Окислительное расщепление ДНК аренами и их олигонуклеотидными конъюгатами в присутствии ионов Cu (II)

Создание химических соединений, способных расщеплять ДНК по определенным нуклеотидным последовательностям, необходимо для развития ряда областей молекулярной биологии и для разработки терапевтических препаратов регулирующих экспрессию генов [1, 2]. Такие соединения могут быть получены путем присоединения реакционноспособных групп к олигонуклеотидам, взаимодействующим с определенными нуклеотидными последовательностям ДНК [3, 4]. Важным, не решенным вопросом конструирования таких соединений, является разработка реакционноспособных групп, которые могли бы высокоэффективно расщеплять или химически модифицировать ДНК в физиологических условиях. На сегодняшний день создан широкий спектр производных олигонуклеотидов, несущих алкилирующие, фотоактивируемые группы, комплексы переходных металлов, катализирующие окислительную деструкцию нуклеиновых кислот (EDTA-железо, порфирин-железо, 1,10-фенантролин-медь блеомицин-железо) [5−12]. Реагенты последнего типа способны расщеплять или модифицировать ДНК и РНК в аэробных условиях в присутствии восстановителей или доноров активного кислорода. Однако направленная модификация ДНК ни одним из описанных реагентов не достигает в физиологических условиях биологически значимых уровней.

В настоящее время не вполне выясненным является вопрос о формировании комплексов олигонуклеотидов с клеточной ДНК. ДНК клетки упакована в регулярно повторяющиеся нуклеопротеиновые структуры — нуклеосомы, и расплетение её- цепей является редким событием [13,14]. Уотсон-Криковское связывание олигонуклеотидов может происходить только по расплетенным одноцепочечным участкам ДНК, появляющимся в составе активного хроматина [15]. С нерасплетенной двуцепочечной ДНК олигонуклеотиды могут образовывать комплексы путем формирования трехтяжевых структур, в районах с гомопуриновыми-гомопиримидиновыми последовательностями. Большая бороздка ДНК, упакованной в нуклеосому, периодически обращена к поверхности гистонового октамера [16], и в этом случае экранирована коровыми гистонами, что должно препятствовать образованию комплекса с олигонуклеотидом. Поэтому, исследование влияния упаковки ДНК в нуклеосому на ззаимодействие с олигонуклеотидами является актуальной задачей. Локализация гистоновых октамеров на ДНК и экранированность белками последовательностей-мишеней ДНК могут быть определены методами футпринтинга: с помощью ферментов, ДНКазы I, микрококковой нуклеазы и химических реагентов [17, 18] В качестве реагентов для такого футпринтинга могут быть использованы и металлокомплексы [19,20].

В настоящей работе исследовали возможность создания на основе галоген-замещенных производных бензойной кислоты реакционноспособных производных олигонуклеотидов как для направленного расщепления ДНК так и для изучения структуры ДНК-белковых комплексов. В отличие от органических растворителей, в водных растворах медные комплексы бензойных кислот обладают пониженной стабильностью, что позволит добиться снижения степени неселективной деградации ДНК [21,22].

Цель и задачи исследования

.

Целью работы являлось создание новых реагентов для расщепления ДНК на основе замещенных производных бензойной кислоты и исследование закономерностей их действия в присутствии ионов меди (II). В ходе исследования решались следующие задачи:

1. Расщепление ДНК аренами в присутствии ионов Cu (II) и установление закономерностей этой реакции.

2. Исследование свойств реакционноспособного производного олигонуклеотида на основе о-бромбензойной кислоты как реагента для сайт-направленного расщепления ДНК в двуспиральном и трехспиральном комплексе. Сравнительное исследование расщепления ДНК под действием этого производного олигонуклеотида и производных олигонуклеотидов, несущих в качестве реакционноспособных групп фталоцианин кобальта (II) и блеомицин А5.

Возможность применения системы Си (П)/о-бромбензойная кислота для определения положения нуклеосомного кора на ДНК в составе реконструированной нуклеосомы и исследование доступности ДНК в составе реконструированной нуклеосомной цепи для модификации производными олигонуклеотидов.

выводы.

1. Исследовано Си (П)-зависимое расщепление ДНК аренами различной структуры.

• показано, что арены, в структуре которых имеется бензольное кольцо с присоединенной к нему карбоксильной группой, статистически расщепляют ДНК в присутствии ионов Си (П) без добавления восстановителей или перекиси водорода за счет присутствующего в растворе молекулярного кислорода, вызывая как прямые разрывы ДНК, так и образование пиперидин-лабильных модифицированных оснований.

• обнаружено, что арены вызывают окислительную деструкцию ДНК через Си (11)/Си (1)-индуцированное образование кислородных радикалов, зарегистрированных методом ЭПР с использованием спиновых ловушек и ингибиторов кислородных радикалов.

• показано, что хотя для генерации короткоживущих кислородных радикалов достаточно образования комплекса Си (11)*о-бромбензойная кислота в растворе, для эффективного расщепления ДНК необходимо образование комплекса ДНКСи (П)-о-бромбензойная кислота.

• показана возможность применения системы Си (П)-о-бромбензойная кислота в качестве реагента для футпринтинга ДНК-белковых контактов в составе реконструированного хроматина для определения местоположения последовательности-мишени на нуклеосоме.

2. Изучено расщепление одноцепочечной и двуцепочечной ДНК конъюгатом олигонуклеотида с 5-(4/-амино-пропил-сульфамоил)-2-бромбензойной кислотой.

• показано, что в присутствии свободной о-бромбензойной кислоты этот конъюгат способен вызывать сайт-направленное расщепление ДНК при образовании комплементарных комплексов с одноцепочечной ДНК и двуцепочечной ДНК.

• сравнение расщепления ДНК в дуплексе и триплексе олигонуклеотидными конъюгатами, содержащими в качестве реакционноспособной группы о-бромбензойную кислоту, фталоцианин кобальта (П), и блеомицин As показало, что расщепление под действием конъюгата олигонуклеотида с 5-(4/-амино-пропилсульфамоил)-2-бромбензойной кислотой происходит с меньшей эффективностью, однако более специфичноприводит к образованию прямых разрывов и не требует присутствия в реакционной смеси восстановителя или перекиси водорода. 3. Исследована сайт-направленная модификация двуцепочечной ДНК в составе реконструированной нуклеосомы.

• футпринтинг ДНК с помощью системы Си (П)/о-бромбензойная кислота и микрококковой нуклеазы показывает, что при реконструкции нуклеосом на фрагменте промотора протоонкогена c-fos длиной 352 п.о. (-348/+3) последовательность (-97/-84), выбранная для образования трехцепочечного комплекса с производным олигонуклеотида, расположена в области нуклеосомного кора.

• впервые проведена сайт-направленная модификация двуцепочечной ДНК в составе реконструированной нуклеосомной цепи алкилирующим производным гомопиримидинового олигонуклеотида. Показано, что наличие гистонового октамера не препятствует образованию триплекса олигонуклеотид-двуцепочечная ДНК и эффективному направленному алкилированию ДНК в составе такого комплекса (степень модификации до 48%).