Разработка идентификации Bordetella bronchiseptica на основе иммунохимических и молекулярно-генетических методов

Актуальность темы

.

В настоящее время бордетеллез широко распространенное заболевание животных во многих странах мира. Проблему заболеваний, вызванных Bordetella bronchiseptica, стали рассматривать уже в начале XX века в странах Европы и США [29, 32, 87]. Однако в Российской Федерации до настоящего времени исследования в этой области не проводились.

Bordetella bronchiseptica является возбудителем хронических и, довольно часто, асимптоматических инфекций респираторного тракта (трахе-обронхита) животных. Возбудитель поражает животных всех возрастных групп, но наиболее тяжелые последствия развиваются у молодых особей. Тяжесть заболевания связана с присутствием у В. bronchiseptica факторов патогенности: адгезинов (филаментозного гемагглютинина, пертактина и фимбрий) и токсинов (дермонекротического, аденилатциклазы-гемолизина и липополисахарида) [89, 207].

Инфекционный агент долго сохраняется в окружающей среде, поэтому чаще всего его обнаруживают в местах скученности животных (питомники, фермы, частные хозяйства) [32]. Возможность трансмиссии возбудителя из природных эпизоотических очагов к животным, содержащимся в фермерских хозяйствах, и, как следствие, значительных экономических потерь в малом и среднем сельскохозяйственном бизнесе вследствие гибели или снижения продуктивности животных, обусловливают необходимость выявления В. bronchiseptica и проведение противоэпидемических мероприятий. В связи с этим актуальным является разработка методов индикации и идентификации В. bronchiseptica.

Цель работы.

Разработка методических подходов индикации и идентификации Bordetella bronchiseptica, основанных на иммунохимических и молекулярно-генетических методах.

Задачи работы:

1. Провести сравнительный анализ иммунохимических методов изучения антигенного состава В. bronchiseptica с целью идентификации.

2. Адаптировать метод полимеразной цепной реакции для молекулярно-генетической идентификации В. bronchiseptica.

3. Подобрать праймеры для выявлнения специфических участков ДНК В. bronchiseptica, а также идентификации участка генома представителей рода Bordetella.

4. Определить специфичность полимеразной цепной реакции при индикации В. bronchiseptica.

5. Разработать схему мультиплексной ПЦР для одновременного обнаружения нескольких специфичных участков ДНК В. bronchiseptica.

6. Определить чувствительность ПЦР при-выявлении возбудителя бордетел-леза.

7. Разработать схему проведения ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» для количественной оценки содержания ДНК В. bronchiseptica.

Научная новизна.

Впервые в Российской Федерации проведены nccneflOBamiJi, связанные с возбудителем бордетеллезной инфекции у кошек и собак. Проведен сравнительный анализ антигенного состава В. bronchiseptica с гипериммунными сыворотками в реакциях радиальной иммунодиффузии по О. Ouchterlony (1948), встречного электрофореза по методу G. Bedarida et al. (1969) и имму-ноэлектрофореза по методу Р. Grabar и С. Williams, описанному X. Фримель (1979) с гипериммунными сыворотками. Показана высокая чувствительность метода иммуноэлектрофореза для изучения антигенной структуры В. bronchiseptica при использовании иммунной сыворотки с низким титром. На примере использования разработанных систем праймеров к участкам генов BfrA и BfrZ доказана высокая специфичность и чувствительность полимеразной цепной реакции при идентификации В. bronchiseptica. Подобраны и оптимизированы соотношения систем праймеров для одновременного выявления 3-х специфичных участков генома В. bronchiseptica в мультиплексном формате ПЦР. Предложена схема проведения ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» с интеркалирующим красителем SYBR Green I для количественной оценки содержания ДНК В. bronchiseptica. Практическая значимость работы.

Метод иммуноэлектрофореза при проведении антигенной идентификации В. bronchiseptica позволяет использовать его для контроля состава и специфичности антигенов при разработке и производстве биопрепаратов, а подобранные и оптимизированные системы праймеров — в производстве ПЦР-систем, основанных на амплификации специфических участков генома В. bronchiseptica для диагностики бордетеллеза.

Разработаны «Методические рекомендации по выявлению Bordetella bronchiseptica с помощью полимеразной цепной реакции», утвержденные ректором УГСХА от 10 ноября 2010 г. и подтвержденные актом комиссионных испытаний, проведенных на базе ООО «Медицинский Центр «Академия» (г. Ульяновск). Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии и биотехнологии, а также при проведении практических занятий для студентов и аспирантов в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Иммуноэлектрофорез по методу Р. Grabar и С. Williams, описанному X. Фримель (1979) позволяет идентифицировать 8 антигенов В. bronchiseptica, причем 5 из них являются видоспецифичными.

2. При использовании праймеров к участкам генов BfrA и BfrZ может быть проведена прямая идентификация В. bronchiseptica в биологическом материале.

3. Чувствительность метода ПЦР с праймерными системами к участкам генов BfrA, BfrZ и Cytochrom-C-oxidase генома В. bronchiseptica составляет 5,5×103, а участка гена 16S rRNA — 5,5×102 бактериальных клеток/мл.

4. Мультиплексный формат ПЦР с системами праймеров к участкам BfrA, BfrZ и Cytochrom-C-oxidase дает возможность одновременно идентифицировать 3 гена: BfrA и BfrZ — специфичных для В. bron-chiseptica, а также Cytochrom-C-oxidase — специфичного для В. bron-chiseptica, В. pertussis и В. parapertussis.

5. Применение метода ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» с интеркалирующим красителем SYBR Green I позволяет проводить количественную оценку содержания ДНК В. bronchiseptica в биологическом материале.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы и ъ Научно-исследовательском центре микробиологии и биотехнологии ФГОУ высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия». Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на: Всероссийских научно-практических конференциях Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008; 2009), Конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (Покров, 2009), VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010» (Москва, 2010). Публикации.

По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

.

Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы и собственных исследований, включающей объект, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 144 страницах, содержит 15 таблиц и 28 рисунков. Список использован.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В 1910 году В. bronchiseptica была признана патогенном, вызывающим заболевания респираторного тракта [207]. В последствии стали появляться публикации, касающиеся исследований токсинов, антигенной структуры и серологических характеристик В. bronchiseptica, а также публикации, касающиеся сравнительной характеристики В. bronchiseptica, В. pertussis и В. parapertussis [67].

Фактически все теплокровные животные восприимчивы к инфицированию В. bronchiseptica. Есть сообщения об инфицировании большого количества домашних и диких животных, а также людей [87, 89, 207].

В зарубежной научной литературе появляется все больше сообщений о распространении бордетеллезной инфекции среди животных в Западной Европе, Нидерландах, Великобритании, США. Ученые этих стран внимательно следят за распространением инфекции, разрабатывают диагностикумы, методы лечения и специфической профилактики [89, 95, 130].

Следует отметить, что возбудитель бордетеллеза в нашей стране недостаточно изучен. Поэтому особого внимания заслуживает вопрос определения эффективных иммунохимических методов анализа антигенной структуры В. bronchiseptica, а также разработки своевременных, быстрых и точных методов выделения и идентификации инфекционного агента.

Большинство исследователей описывают эксперименты, касающиеся антигенных различий трех представителей рода Bordetella: В. pertussis, В. parapertussis и В. bronchiseptica. Е.К. Andersen [25] и, позднее, G. Eldering et al. [65] описали конкретные видои родоспецифичные термолабильные и термостабильные антигены, выявляемые в реакциях агглютинации.

В исследованиях H. Billaudelle et al. [189], связанных с изолированием гистамин-чувствительного фактора (HSF) возбудителя бордетеллеза и определением его иммуногенности, было показано, что при проведении радиальной иммунодиффузии по О. Ouchterlony выделенной фракции разрушенных с помощью ультразвука бактериальных клеток, было идентифицировано до 12 антигенных комплексов.

В реакциях агглютинации и преципитации были исследованы термолабильные токсины [72], капсульные агглютиногены [82], эндотоксины [194], гемагглютинин [81], гистамин-чувствительный фактор [154] и авторами были идентифицированы, по меньшей мере, 14 различных антигенов представителей рода Bordetella [67].

В исследованиях J. Munoz at al. [144, 145], показано, что в реакции двойной радиальной иммунодиффузии по Ouchterlony сыворотка, полученная при гипериммунизации цельными клетками бордетелл, образовывала четкие зоны преципитации с компонетами клеток, разрушенных с помощью химического лизиса. При этом наблюдалось образование до 3 линий преципитации.

В работах S.C. Redd et al. [101] описана технология проведения имму-ноблотинга с антигенами бордетелл. После разделения в ПААГ лизата трех штаммов В. pertussis авторами были получены сходные электрофореграммы белковых компонентов до 30 идентичных белковых компонентов.

R. Ross et al. в 1969 году исследовал антигенный состав В. pertussis, В. bronchiseptica и В. parapertussis с помощью методов диффузной преципитации в агаровом геле и иммуноэлектрофореза в барбитуратовом буфере. При сравнении результатов полученных оказалось, что как минимум три антигена являются общими [175].

N. Holby et al. [97] продемонстрировали в своих исследованиях с помощью количественных методов иммуноэлектрофореза перекрестные реакции между антигенами В. pertussis и 28 другими видами бактерий. Только два антигена В. pertussis из 44 выделенных давали перекрестную реакцию с представителями других видов, в основном грамотрицательными бактериями. Однако оказалось, что антигены В. parapertussis и В. bronchiseptica перекрестно реагируют с антигенами В. pertussis в широком диапазоне, и только 4 антигена являются видоспецифичными для этого возбудителя.

В своих экспериментах А.Р. MacLennan обнаружил, что липополисаха-рид, являющийся протективным антигеном, в реакциях микроагглютинации и радиальной иммунодиффузии по О. Ouchterlony был идентичен таковым, выделенным из грамотрицательных бактерий кишечной группы [124].

Несогласованность данных различных авторов и отсутствие стандартных методик изучения антигенного состава В. bronchiseptica подтолкнуло нас к проведению исследований по определению наиболее эффективного имму-нохимического метода, позволяющего выявлять наибольшее количество специфичных для возбудителя антигенов.

Вследствие этого мы провели сравнительный анализ использования трех различных иммунохимических метода, отличающихся друг от друга технологическими приемами: двойной радиальной иммунодиффузии по О. Ouchterlony (1948), встречного электрофореза, по G. Bedarida et al. (1969) и иммуноэлектрофореза по методу Р. Grabar и С. Williams, описанного X. Фри-мель (1979). Так, в результате экспериментов, было доказано, что наиболее эффективным является метод иммуноэлектрофореза по Р. Grabar и С. Williams, описанный X. Фримель (1979), позволяющий выявлять 5 видоспецифических антигена В. bronchiseptica.

Главная задача молекулярно-генетических методов исследований состоит в том, чтобы по возможности точно установить причины заболевания и механизмы его развития [11]. Появление этих методов позволило, прежде всего, проводить анализ наследственной информации (ДНК или РНК) инфекционных агентов.

Молекулярно-генетические методы позволяют осуществлять раннюю и более полную диагностику различных заболеваний, своевременно проводить дифференциальную диагностику и осуществлять контроль эффективности терапии [9].

Метод ПЦР, применительно к бордетеллам был впервые описан в 1990 году в исследованиях Е.М. Glare et al. Авторами были изучены тандемные повторы хромосомной ДНК В. pertussis в качестве исходной мишени при проведении ПЦР. Такой областью оказался участок ДНК длиной 1046 п.о., присутствующий в количестве 50−100/бактериальную хромосому, а продукт разработанной системы праймеров для ПНР — 153 п.о. [22].

Относительно выбора мишеней для амплификации участка генома необходимо отметить, что различные исследователи чаще всего используют консервативные участки генов, отвественных за экспрессию факторов пато-генности бордетелл. Так N.H. Birkebaek et al. [33], Е. Grimprel et al. [49], E. Reizenstein et al. [59] использовали в качестве мишени для ПЦР В. pertussis промоторную область коклюшного токсинаZ.M. Li. et al. [100], N. Schnitzler et al. [182] были использованы участки ДНК гена поринаЕ. Douglas et al. [62] использовали консервативные области гена аденилатциклазы-гемолизина. Тест-системы, созданные на основе этих исследований оказались высокочувствительными (80−100%), хотя в некоторых случаях ДНК В. pertussis не удалось различить с ДНК В. parapertussis и В. bronchiseptica, имеющих высокую степень гомологии исходных мишеней [140].

Е. Reizensten et al. [60] по результатам своих исследований дали диагностическую оценку одновременного выявления и идентификации В. pertussis, В. parapertussis и В. bronchiseptica. В качестве мишени ими был выбран консервативный регион промоторной области коклюшного токсина размером 239 п.о. Эта последовательность, по данным авторов, имеет мутации в геномах В. parapertussis и В. bronchiseptica, и видовая дифференцировка основана на последующем рестрикционном анализе полученных ампликонов. Порог чувствительности этой методики составил 0,1 пг ДНК (около 30 бактерий/реакцию).

Рядом ученых был применен несколько другой подход к видовой диф-ференцировке трех представителей рода Bordetella. В их исследованиях использованы две системы праймеров BSPP и ВВ, мишенью одной из которых служила последовательность гена флагеллина, отличающегося по нуклео-тидному составу у этих возбудителей, а другая система содержала праймеры к консервативному участку генома В. bronchiseptica. В результате амплифи-цированный продукт размером 237 п.о. был обнаружен только в пробах с ДНК В. bronchiseptica, а в пробах с экстрагированной ДНК В. pertussis обнаруживался продукт амплификации размером 195 п.о. Амплификат размером 164 п.о. был одновременно обнаружен в пробах, содержащих ДНК возбудителя паракоклюша и пробах с экстрагированной ДНК возбудителя бронхи-септикоза [96].

В 2004 году S.K. Poddar использовал интеркалирующий краситель SYBR Green I для детекции ДНК возбудителя бордетеллеза при проведении полимеразной цепной реакции с регистрацией в режиме «реального времени» на LightCycler. В его исследованиях был реализован уникальный подход детекции — сравнение флуоресценции по кривой плавления образованных в ходе реакции ампликонов. Экспериментатор указывал на высокую стабильность этого параметра во всех положительных пробах: Тш = 86 ± 0,5 °С. Параллельно автором была проведена подтверждающая детекция с помощью электрофореза в агарозном геле с применением бромистого этидия в качестве интеркалирующего красителя. В результате было обнаружено, что предел детекции в агарозном геле в 10 раз уступал методу кривых плавления в присутствии SYBR Green I [160].

Идея проведения мультиплексной ПЦР «в одной пробирке» была описана в работах Y. Xu, Q. Нои в 2010 году. Авторы применили технологию, основанную на одновременной идентификации двух регионов генома В. pertussis и В. parapertussis. В качестве мишеней были использованы промотер коклюшного токсина и вставочный элемент IS481 генома В. pertussis, а таюке вставочный элемент IS 1001 ДНК В. parapertussis. Данным методом были исследованы клинические образцы биоматериала и определена чувствительность реакции — 5 КОЕ/реакцию для возбудителя коклюша и 1 КОЕ/реакцию для паракоклюша. Коэффициент вариации результатов составил 7%, время исполнения исследования около 4 часов при одновремнном выявлении этих инфекционных агентов [198].

Голландскими учеными были усовершенствованы системы праймеров для обнаружения ДНК представителей рода Bordetella на основе вставочных элементов (IS). В ходе исследований различных штаммов представителей 4 видов бордетелл (В. pertussis, В. parapertussi, В. holmesii и В. bronchiseptica) было обнаружено, что IS481, общепринятые для обнаружения возбудителя i коклюша, также встречаются в составе геномной ДНК В. holmesii и В. bronchiseptica', IS 1001, применяемые для выявления ДНК возбудителя паракок-1 люша, также входит в состав ДНК некоторых штаммов В. bronchiseptica. Исследователи разработали новую систему праймеров для мишени IS 1002, которую предложено использовать для повышения специфичности тестов совместно с системами для IS481 и IS 1001 [18]. ' Исходя из этого, нами были сделаны выводы, что у исследователей разных стран, относительно возбудителя бордетеллеза нет стандартизированных праймерных систем, способных однозначно идентифицировать виды j внутри рода Bordetella, так как мобилен не только их генетический материал, но и различные варианты вставочных элементов, например IS481 или IS 1001. Разногласия связаны, прежде всего, с выбором участка генома возбудителя в качестве мишени, методики выделения нуклеиновой кислоты, а также методологии системы детекции амплифицированного фрагмента. Поэтому нашей задачей был подобр праймерных систем для специфической идентификации возбудителя бронхисептикоза, а также адаптация их для проведения мульти-. плексной ПЦР с одновременным выявлением фрагментов ДНК и фрагмента специфичного для представителей рода.

Важной особенностью наших исследований было то, что адаптированная ПЦР для выявления В. bronchiseptica по чувствительности не должна ус' тупать диагностическим системам, разработанным зарубежными исследователями для идентификации В. perussis и В. parapertussis.

Определив все этапы проведения полимеразной цепной реакции, методы и характеристики последующей детекции, на основании данных баз. нук-леотидных последовательностей были подобраны потенциальные генымишени (BfrA и BfrZ) для выявления В. bronchiseptica. Для них были определены праймеры и оптимизирован протокол исследования.

Проанализировав литературные данные, основанные на исследованиях генома рода Bordetella, видов В. pertussis и В. parapertussis, которые являются ответвлениями от В. bronchiseptica, мы поставили задачу разработать систему, основанную на полимеразной цепной реакции, которая могла бы выявить участок гена, общего для этих трех представителей рода. Таким общим геном, не встречающимся у других видов Bordetella, является ген, кодирующий фермент цитохром-С-оксидазу (Cytochrom-C-oxidase). Аналогично, был выбран общий для рода Bordetella ген. Нами была оптимизирована методика проведения полимеразной цепной реакции с системами праймеров к участкам генов BfrA и BfrZ В. bronchiseptica, гену Cytochrom-C-oxidase трех представителей рода Bordetella (В. bronchiseptica, В. pertussis и В. parapertussis) и общеродовому гену 16S rRNA для Bordetella spp.

После подбора и синтеза праймеров были подобраны условия и оптимизирован протокол проведения полимеразной реакции аналогично уже описанной технологии. Концентрация праймеров была подобрана опытным путем — она составила 10 pmol на реакционную смесь объемом 25 мкл.

Нами создана универсальная программа амплификации для проведения ПЦР-исследования с электрофоретической детекцией продуктов амплификации. Полученные данные свидетельствуют о высокой степени чувствительности полимеразной цепной реакции для выявления В. bronchiseptica по сравнению с другими методами, что позволяет рекомендовать ее в качестве точного диагностического метода исследования.

После оптимизации условий и режима проведения полимеразной цепной реакции с каждой из пар праймеров, были проведены эксперименты с применением современной технологии — ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени». Нами была предложена схема проведения ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» для количественной оценки содержания ДНК В. bronchiseptica. Определены абсолютные концентраций ДНК В. bronchiseptica на примере участка гена BfrZ с применением инте? ркали-рующего красителя SYBR Green I и стандартных образцов ДНК кулЕ"тур В. bronchiseptica с известными значениями КОЕ/мл. В экспериментах^данной работы они составили от 2,3×103 до 6,8×108 копий ДНК/мл для участка гена BfrZ.

Основные требования современной лабораторной диагностики основываются на чувствительности и специфичности ПЦР-системы. Поэтому для повышения специфичности мы разработали мультиплексную ПЦР-систему, которая позволяет одновремнно выявлять несколько фрагментов ДНК В. bronchiseptica.

В результате данного эксперимента были подобраны условия проведения полимеразной цепной реакции в мультиплексном формате, что позволяет в одной пробирке идентифицировать наличие ДНК В. bronchiseptica по двум или трем различным критериям: видовых генов (BfrA и BfrZ) а также наличие участка гена, являющегося общим для В. bronchiseptica, В. pertussis и В. parapertussis. Такая комбинация праймерных систем значительно повышает специфичность идентификационного теста.

Исходя из задач данной работы были подобраны праймеры к специфическим фрагментам ДНК В. bronchiseptica — Prl-1 (5' ccttccacacctggcggtacga-gttgctcc 3') и Prl-2 (5' ccccgtgccggggtgcctggacctgggcg 3') для гена BfrA, Pr3−1 (5'ggacgaccaggatcacatcttcc 3') и Pr3−2 (5'gctttcctggtagttggcgtagg 3') для гена BfrZтакже были определены праймеры, позволяющие выявлять специфические фрагменты ДНК представителей рода Bordetella — Рг2−1 (5' gcattgctccat-cctgttgtgcg 3') и Рг2−2 (5' gatgggttatctgagcgcgc 3') для гена Cytochrom-C-oxidase ДНК В. bronchiseptica, В. pertussis и В. parapertussis, Pr 16mg-f (5' ctacgggggaaagcggggga 3') и Pr 16mg-r (5' gaccgtactccccaggcggt 3') для гена 16S рРНК Bordetella spp.

В исследованиях доказана высокая специфичность выявления В. bronchiseptica при проведении ПЦР с системами праймеров для фрагментов BfrA и BfrZ: из 42 штаммов В. bronchiseptica (5 референс-штаммов и 37, выделенных из клинического материала) 42 обнаружили наличие специфических участков генов BfrA и BfrZ. Штаммы В. parapertussis и других грамот-рицательных бактерий в реакциях ПЦР с этими системами праймеров дали отрицательный результат.

Опытным путем была подобрана совокупность систем праймеров и условия для одновремнного выявления 3 участков ДНК В. bronchiseptica в формате мультиплексной ПЦР: участка гена BfrA и участка гена BfrZ генома В. bronchiseptica, а также участка гена Cytochrom-C-oxidase, специфичного для В. bronchiseptica, В. pertussis и В. parapertussis. Определены соотношения этих систем в реакции — 1:1:3 соответственно.

Для количественной оценки содержания ДНК В. bronchiseptica была определена схема проведения ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени». Определены абсолютные концентрации ДНК В. bronchiseptica на примере участка гена BfrZ с применением интеркалирующего красителя SYBR Green I и стандартных образцов ДНК культур В. bronchiseptica с из5 вестными значениями КОЕ/мл. В экспериментах данной работы они состави.

5 о ли от 2,3×10 до 6,8×10 геномов-эквивалентов/мл для участка гена BfrZ.

При статистических расчетах была определена чувствительность и специфичность метода ПЦР при идентификации В. bronchiseptica в сравнении с микробиологическим методом. Так чувствительность оказалась 97%, а специфичность 92%.

В результате проведенных экспериментов была доказана высокая эффективность метода полимеразной цепной реакции при идентификации В. bronchiseptica.

Разработанные методические подходы с применением иммуноэлектро-фореза по методу P. Grabar и С. Williams, описанному X. Фримель (1979) позволяют проводить анализ антигенной структуры В. bronchiseptica, а использование полимеразной цепной реакции — идентификацию инфекционного агента в биологическом материале.