Диплом, курсовая, контрольная работа
Помощь в написании студенческих работ

Изменение аллостерической регуляции N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат синтетазы Escherichia coli методом комбинаторного мутагенеза

Диссертация: Изменение аллостерической регуляции N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат синтетазы Escherichia coli методом комбинаторного мутагенеза
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Очевидно, что для создания высокоэффективных штаммов-продуцентов аминокислот необходимо конструирование таких мутантных белков, аллостерическое ингибирование которых конечными продуктами реакций было бы нарушено {for, feed back resistance фенотип). Как правило, fbr фенотип фермента достигается как результат замены одного аминокислотного остатка на другой в одном или нескольких сайтах белковой… Читать ещё >

Содержание

  • СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
  • АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
  • ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ
  • НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ
  • Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. 1. Искусственная эволюция белков
      • 1. 1. 1. Цели и задачи искусственной эволюции белков
      • 1. 1. 2. Искусственная эволюция белков методами случайного мутагенеза
        • 1. 1. 2. 1. Радиационный и химический мутагенез
        • 1. 1. 2. 2. Метод подверженной ошибкам ПЦР
      • 1. 1. 3. Искусственная эволюция белков методами направленного мутагенеза
        • 1. 1. 3. 1. Сайт-специфический мутагенез
        • 1. 1. 3. 2. Сайт-сосредоточенный мутагенез
        • 1. 1. 3. 3. Мутагенез рандомизированными олигонуклеотидами
      • 1. 1. 4. Искусственная эволюция белков, основанная на рекомбинационных методах мутагенеза
        • 1. 1. 4. 1. Метод перетасовки ДНК
        • 1. 1. 4. 2. Метод геномной перетасовки
        • 1. 1. 4. 3. Метод прерывистой элонгации
        • 1. 1. 4. 4. Случайное образование химерных молекул на временной матрице
        • 1. 1. 4. 5. Гетеродуплекс
        • 1. 1. 4. 6. Сборка соответствующих олигонуклеотидов
        • 1. 1. 4. 7. Мутагенная и однонаправленная повторная сборка
        • 1. 1. 4. 8. Метод экзонной перетасовки
        • 1. 1. 4. 9. Негомологичная рекомбинация
    • 1. 2. Аллостеричесьсие ферменты
      • 1. 2. 1. Аллостерическая регуляция
      • 1. 2. 2. Ретроингибирование
      • 1. 2. 3. N-ацетилглутамат-синтетаза
      • 1. 2. 4. N-ацетилглутамат киназа
      • 1. 2. 5. Карбамоилфосфат синтетаза
        • 1. 2. 5. 1. Механизм действия CPSase
        • 1. 2. 5. 2. Аллостерическая регуляция CPSase
        • 1. 2. 5. 3. Регуляция транскрипции оперона сагАВ
  • Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
    • 2. 1. Бактериальные штаммы
      • 2. 1. 1. Конструирование штамма B7: argA-ml3:argGH
    • 2. 2. Среды и условия культивирования штаммов
      • 2. 2. 1. Условия культивирования штаммов TGI, В16−4, В3083 и В
      • 2. 2. 2. Условия культивирования штаммов-продуцентов оротовой кислоты и аргинина
    • 2. 3. Эксперименты с рекомбинантной ДНК
      • 2. 3. 1. Генно-инженерные методики
      • 2. 3. 2. Конструирование плазмиды pUC18-argI
      • 2. 3. 3. Конструирование плазмиды pKK-argA-wt
      • 2. 3. 4. Конструирование плазмиды pMIV-5-Pj-argA-ml
      • 2. 3. 5. Конструирование плазмиды pMIV-5-Pj-argGH
      • 2. 3. 6. Конструирование плазмиды pET-Piac
      • 2. 3. 7. Конструирование плазмиды pEL-carAB-wt
      • 2. 3. 8. Конструирование малокопийных плазмид, содержащих гены сагАВ
    • 2. 4. Создание библиотек мутантных генов
      • 2. 4. 1. Создание библиотеки мутантных argA генов
      • 2. 4. 2. Создание библиотеки мутантных сагВ генов
    • 2. 5. Отбор активных мутантов
      • 2. 5. 1. Отбор вариантов, синтезирующих активную NAGS в клетках Е. coli штамма TG
      • 2. 5. 2. Отбор вариантов, синтезирующих активную NAGS в клетках E. coli В
      • 2. 5. 3. Отбор вариантов, синтезирующих активную CPSase
    • 2. 6. Выделение и очистка белка NAGS
    • 2. 7. Измерение ферментативных активностей
      • 2. 7. 1. Анализ ферментативной активности мутантных NAGS
      • 2. 7. 2. Анализ ферментативной активности мутантных CPSase
  • Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
    • 3. 1. Метод комбинаторного мутагенеза
    • 3. 2. Получение мутантов N-ацетилглутамат синтетазы
      • 3. 2. 1. Конструирование рандомизированной библиотеки генов argA
      • 3. 2. 2. Селекция «активных вариантов» мутантных ферментов NAGS в клетках E. coli штамма TG
      • 3. 2. 3. Селекция мутантных ферментов NAGS в клетках E. coli штамма В
      • 3. 2. 4. Активности мутантных ферментов в клеточных экстрактах
      • 3. 2. 5. Очистка и кинетические свойства мутантных NAGS
      • 3. 2. 6. Применение полученных fbr-мутантов NAGS в процессе создания штамма-продуцента аргинина
    • 3. 3. Применение метода комбинаторного мутагенеза для изменения аллостерической регуляции карбамоилфосфат синтетазы из Е. col
      • 3. 3. 1. Конструирование библиотеки мутантных генов сагВ
      • 3. 3. 2. Селекция fbr мутантов CPSase
      • 3. 3. 3. Применение полученных fbr-мутантов CPSase в процессе конструирования штамма-продуцента оротовой кислоты
      • 3. 3. 4. Применение полученных fbr-мутантов CPSase в процессе конструирования штамма-продуцента аргинина
  • ВЫВОДЫ

Изменение аллостерической регуляции N-ацетилглутамат синтетазы и карбамоилфосфат синтетазы Escherichia coli методом комбинаторного мутагенеза (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

В настоящее время аминокислоты приобрели огромное промышленное значение. Область их применения необычайно широка, от использования в качестве компонентов пищевых добавок до создания на их основе лекарственных форм и разнообразной косметики. Современное производство аминокислот исчисляется миллионами тонн в год, а совокупный объем продаж — миллиардами долларов. Очевидно, что стремительно развивающийся рынок аминокислот и продуктов, созданных на их основе будет требовать адекватного увеличения их производства (Bongaerts et al, 2001). На сегодняшний день практически безальтернативным способом массового производства большинства аминокислот является их микробный синтез. Эффективность этого биотехнологического процесса во многом зависит от характеристик используемого бактериального штамма-продуцента. В процессе его конструирования необходимо решать множество задач, связанных с различными сторонами жизнедеятельности бактерий. К ним можно отнести оптимизацию экспрессии генов биосинтеза целевой аминокислоты, энергетическое обеспечение биосинтеза, повышение эффективности транспорта в клетку питательных веществ и экспорта целевой аминокислоты в культуральную жидкость, и т. д.

Одним из важнейших аспектов общей стратегии создания штаммов-продуцентов аминокислот и других биогенных молекул является модификация аллостерической регуляции ключевых ферментов их биосинтеза. Частный случай аллостерической регуляции, ретроингибирование, является одним из основных способов контроля скорости биосинтеза аминокислот и других биогенных молекул. Этот процесс основан на принципе отрицательной обратной связи, когда продукт биосинтетической цепи подавляет активность фермента, катализирующего первую стадию. Как правило, подобной регуляции подвержены ферменты, катализирующие практически необратимые биохимические реакции. Перераспределяя потоки ключевых молекул между клеточным метаболизмом и синтезом данного вещества (например — аминокислоты или нуклеотидов) в зависимости от его концентрации, эти белки выполняют функцию своеобразных «метаболических клапанов», обеспечивающих клеточный гомеостаз.

Очевидно, что для создания высокоэффективных штаммов-продуцентов аминокислот необходимо конструирование таких мутантных белков, аллостерическое ингибирование которых конечными продуктами реакций было бы нарушено {for, feed back resistance фенотип). Как правило, fbr фенотип фермента достигается как результат замены одного аминокислотного остатка на другой в одном или нескольких сайтах белковой последовательности.

Поиск и идентификация fbr мутантов всегда являлось достаточно трудоемкой задачей. Эти мутации обычно возникают спонтанно при благоприятных для этого условиях и соответствующей системе отбора (Vyas and Maas, 1963; Гаврилова и соавт., 1988; Di Girolamo et al, 1988). С другой стороны, основываясь на анализе трехмерной структуры белка, можно вводить те или иные замены аминокислотных остатков, изменяя его кинетические характеристики. Однако, современный уровень понимания структурно-функциональных связей в белках пока еще недостаточен для проведения успешного рационального дизайна ферментов и полученные таким образом мутанты имеют существенно более низкую удельную активность по сравнению с ферментом дикого типа (например, в случае мутантов фермента SAT, Nakamori et al, 1998; мутантов пантотенат киназы, Rocketal., 2003; мутантов префенат дегидротазы, Hsu et al., 2004).

Таким образом, получение ферментов со снятым ретроингибированием и одновременным сохранением его основных кинетических параметров во многом определяется экспериментальным везением. В этой связи, весьма актуальной представляется задача разработки новых методологических подходов к проблеме получения модифицированных аллостерических ферментов с заданными функциональными параметрами.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ.

Целью данной работы являлись разработка метода комбинаторного мутагенеза и его применение для модификации аллостерической регуляции N-ацетилглутамат синтетазы (NAGS) и карбамоилфосфат синтетазы (CPSase) из Е. coli.

В ходе работы были решены следующие задачи:

• разработка метода эффективного направленного мутагенеза, позволяющего получать «библиотеку» мутантных генов, кодирующих белки, которые различаются по нескольким аминокислотам в одном заданном участке аминокислотной последовательности;

• получение fbr мутантов NAGS, обладающих высоким уровнем удельной активности и исследование их основных кинетических параметров;

• получение fbr мутантов CPSase, нечувствительных к ингибированию UMP и обладающих высоким уровнем удельной активности;

• применение модифицированных ферментов в процессе создания штаммов-продуцентов аргинина и оротовой кислоты на основе Е. coli.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.

Разработана оригинальная методика эффективного направленного мутагенеза (метод комбинаторного мутагенеза), позволяющего получать библиотеку генов, кодирующих представительную выборку белков, различающихся по нескольким аминокислотам в одном специфическом участке.

Впервые была показана возможность применения данного метода для получения не подверженных ретроингибированию ферментов: NAGS и CPSase из Е. coli. В каждом случае из совокупности мутантных белков удалось отобрать ферменты с заданными свойствами без использования специальных методов селекции.

На примере NAGS показано, что предложенный подход позволяет получать серию мутантов с измененными в широком диапазоне основными кинетическими параметрами ферментов (Км, Vmax). Полученная коллекция мутантных белков может быть использована для дальнейших экспериментов по изучению их структуры и функций.

Впервые показано, что представленная методика может быть эффективно использована при конструировании штаммов-продуцентов аминокислот (нуклеотидов) на этапе оптимизации экспрессии генов аллостерических ферментов, что нашло отражение в соответствующем патенте.

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что метод комбинаторного мутагенеза с использованием рандомизированных олигонуклеотидов позволяет решить задачу конструирования высокоактивных ферментов биосинтеза аминокислот, устойчивых к ретроингибированию.

2. Сконструированы устойчивые к ингибированию аргинином мутанты N-ацетилглутамат синтетазы (NAGS) E. coli, характеризующиеся более высокой каталитической эффективностью по сравнению с исходным ферментом NAGS: для глутамата отношение kcat/KM увеличено в 2 раза, для ацетил-СоАв 15 раз.

3. Экспрессия мутантных генов NAGS в штамме-продуценте В7925 обеспечила увеличение биосинтеза аргинина в 2 раза по сравнению с родительским штаммом. Тем самым показана перспективность использования данных мутантов для конструирования промышленных штаммов-продуцентов аргинина.

4. Сконструированы мутанты карбамоилфосфат синтетазы (CPSase) E. coli устойчивые к ингибированию UMP, обладающие высокой удельной активностью, сравнимой с активностью исходного фермента.

5. Экспрессия мутантных генов CPSase в штамме-продуценте В8085 приводит к существенному увеличению синтеза оротовой кислоты, что может представлять практический интерес для микробиологического производства как самой оротовой кислоты, так и пиримидиновых нуклеотидов.

Показать весь текст

Список литературы

  1. О.Ф., Миронов А. С., Николаевская Е. Е., Родионов О. А., Хургес Е. М. 1988. Генетическое картирование мутации ilv7434, обеспечивающей устойчивость треониндезаминазы к ингибированию изолейцином у Escherichia coli. Генетика. 24,13−22.
  2. О.А., Никифоров В. Г. 1982. Направленный мутагенез. Генетика. 18, 349−359.
  3. Л.Р., Альтман И. Б., Гуров М. В. 1998. Экспрессия синтетического гена интерлейкина-10 человека и его вариантов в клетках Escherichia coli. Биоорг. Химия. 24, 48−57.
  4. И.А. 1946. Карбонильные соединения и химический механизм мутаций. ДАН СССР. 54,65.
  5. О. Б., Томаева Ф. Э., Зверева Т. В. 2002 Оротовая кислота как препарат метаболического действия. Вестник РАМН. 2, 39−41
  6. Abdelal А.Т., Nainan 0. 1979. Regulation of N-acetylglutamate synthesis in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 137, 1040−1042.
  7. Aguinaldo A.M. and Arnold F.H. 2003. Staggered extension process (StEP) in vitro recombination. Methods Mol. Biol. 231,105−110.
  8. A., Hovi T. 1998. Modified base compositions at degenerate positions of a mutagenic oligonucleotide enhance randomness in site-saturation mutagenesis. Nucleic Acids Res. 26(2), 576−81.
  9. An Y., Ji J., Wu W., Lv A., Huang R., Xiu Z. 2006. Молекулярная эволюция аденозилметионинсинтетазы на основе рекомбинации ДНК с помощью нового метода «раздельных реакций с последующим смешиванием». Молекулярная Биология. 40, 546−553.
  10. P.M., Meister А. 1966. Control of Escherichia coli carbamoylphosphate synthetase by purine and pyrimidine nucleotides. Biochemistry. 5, 3164−3167.
  11. E., Basu S., Karig D.K., Weiss R. 2006. Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline. Mol Syst Biol. 2:2006.0028.
  12. Arnold F.H. and Georgiou G. 2003a. Directed enzyme evolution: screening and selection methods. Methods in molecular biology, vol. 230. Humana Press, Totowa, N.J.
  13. Arnold F.H. and Georgiou G. 2003b. Directed enzyme evolution: screening and selection methods. Methods in molecular biology, vol. 231. Humana Press, Totowa, N.J.
  14. Bittker J.A., Le B.V., Liu J.M., Liu D.R. 2004. Directed evolution of protein enzymes using nonhomologous random recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 7011−7016.
  15. Bloom J.D., Meyer M.M., Meinhold P., Otey C.R., MacMillan D., Arnold F.H. 2005. Evolving strategies for enzyme engineering. Curr Opin Struct Biol. 15(4), 447−52.
  16. В., Meister A. 1981. Conversion of UMP, an allosteric inhibitor of carbamyl phosphate synthetase, to an activator by modification of the UMP ribose moiety. J Biol Chem. 256,5977−80.
  17. В., Meister A. 1982. Regulation of Escherichia coli carbamyl phosphate synthetase. Evidence for overlap of the allosteric nucleotide binding sites. J Biol Chem. 257,13 971−6.
  18. J., Kramer M., Muller U., Raeven L., Wubboltsl M. 2001. Metabolic engineering for microbial production of aromatic amino acids and derived compounds. Metabolic Engineering, 3,289−300.
  19. M.M. 1976. A rapid and sensitive method of for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 72, 248−254.
  20. B.L., Mullins L.S., Raushel F.M., Reinhart G.D. 1999. Allosteric dominance in carbamoyl phosphate synthetase. Biochemistry. 38,1394−401.
  21. Cadwell, R.C. and Joyce, G.F. 1994. Mutagenic PCR. PCR Methods Appl., 3,136 140.
  22. L., Tuchman M. 2003. N-acetylglutamate and its changing role through evolution. Biochem J. 372,279−90.
  23. J.H., Lengyel J.A., Langridge J. 1973. Evolution of a second gene for beta-galactosidase in Escherichia coli. Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 70,1841−1845.
  24. Cerda-Olmedo E., Hanawalt P.C., Guerola N. 1968. Mutagenesis of the replication point by nitrosoguanidine: Map and pattern of replication of Escherichia coli chromosome. -J.Mol.Biol. 33, 705.
  25. P.C., Mayer K.M., Umeno D. 2003. Generating mutant libraries using error-prone PCR. Methods Mol. Biol. 231, 3−9.
  26. H.G. 2004. Magnesium orotate-experimental and clinical evidence. Rom J Intern Med. 42,491−501.
  27. W.M., Levinson W.E., Crist M.J., Hektor H.J., Darzins A., Pienkos P.T., Squires C.H., Monticello D.J. 2001. DNA shuffling method for generating highly recombined genes and evolved enzymes. Nat. Biotechnol. 19, 354−359.
  28. W.M. 2003. RACHITT: Gene family shuffling by Random Chimeragenesis on Transient Templates. Methods Mol. Biol. 231,111−127.
  29. Cohen N.S., Kyan F. S, Kyan S.S., Cheung C.W., Raijman L. 1985. The apparent Km of ammonia for carbamoyl phosphate synthetase (ammonia) in situ. Biochem J. 229, 205−11.
  30. Croitoru V., Bucheli-Witschel M., Hagg P., Abdulkarim F., Isaksson L.A. 2004. Generation and characterization of functional mutants in the translation initiation factor IF1 of Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 271, 534−544.
  31. Di Girolamo M., Busiello V., Di Girolamo A., Foppoli C., De Marco C. 1988. Aspartokinase III repression in a thialysine-resistant mutant of E. coli. Biochem Int. 17, 545−54.
  32. D., Duperat V.G., Arveiler B. 2002. SCAN domain-containing 2 gene (SCAND2) is a novel nuclear protein derived from the zinc finger family by exon shuffling. Gene. 289, 1−6.
  33. Т., Leisinger T. 1975. Isolation and characterization of mutant with a feedback resistant N-acetylglutamate synthase in Escherichia coli К 12. Mol. Gen. Genet. 138,225−232.
  34. J.B., Silberg J.J., Wang Z.G., Arnold F.H. 2004. Site-directed protein recombination as a shortest-path problem. Protein Eng Des Sel. 17(7), 589−94.
  35. Fernandez-Murga M.L., Gil-Ortiz F., Llacer J.L., Rubio V. 2004. Arginine biosynthesis in Thermotoga maritima: characterization of the arginine-sensitive N-acetyl-L-glutamate kinase. JBacteriol. 186, 6142−9.
  36. K., Vogel P. D., Wise J. G. 2003. Combinatorial Redesign of the DNA Binding Specificity of a Prokaryotic Helix-Turn-Helix Repressor. J. Bacteriol. 185, 475−481.
  37. Fujii R., NakagawaY., Hiratake J., Sogabe A., Sakata K. 2005. Directed evolution of Pseudomonas aeruginosa lipase for improved amide-hydrolyzing activity. Protein Engineering, Design & Selection. 18, 93−101.
  38. M.L., Matsumura I. 2004. Rapid evolution of beta-glucuronidase specificity by saturation mutagenesis of an active site loop. J Biol Chem. 279,26 462−8.
  39. J., Cervone F., Lamberti A. 1978. Dual autogenous regulatory role of threonine deaminase in E. coli K-12. Mol. Gen. Genet. 159, 27−32.
  40. Guerola N., Ingraham J.L., Cerda-Olmedo E. 1971. Induction of closely linked multiple mutations by nitrosoguanidine. Nature New Biol. 230,122.
  41. Gunasekaran К., Ma В., Nussinov R. 2004. Is allostery an intrinsic property of all dynamic proteins? Proteins. 57,433−43.
  42. B.G. 1973. In vivo complementation between wild-type and mutant (3-galactosidase in Escherichia coli. J.Bacteriol. 114, 448−450.
  43. B.G. 1981. Changes in the substrate specificities of an enzyme during directed evolution of new functions. Biochemistry. 20, 4042−4049.
  44. B.G. 2002. Predicting evolution by in vitro evolution requires determining evolutionary pathways. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 3035−3038.
  45. B.G. 2003. The EBG system of E. coli: origin and evolution of a novel beta-galactosidase for the metabolism of lactose. Genetica. 118,143−156.
  46. Hall B.G. and Hartl D.L. 1974. Regulation of newly evolved enzymes. I. Selection of a novel lactase regulated by lactose in Escherichia coli. Genetics. 76, 391 400.
  47. Han X., Turnbough C.L. Jr. 1998. Regulation of carAB expression in Escherichia coli occurs in part through UTP-sensitive reiterative transcription. J Bacteriol. 180, 705−13.
  48. Hiraga K. and Arnold F.H. 2003. General method for sequence-independent site-directed chimeragenesis. J. Mol. Biol. 330,287−296.
  49. HoldenH.M., Thoden J.B., Raushel F.M. 1998. Carbamoyl phosphate synthetase: a tunnel runs through it. Curr Opin Struct Biol. 8, 679−85.
  50. M.S., Loeb L.A. 1986. Promoters selected from random DNA sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83,7405−7409.
  51. Hsu S.K., Lin L.L., Lo H.H., Hsu W.H. 2004. Mutational analysis of feedback inhibition and catalytic sites of prephenate dehydratase from Corynebacterium glutamicum. Arch Microbiol. 181, 237−44.
  52. X., Raushel F.M. 2000a. An engineered blockage within the ammonia tunnel of carbamoyl phosphate synthetase prevents the use of glutamine as a substrate but not ammonia. Biochemistry. 39, 3240−7.
  53. R.A. 1976. Enzyme recruitment in evolution of new function. Annu. Rev. Microbiol. 30,409−425.
  54. A.A., Villafranca J.J. 1988. Interactive binding between the substrate and allosteric sites of carbamoyl-phosphate synthetase. Biochemistry. 27, 8050−6.
  55. D., Zuiderweg E.R. 2003. The role of dynamics in allosteric regulation. Curr Opin Struct Biol. 13(6), 748−57.
  56. Y., Haruki M., Morikawa M., Kanaya S. 2001. Stabilities of chimeras of hyperthermophilic and mesophilic glycerol kinases constructed by DNA shuffling. J Biosci Bioeng. 91(6), 551−6.
  57. J.A., Stemmer W.P. 2001. Directed evolution of proteins by exon shuffling. Nat. Biotechnol. 19, 423−428.
  58. A., Charlier D., Gigot D., Huysveld N., Roovers M., Glansdorff N. 1998. pyrH-Qncoded UMP-kinase directly participates in pyrimidine-specific modulation of promoter activity in Escherichia coli. J Mol Biol. 280, 571−82.
  59. U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680−685.
  60. D.M., Gerlach J.L., Adman E.T., Loeb L.A. 1999. Tolerance of 5-fluorodeoxyuridine resistant human thymidylate synthases to alterations in active site residues. Nucleic Acids Res. 27, 3702−3711.
  61. Lee P.C., Petri R., Mijts B.N., Watts K.T., Schmidt-Dannert C. 2005. Directed evolution of Escherichia coli farnesyl diphosphate synthase (IspA) reveals novel structural determinants of chain length specificity. Metab Eng. 7, 18−26.
  62. Т., Haas D. 1975. N-acetylglutamate synthase of Escherichia coli: regulation of synthesis and activity by arginine. J. Biol. Chem. 250,1690−1693.
  63. T.G., Neidhardt F.C. 1967. Formation and operation of the histidine-degrading pathway in Pseudomonas aeruginosa. JBacteriol. 93,1800−10.
  64. J.S., Thorolfsson M., Martinez A. 2005. Allosteric mechanisms in ACT domain containing enzymes involved in amino acid metabolism. Amino Acids. 28, 1−12.
  65. Lin Т., Goman M., Scaife J. 1979. Lambda transducing bacteriophage carrying deletions of the argECBH-rpoBC region of the Escherichia coli chromosome. J. Bacteriol. 140,479−489.
  66. Lin H. and Cornish V.W. 2002. Screening and selection methods for large-scale analysis of protein function. Angew Chem. 41, 4402−4425.
  67. Lutz S. and Ostermeier M. 2003. Preparation of SCRATCHY hybrid protein libraries: size- and in-frame selection of nucleic acid sequences. Methods Mol. Biol. 231, 143−151.
  68. S., Ostermeier M., Benkovic S.J. 2001. Rapid generation of incremental truncation libraries for protein engineering using alpha-phosphothioate nucleotides. Nucleic Acids Res. 29, el6.
  69. Т., Fritsch E., Sambrook T. 1982. Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory.
  70. D.K., Leisinger T. 1977. N-acetylglutamate synthase of Escherichia coli: purification, characterization, and molecular properties. J Biol Chem. 252, 3295−303.
  71. A. 1989. Mechanism and regulation of the glutamine-dependent carbamoylphosphate synthetase of Escherichia coli. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 62,315−74.
  72. Miller L.W. and Cornish V.W. 2005. Selective chemical labeling of proteins in living cells. Curr. Opin. Chem. Biol. 9, 56−61.
  73. K., Takenouchi M., Kondo H., Noro N., Suzuki M., Tsuda S. 2006. Thermal stabilization of Bacillus subtilis family-11 xylanase by directed evolution. J Biol Chem. 281,10 236−42.
  74. Monroy-Lagos O., Soberon X., Gaytan P., Osuna J. 2006. Improvement of an unusual twin-arginine transporter leader peptide by a codon-based randomization approach. Appl Environ Microbiol. 72, 3797−801.
  75. S., Kobayashi S.I., Kobayashi C., Takagi H. 1998. Overproduction of L-cysteine and L-cystine by Escherichia coli strains with a genetically altered serine acetyltransferase. Appl Environ Microbiol. 64, 1607−11.
  76. M., Hobbs M., Nicholas R.A. 2002. Identification and analysis of amino acid mutations in porin IB that mediate intermediate-level resistance to penicillin and tetracycline in Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob Agents Chemother. 46, 2811−20.
  77. M., Nixon A.E., Benkovic S.J. 1999a. Incremental truncation as a strategy in the engineering of novel biocatalysts. Bioorg. Med. Chem. 7, 2139−2144.
  78. M., Shim J.H., Benkovic S.J. 1999b. A combinatorial approach to hybrid enzymes independent of DNA homology. Nat. Biotechnol. 17, 1205−1209.
  79. Palzkill Т., Le Q.Q., Wong A., Botstein D. 1994. Selection of functional signal peptide cleavage sites from a library of random sequences. JBacteriol. 176, 563−8.
  80. A.B., Yates R.A. 1956. Control of pyrimidine biosynthesis in Escherichia coli by a feed-back mechanism. J Biol Chem. 221, 757−70.
  81. P.H., Loeb L.A. 2000. Multiple amino acid substitutions allow DNA polymerases to synthesize RNA. J Biol Chem. 275,40 266−72.
  82. Patnaik R., Louie S., Gavrilovic V., Perry K., Stemmer W.P., Ryan C.M., del Cardayre S. 2002. Genome shuffling of Lactobacillus for improved acid tolerance. Nat. Biotechnol. 20, 707−712.
  83. W.M., Firth A.E. 2005. Strategies and computational tools for improving randomized protein libraries. Biomol Eng. 22(4), 105−12.
  84. G., Zhang S., Husain A., Wilson D.B., Ganem B. 1999. Regulation of phenylalanine biosynthesis. Studies on the mechanism of phenylalanine binding and feedback inhibition in the Escherichia coli P-protein. Biochemistry. 38, 12 212−7.
  85. F.M., Rawding C.J., Anderson P.M., Villafranca J.J. 1979. Paramagnetic probes for carbamoyl-phosphate synthetase: metal ion binding studies and preparation of nitroxide spin-labeled derivatives. Biochemistry. 18, 5562−6.
  86. F.M., Mullins L.S., Gibson G.E. 1998a. A stringent test for the nucleotide switch mechanism of carbamoyl phosphate synthetase. Biochemistry. 37, 10 272−8.
  87. Raushel F.M., Thoden J. B, Reinhart G.D., Holden H.M. 1998b. Carbamoyl phosphate synthetase: a crooked path from substrates to products. Curr Opin Chem Biol. 2, 624−32.
  88. F.M., Thoden J.B., Holden H.M. 1999. The amidotransferase family of enzymes: molecular machines for the production and delivery of ammonia. Biochemistry. 38, 7891−9.
  89. Reidhaar-Olson J. F. and R. T. Sauer. 1988. Combinatorial cassette mutagenesis as a probe of the informational content of protein sequences. Science. 241, 53−57.
  90. Roberts R.W. and Szostak J.W. 1997. RNA-peptide fusions for the in vitro selection of peptides and proteins. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 94,12 297−12 302.
  91. C.O., Park H.W., Jackowski S. 2003. Role of feedback regulation of pantothenate kinase (CoaA) in control of coenzyme A levels in Escherichia coli. J Bacteriol. 185, 3410−5.
  92. S.D., Nyunoya H., Lusty C.J. 1986. Catalytic domains of carbamyl phosphate synthetase. Glutamine-hydrolyzing site of Escherichia coli carbamyl phosphate synthetase. J Biol Chem. 261,11 320−7.
  93. Saeed-Kothe A., Powers-Lee S.G. 2002. Specificity determining residues in ammonia- and glutamine-dependent carbamoyl phosphate synthetases. J Biol Chem. 277, 7231−8.
  94. M., Carey J., Grandori R. 2005. Assembly of the hexameric Escherichia coli arginine repressor investigated by nano-electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 19, 2549−52.
  95. J., Fritsch E.F., Maniatis T. 1989. Moleccular cloning: a laboratory manual., 2nd ed. edn. Cold Spring Harbor, N.Y.
  96. F., Nicklen S., Coulson A.R. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA, 74,5463−5467.
  97. H. 2002. Immunogenicity of therapeutic proteins: clinical implications and future prospects. Clin. Ther. 24,1720−1740.
  98. Sengupta D., Lin H, Goldberg S.D., Mahal J. J, Cornish V.W. 2004. Correlation between catalytic efficiency and the transcription read-out in chemical complementation: a general assay for enzyme catalysis. Biochemistry. 43, 3570−3581.
  99. Shen J.C. and Loeb L.A. 2003. Mutations in the a8 Loop of Human APE 1 Alter Binding and Cleavage of DNA Containing an Abasic Site. J Biol Chem. 278, 46 994^17001.
  100. H., Kaneko S., Hayashi K. 2005. A single amino acid substitution enhances the catalytic activity of family 11 xylanase at alkaline pH. Biosci Biotechnol Biochem. 69, 1492−1497.
  101. A., Patel P.H., Loeb L.A. 2001. The conserved active site motif A of Escherichia coli DNA polymerase I is highly mutable. J Biol Chem. 276, 18 836−42.
  102. H.A., Silhavy T.J. 2003. The art and design of genetic screens: Escherichia coli. Nat Rev Genet. 4,419−31.
  103. V., Martinez C.A., Arnold F.H. 2001. Libraries of hybrid proteins from distanty related sequences. Nat. Biotechnol. 19, 456−460.
  104. J.L., Loeb L.A. 2003. Random oligonucleotide mutagenesis. Methods Mol Biol. 231, 65−73.
  105. W.P. 1994a. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91,10 747−10 751.
  106. W.P. 1994b. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature. 370,389−391.
  107. Suzuki M., Christians F.C., Kim В., Skandalis A., Black M.E., Loeb L.A. 1996. Tolerance of different proteins for amino acid diversity. Mol. Diver. 2,111−118.
  108. Szwajkajzer D., Dai L., Fukayama J.W., Abramczyk В., Fairman R., Carey J. 2001. Quantitative analysis of DNA binding by the Escherichia coli arginine repressor. J Mol Biol. 312,949−62.
  109. J.B., Holden H.M., Wesenberg G., Raushel F.M., Rayment I. 1997. Structure of carbamoyl phosphate synthetase: a journey of 96 A from substrate to product. Biochemistry. 36, 6305−16.
  110. J.B., Raushel F.M., Benning M.M., Rayment I., Holden H.M. 1999a. The structure of carbamoyl phosphate synthetase determined to 2.1 A resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55, 8−24.
  111. J.B., Raushel F.M., Wesenberg G., Holden H.M. 1999b. The binding of inosine monophosphate to Escherichia coli carbamoyl phosphate synthetase. J Biol Chem. 274, 22 502−7.
  112. UmbargerHLE. 1956. Evidence for a negative-feedback mechanism in the biosynthesis of isoleucine. Science., 123, 848.
  113. В., Liming G., Pluckhun A., Schneider К. C., Wellnhofer G., Moroney S. E. 1994. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22, 5600−5607.
  114. A.A., Shao Z., Arnold F.N. 1999. Recombination and chimeragenesis by in vitro heteroduplex formation and in vivo repair. Nucleic Acids Res. 27, el8.
  115. Voiles M.J. and Lansbury P.T. 2005. A computer program for the estimation of protein and nucleic acid sequence diversity in random point mutagenesis libraries. Nucleic Acids Research, 33, 3667−3677.
  116. S., Maas W.K. 1963. Feedback inhibition of acetylglutamate synthetase by arginine in Escherichia coli. Arch. Biochem. Biophys. 100, 542−546.
  117. H., Glansdorff N., Charlier D. 1998. The arginine repressor of Escherichia coli K-12 makes direct contacts to minor and major groove determinants of the operators. J Mol Biol. 277, 805−24.
  118. T.T., Bishop S.H., Himoe A. 1972. Detection of carbamate as a product of the carbamate kinase-catalyzed reaction by stopped flow spectrophotometry. J Biol Chem. 247,4437−40.
  119. A.J., Fersht A.R., Blow D.M., Carter P., Winter G. 1984. A large increase in enzyme-substrate affinity by protein engineering. Nature. 307,187−188.
  120. V.R., Lartigue D.J. 1967. Quaternary structure and certain allosteric properties of aspartase. J Biol Chem. 242, 2973−8.
  121. Yano Т., Oue S., Kagamiyama H. 1998. Directed evolution of an aspartate aminotransferase with new substrate specificities. Pro с Natl Acad Sci USA. 95, 5511−5.
  122. L., Kurek I., English J., Keenan R. 2005. Laboratory-directed protein evolution. Microbiol. And Mol. Biol. Rev. 69, 373−392.
  123. M., Williams D.M., Brown D.M., Gheradi E. 1996. An approach to random mutagenesis of DNA using mixtures of triphosphate derivatives of nucleoside analogues. J. Mol. Biol. 255, 5890−603.
  124. Zha D., Eipper A., Reetz M.T. 2003. Assembly of designed oligonucleotides as an efficient method for gene recombination: a new tool in directed evolution. Chembiochem. 4, 34−39.
  125. H., Arnold F.H. 1997. Optimization of DNA shuffling for high fidelity recombination. Nucleic Acids Res. 25, 1307−1308.
  126. Zhao H., Giver L., Shao Z., Affholter J. and Arnold F. 1998. Molecular evolution by staggered extension process (StEP) in vitro recombination. Nat. Biotechnol. 16, 258−261.
  127. J.H., Dawes G., Stemmer W.P. 1997. Directed evolution of a fucosidase from a galactosidase by DNA shuffling and screening. Proc Natl Acad Sci USA. 94,4504−9.
  128. Zhang Y.X., Perry K., Vinci V.A., Powell K., Stemmer W.P., del Cardayre S.B. 2002. Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria. Nature. 415, 644−646.
Заполнить форму текущей работой

На отлично!