885.889.
  28. Kikuchi H., Tetsuka T. On the mechanism of lipoxygenase-like action of bleomycin-iron complexes.//J. Antibiot. (Tokyo). 1992. V. 45, № 4, P. 548−555.
  29. Lim S.T., Jue CX, Moore C.W., Lipke P.N. Oxidative cell wall damage mediated by bleomycin-Fe (ll) in Saccharomyces cerevisiae.//J. Bacteriol. 1995. V. 177, № 12, P. 3534−3539.
  30. Magliozzo R.S., Peisach J., Ciriolo M.R. Transfer RNA is cleaved by activated bleomycin.//Mol. Pharmacol. 1989. V. 35, № 4, P. 428−432.
  31. Carter B.J., Reddy K.S., Hecht S.M. Polynucleotide recognition and strand scission by Fe-bleomycin.// Tetrahedron. 1991. V. 47, № 14−15, P. 2463−2474.
  32. Holmes C.E., Hecht S.M. Fe. bleomycin cleaves a transfer RNA precursor and its «transfer DNA» analog at the same major site.// J. Biol. Chem. 1993. V. 268, № 34, P. 25 909−25 913.
  33. Holmes C.E., Carter B.J., Hecht S.M. Characterization of iron (ll)bleomycin-mediated RNA strand scission.// Biochemistry. 1993. V. 32, № 16, P. 4293−4307.
  34. Abraham A.T., Lin J.J., Newton D.L., Rybak S" Hecht S.M. RNA cleavage and inhibition of protein synthesis by bleomycin.// Chem. Biol. 2003. V. 10, № 1, P. 45−52.
  35. Padbury G., Sligar S.S. Chemical reactivities of bleomycin.// J. Biol. Chem. 1985. V. 260, № 13, P. 7820−7823.
  36. Murugesan N., Hecht S.M. Bleomycin as an oxene transferase. Catalytic oxygen transfer to olefins.// J. Am. Chem. Soc. 1985. V. 107, № 2, P. 493−500.
  37. Takita T., Muraoka Y., Nakatani T., Fujii A., Umezawa Y., Naganawa H. Chemistry of bleomycin. XIX Revised structures of bleomycin and phleomycin.// J. Antibiot. (Tokyo). 1978. V. 31, № 8, P. 801−804.
  38. Umezawa H. Structure and action of bleomycin.// Prog. Biochem. Pharmacol. 1976. V. 11, №, P. 18−27.
  39. Sugiura Y., Ishizu K., Miyoshi K. Studies of metallobleomycins by electronic spectroscopy, electron spin resonance spectroscopy, and potentiometric titration.// J. Antibiot. (Tokyo). 1979. V. 32, № 5, P. 453−461.
  40. Petering D.H., Byrnes R.W., Antholine W.E. The role of redox-active metals in the mechanism of action of bleomycin.// Chem. Biol. Interact. 1990. V. 73, № 2−3, P. 133−182.
  41. Claussen C.A., Long E.C. Nucleic Acid recognition by metal complexes of bleomycin.//Chem. Rev. 1999. V. 99, № 9, P. 2797−2816.
  42. Dabrowiak J.C., Greenaway F.T., Longo W.E., Van Husen M., Crooke S.T. A spectroscopic investigation of the metal binding site of bleomycin A2. The Cu (ll) and Zn (ll) derivatives.// Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 517, № 2, P. 517−526.
  43. Rishel M.J., Thomas C.J., Tao Z.F., Vialas C., Leitheiser C.J., Hecht S.M. Conformationally constrained analogues of bleomycin A5.// J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125, № 34, P. 10 194−10 205.
  44. Sausville E.A., Peisach J., Horwitz S.B. A role for ferrous ion and oxygen in the degradation of DNA by bleomycin.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1976. V. 73, № 3, P. 814−822.
  45. Sausville E.A., Stein R.W., Peisach J., Horwitz S.B. Properties and products of the degradation of DNA by bleomycin and iron (ll).// Biochemistry. 1978. V. 17, № 14, P. 2746−2754.
  46. Ishida R., Takahashi T. Increased DNA chain breakage by combined action of bleomycin and superoxide radical.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. V. 66, № 4, P. 1432−1438.
  47. Lown J.W., Sim S.K. The mechanism of the bleomycin-induced cleavage of DNA.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1977. V. 77, № 4, P. 1150−1157.
  48. Burger R.M., Horwitz S.B., Peisach J., Wittenberg J.B. Oxygenated iron bleomycin. A short-lived intermediate in the reaction of ferrous bleomycin with O2.// J. Biol. Chem. 1979. V. 254, № 24, P. 12 999−12 302.
  49. Kuramochi H., Takahashi K., Takita T., Umezawa H. An active intermediate formed in the reaction of bleomycin-Fe (ll) complex with oxygen.// J. Antibiot. (Tokyo). 1981. V. 34, № 5, P. 576−582.
  50. Burger R.M., Peisach J., Horwitz S.B. Activated bleomycin. A transient complex of drug, iron, and oxygen that degrades DNA.//J. Biol. Chem. 1981. V. 256,22, P. 11 636−11 644.
  51. Albertini J.P., Garnier-Suillerot A., Tosi L. Iron. bleomycin. DNA system evidence of a long-lived bleomycin. iron. oxygen intermediate.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. V. 104, № 2, P. 557−563.
  52. Burger R.M., Peisach J., Blumberg W.E., Horwitz S.B. Iron-bleomycin interactions with oxygen and oxygen analogues. Effects on spectra and drug activity.//J. Biol. Chem. 1979. V. 254, № 21, P. 10 906−10 912.
  53. Burger R.M. Cleavage of Nucleic Acids by Bleomycin.// Chem. Rev. 1998. V. 98, № 3, P. 1153−1170.
  54. Sugiura Y., Suzuki T., Kuwahara J., Tanaka H. On the mechanism of hydrogen peroxide-, superoxide-, and ultraviolet light-induced DNA cleavages of inactive bleomycin-iron (III) complex.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982. V. 105, № 4, P. 1511−1518.
  55. Burger R.M., Peisach J., Horwitz S.B. Activated bleomycin. A transient complex of drug, iron, and oxygen that degrades DNA.//J. Biol. Chem. 1981. V. 256,22, P. 11 636−11 644.
  56. Bukowski M.R., Zhu S., Koehntop K.D., Brennessel W.W., Que L., Jr. Characterization of an Fe lll-OOH species and its decomposition product in a bleomycin model system.//J. Biol. Inorg. Chem. 2004. V. 9, № 1, P. 39−48.
  57. Povirk L.F., Hogan M., Dattagupta N. Binding of bleomycin to DNA: intercalation of the bithiazole rings.// Biochemistry. 1979. V. 18, № 1, P. 96−101.
  58. Povirk L.F., Hogan M., Dattagupta N., Buechner M. Copper (ll).bleomycin, iron (lll).bleomycin, and copper (ll).phleomycin: comparative study of deoxyribonucleic acid binding.// Biochemistry. 1981. V. 20, № 3, P. 665−671.
  59. Roy S.N., Orr G.A., Brewer C.F., Horwitz S.B. Chemical synthesis of radiolabeled Щ bleomycin A2 and its binding to DNA.//Cancer Res. 1981. V. 41, № 11, P. 44 714 477.
  60. Albertini J.P., Garnier-Suillerot A. Cobalt-bleomycin-deoxyribonucleic acid system. Evidence of deoxyribonucleic acid bound superoxo and mu-peroxo cobalt-bleomycin complexes.// Biochemistry. 1982. V. 21, № 26, P. 6777−6782.
  61. Albertini J.P., Garnier-Suillerot A. Iron-bleomycin-deoxyribonucleic acid system. Evidence of deoxyribonucleic acid interaction with the alpha-amino group of the beta-aminoalanine moiety.// Biochemistry. 1984. V. 23, № 1, P. 47−53.
  62. Suzuki H., Nagai K., Akutsu E., Yamaki H., Tanaka N. On the mechanism of action of bleomycin. Strand scission of DNA caused by bleomycin and its bindingto DNA in vitro.// J. Antibiot. (Tokyo). 1970. V. 23, № 10, P. 473−480.
  63. Chien M., Grollman A.P., Horwitz S.B. Bleomycin-DNA interactions: fluorescence and proton magnetic resonance studies.// Biochemistry. 1977. V. 16, № 16, P. 2641−2647.
  64. Д.С., Зарытова В. Ф. Взаимодействие блеомицина и его олигонуклеотидных производных с нуклеиновыми кислотами.// Успехи химии. 1996. V. 65, № 4, Р. 377−402.
  65. Kemsley J.N., Zaleski K.L., Chow M.S., Decker A., Shishova E.Y., Wasinger E.C., Hedman В., Hodgson K.O., Solomon E.I. Spectroscopic studies of the interaction of ferrous bleomycin with DNA.//J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125, № 36, P. 10 810−10 821.
  66. Li W., Antholine W.E., Petering D.H. Kinetics of reaction of DNA-bound Fe (lll)bleomycin with ascorbate: interplay of specific and non-specific binding.// J. Inorg. Biochem. 2002. V. 90, № 1−2, P. 8−17.
  67. Nakamura M., Peisach J. Self-inactivation of Fe (ll)-bleomycin.// J. Antibiot. (Tokyo). 1988. V. 41, № 5, P. 638−647.
  68. Morgan M. A, Hecht S.M. Iron (ll) bleomycin-mediated degradation of a DNA-RNA heteroduplex.// Biochemistry. 1994. V. 33, № 34, P. 10 286−10 293.V
Заполнить форму текущей работой

На отлично!