Молочнокислые стрептококки

Реферат

Молочнокислые стрептококки

1. Общие понятия о молочнокислых бактериях

молочнокислый брожение бактерия гомоферментативный Молочнокислые бактерии, микробы, вызывающие в молоке (молочных продуктах) молочнокислое брожение, выражающееся в сбраживании молочного сахара в молочную кислоту; вследствие образования кислоты происходит свертывание молока. К Молочнокислым бактериям относятся палочки и кокки. Первые принадлежат к ацидофильным бацилам и обладают их свойствами; по классификации Лемана и Неймана палочки вместе с другими ацидофильными бацилами образуют группу «Plocamobacteria», а по Гейму и Шлирфу (Heim, Schlirf) — группу ацидобактерий. По американской классификации (Bergey) все Молочнокислые бацилы образуют особый вид-Lactobacil-laceae. Важнейшими представителями группы являются Вас. bul-garicus, Вас. caucasicus и другие. Мечниковым Вас. bulgaricus предложен для замещения «дикой» флоры кишечника у человека; Bact. mazun, 2,7−21 м в длину и 1 — 1,1 м в ширину, неподвижная, Грам-положительная палочка; не растет на обыкновенных питательных средах; на агаре с молочной сывороткой образует колонии с неровным краем и волосовидными отпрысками в окружающую среду. Содержится в мацуне, молочном продукте, изготовляемом в Армении. Повидимому идентична с LactobaC. caucasicus.-L actobac. lactis acidi Leichmann. Кроме перчисленных к молочнокислым бактериям относятся Lactobacillus Boas-Op р 1 е г i, встречающийся в желудочном содержимом, главным образом при раке желудка; Lactobacillus helvetieus (син. Вас. caseiFreudenreich’a), выделенный из кислого молока и сыров; Lactobacillus bu-sae asiaticus (Bact. busae asiaticae Tschekan), выделенный из бузы, и друг. — Микробом, всего чаще вызывающим скисание молока на холоду, является Streptococcus acidi lactici (Grotenfeldt) или по американской классификации-Streptococcus lacticus (Lister) Lonis. Для получения наилучшего роста всех видов молочнокислых микробов Омелянский рекомендует агар Коанди (Kohendy): 1 л молока кипятят 5 минут, добавляют 1,5 см³ соляной кислоты и фильтруют через холст. Полученную сыворотку слегка подщелачивают и на 1 л прибавляют 300 смг воды, 3 г желатины, 15 г. пептона и 20 гагара. Смесь прогревают в автоклаве, фильтруют и стерилизуют. Молочнокислые бактерии имеют большое значение в молочном хозяйстве, так как они участвуют в образовании различных молочнокислых продуктов (простокваша, лактобацилии, сметана, творог, сыры, кефир, кумыс, и др.).

В природе молочнокислые бактерии встречаются на поверхности растений (например, на листьях, фруктах, овощах, зёрнах), в молоке, наружных и внутренних эпителиальных покровах человека, животных, птиц, рыб (например, в кишечнике, влагалище, на коже, во рту, носу и глазах). Таким образом, помимо своей роли в производстве пищи и кормов, молочнокислые бактерии играют важную роль в живой природе, сельском хозяйстве и нормальной жизнедеятельности человека. Влияние ускоренной индустриализации производства молочнокислых бактерий, основанной на небольшом числе адаптированных для заводов штаммов, но природное разнообразие этих бактерий и здоровье человека пока остаётся не изученным.

Наши знания в микробиологии, генетике и биологии плазмид молочнокислых бактерий быстро идет вперед. Исследования распутывают молекулярные механизмы передачи генов, контроля и экспрессии.

Lactococcus lactis и Lactococcus cremoris прежде всего молочнокислые бактерии рода Streptococcus. Эти организмы развиваются естественно в молоке и были среди первых родов молочнокислых бактерий, изученными микробиологами. Они способны обладать N антигенной структурой в клеточной стенке.

Их роль в молочнокислом брожении и полезность как культуры стартера возобновила интерес в микробиологии и генетике, особенно с новейшей разработкой переноса гена и систем клонирования. Эти открытия дают возможность направлять генетические усовершенствования существующих культур стартера, используемых в молочной промышленности. Этот подход комплектует классические программы усовершенствования культур для того, чтобы увеличить невосприимчивость к бактериофагу, установить надежность и активность культуры при устранении нежелательных свойств. Использование микроорганизмов продовольственных сортов как основных бактерий для создания генетически проектируемых белков обеспечивает дополнительный стимул для более детального генетического анализа.

2. Классификация

Бактерии молочнокислые, группа микроорганизмов, сбраживающих углеводы с образованием главным образом молочной кислоты.

Классификация молочнокислых бактерий разработана недостаточно. Признаки бактерий могут значительно варьировать, что создает трудности при их классификации. В зависимости от характера образующихся продуктов при сбраживании гексоз бактерии молочнокислые делятся на гомоферментативные и гетероферментативные. Гомоферментативные бактерии при брожении сахаров образуют в основном молочную кислоту и незначительные количества фумаровой и янтарной, летучих кислот, этилового спирта и диоксида углерода; гетероферментативные — наряду с молочной кислотой образуют значительно большие количества уксусной кислоты, этилового спирта, углекислого газа и др. продуктов, используя на это 50% сахаров. Наиболее часто при классификации принимают во внимание форму клеток при условии, что культуры изучаются в определенном возрасте и среде. В основе деления на виды лежат также признаки сбраживания углеводов, потребности в источниках питания, учитывается оптическое вращение молочной кислоты. Первую научную классификацию молочнокислых бактерий разработал голландский ученый Орла-Иенсен в 1919. Бактерии молочнокислые объединены в семейство Lactobacillaceae, которое делится на подсемейство Lactobacilleae (род Lactobacillus) и Streptococceae (роды Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc). В виноделии широко распространены бактерии молочнокислые, относящиеся к 3 родам: Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc.

Молочнокислые бактерии, попадая в желудок и кишечник, становятся составной частью микрофлоры слизистой. Особенно это касается бифидобактерий. Одни бактерии производят ферменты, которые расщепляют белки на простые соединения, способствуя лучшему усвоению пищи. Другие вырабатывают антибиотики, что придает кисломолочному продукту лечебно-профилактические свойства.

Бактериальные культуры бывают термофильные (теплолюбивые) и мезофильные (холодолюбивые). Термофильные бактерии более активны, чем мезофильные. Названия молочнокислых продуктов, содержащих живые бактерии, обычно имеют приставки «био-», «ацидо-», «бифидо-», «лакто-». Разные бактерии оказывают различное влияние на организм.

Недавние таксономические исследования пересмотрели разновидности в пределах рода Streptococcus и ввели изменения, затрагивающие мезофильные молочные культуры стартера. Из-за общих черт между S. lactis и S.cremoris, 9-ый выпуск Руководства Берги Систематической Бактериологии (том 2) сгруппировал S. lactis, S. diacetylactis, и S. cremoris в одну разновидность (род): S. lactis. Гарви и Ферроу предложили обозначить подразновидности S. lactis, S. diacetylactis, и S. lactis cremoris.

Однако, в 1985 Шлейфер и др. предложили, чтобы молочные стрептококки были классифицированы в пределах нового рода, Lactococcus, основанного на исследованиях гибридизации нуклеиновой кислоты, в иммунологическом отношении супероксиддисмутазы, липотейхоевых кислотных структур, образцов липида, жирной кислоты и менохинонного состава. Род Lactococcus был одобрен Международным Союзом Микробиологических Обществ в 1986. Теперь по новой номенклатуре S. Lactis, S. Diacetylactis, S. cremoris обозначается как Lactococcus lactis, Lactococcus lactis diacetylactis и Lactococcus lactis cremoris.

Сендин предложил, чтобы один из родов Lactococcus lactis, который использует цитрат для того чтобы получить диацетил, был назван Lactococcus lactis diacetylous. Так как молочнокислые лактобактерии так широко используемы в молочной промышленности, предложенная терминология является весьма выгодной.

3. Морфология

По форме клеток бактерии молочнокислые делятся на кокковые и палочковидные. Диаметр кокковых форм от 0,5−0,6 до 1 мкм; они располагаются единично, парами или в виде цепочек различной длины. Палочковидные бактерии разнообразны по форме — от коротких коккообразных до длинных нитевидных различной длины (от 0,7−1,1 до 3,0 — 8,0 мкм), расположенных единично или цепочками (см. рис). На форму клеток значительно влияет состав среды и условия культивирования. Образование удлиненных палочковидных клеток наблюдается при развитии в средах, содержащих этиловый спирт, с высокой активной кислотностью, в средах с недостатком витамина В12 под действием ионизирующих излучений. Бактерии молочнокислые, встречающиеся в виноделии, в основном неподвижны, не образуют спор, пигмента, положительно окрашиваются по Граму, не восстанавливают нитраты в нитриты, характеризуются неактивной каталазой. Клеточные стенки представлют собой гомогенный электронно-плотный слой толщиной 15−60 мкм. Цитоплазматическая мембрана может быть двухили трехслойной толщиной 75−85 А. В цитоплазме клеток бактерий молочнокислых обнаружены рибосомы диаметром около 150 А, область ядерного материала (нуклеоид), который состоит из тонких плотных нитей шириной 20−25 А, отождествляемых с дезоксирибонуклеиновой кислотой.

4. Особенности генома молочнокислых бактерий, их историческая перспектива

Наблюдения бактериологов, начатые с 1930;ых годов, были основой текущих событий в микробиологии и генетике молочнокислых бактерий.

При изолировании некоторых штаммов L. Lactis были отмечены неустойчивость и необратимая потеря свойства расщеплять лактозу (Lac), а также свойства протеиназной (Про) активности.

Позже, в 1950;ых годах, Kнетмен и Сворфлинг описали неустойчивость к использованию цитрата. Механизмы необратимой потери этих важных молочнокислых свойств были, в то время, неизвестны и ждали будущего разъяснения.

Об Исследовании, в котором описывались первые системы переноса гена, сообщали ещё в 1962. Мойлер-Мэдсен и Дженсон преобразовали (трансформировали) L. lactis к способности использовать цитрат и производить аромат солода, тогда как Сендин и др. использовали вирулентные бактериофаги, чтобы получить устойчивость стрептомицина к L. lactis C2 а также независимость триптофана от L. lactis 18−16. Это нужно было для того, чтобы генетический обмен играл существенную роль в изменении культуры стартера, однако необратимую потерю метаболических свойств не могли объяснить ещё 10 лет.

Ведущие генетические исследования были начаты вначале 1970;ых Маккеем и сотрудниками Университета Миннесоты. После наблюдений Mаккея и др., что лактобактерии были легко утеряны после того, как их клетки были обработаны акрифлавином, широко используемым мутагеном и плазмид-лечащим веществом, в 1972 выдвинули гипотезу, что неустойчивые соединения были закодированы плазмидами ДНК. В 1974 году было зарегистрировано присутствие плазмид в лактобактериях, что и дало начало новой эре исследования этих организмов.

Последующие исследования ясно установили распространенность и важность плазмид лактобактерий в молочнокислом брожении. Теперь известно, что плазмиды кодируют множество свойств, включая расщепление углеводов (лактозу, галактозу, глюкозу, сахарозу, маннозу и ксилозу); протеиназной активности; использование цитрата; системы ограничения и модификации, адсорбции фага, сопротивление к фаговой инфекции и другие защитные механизмы против бактериофагов; резистентность к ультрафиолетовому излучению; действие антигенов клеточных стенок; продукция низина и его устойчивость; продукция бактериоцина и устойчивость; продукция диплококков и иммунитет против них; а также вязкость.

Усовершенствованные методы анализа плазмид продвинули также исследование плазмид лактобактерий. Ранее при исследовании плазмид использовали электронную микроскопию, отнимающую много времени и утомительной техникой, чтобы охарактеризовать массу и число плазмид в специфическом состоянии. В 1978 Клейнхеймер и др. разработали быстрый способ для вырезания плазмид молочнокислых бактерий и использовали электрофорез в агаризованном геле для визуализации плазмид, таким образом, способствуя тем самым их быстрому и удобному анализу. В последние годы появилось немало других процедур выделения плазмид (особенно крупных), распространенных в лактобактериях, которые сделали анализ гораздо проще.

В конце 1970;ых и вначале 1980;ых были разработаны и уже эксплуатировались системы переноса генов, в то время как микробиологические, физиологические и технологические исследования этих организмов ещё продолжались.

Трансдукция играла важную роль в ранних генетических исследованиях и может иметь большое значение в изучении хромосомных генов. Трансдукция плазмид-кодированных лактобактерий с помощью умеренных бактериофагов от L. lactis была первоначально описана Маккеем и др. в 1973. Во время трансдукции плазмид-кодированных лактобактерий или протеиназного действия, происходят сокращения Lac/Prt плазмиды, наблюдаемые в плазмидах. Причины, приводящие к трансдуцирующему сокращению у Lac/Prt плазмид L. lactis, были определены Гэссоном. Обширные ограничения и анализ исключения показали, что трансдуцирующее сокращение Lac/Prt плазмид были вызваны определенными случаями удаления.

В 1979 Гессон и Девис, а также Kемплетон и Mаккей сообщили о процессе конъюгации лактобактерий. Вскоре высокочастотные конъюгационные системы передачи у L. Lactis 712 и L. lactis ML3, связанные с уникальным комплексированием клетки, наблюдались Крейсоном, Уолтом и Mаккеем. Во время коньюгационной передачи плазмид лактобактерий, наблюдались слияние репликонов и образование субъединиц. В 1984 Андерсен и Mаккей установили, что субъединицы были сформированы от слияния двух плазмид, и что они чаще подвергаются к более высокой частоте слияния во вторичной конъюгации. Предполагали, что есть посредник при слиянии. Кроме того, обратимая область была ответственна за экспрессию (выражение) генов, управляющих скоплением клеток.

В 1987, Ползин и Симидзу-Kадота выделили и охарактеризовали вставки последовательностей, участвующих в конъюгативном формировании ML3. Плазмида лактотобактерии в ML3 содержала две копии вставок последовательности, 1SS1S, которые были подобны последовательностям 1S26 грамотрицательных бактерий. У L. lactis 712, хромосомально определили расположение полового фактора, которые вместо плазмид были ответственны за высокочастотный коньюгационный перенос у лактобактерий.

В 1980 Гейссон разрабатывал методы для формирования и восстановления протопластов, а также использования протопластов для того, чтобы успешно перекомбинировать и передавать гены путем слияния протопластов. После этого в 1982 Гeйс, Koндo и Маккей успешно использовали протопласты для полиэтилен-индуцированной трансфекции и соответственно трансдукции. В 1986 году была проведена электропорация всех клеток, а также в 1887 году Сандерсом и Никлсоном описано полиэтилен гликоль-инддуцированная трансформация всех клеток. Трансформация и развитие эффективных методов электропорации были пересмотрены позже.

Разработка эффективных систем передачи генов, особенно коньюгации и трансформации, распространения плазмид среди лактобактерий обеспечило генетическое свидетельство о редактировании различных фенотипических свойств к дискретным плазмидам. Передача желательных генов хозяевам, испытывающим недостаток в них, также проявляет к себе коммерческим интерес.

Трансформация также сыграла ключевую роль в развитии методологии клонирования генов и молекулярных исследований экспрессии генов. Применялись две стратегии клонирования: клонирование непосредственно в лактобактериях и с помощью векторов шатла для клонирования гетерогенных хозяев таких как, Sanguis Streptococcus, Bacillus subtilis и Escherichia сoli.

Молекулярные исследования проводили с помощью генетических инструментов, которые теперь стали доступными. Де Вос, ван дер Воссен и др. установили, что организация последовательности рибосомных участков, промотор, а также терминационные последовательности некоторых генов лактобактерий подобны другим грамположительным бактериям. Кроме того, Кок и др. установили, что сигнал последовательности протеиназ L. cremoris Wg2 были подобны протеазам серина семейства subtilisin.

1970 и 1980 гг. были связаны с развитием и назреванием этапов генетики лактобактерий. Применение генетических инструментальных средств разъяснило много интересных аспектов об этих организмах.

5. Размножение

Бактерии молочнокислые размножаются путем деления клеток, иногда перешнуровывания. Описан процесс размножения некоторых бактерий молочнокислых с помощью гонидий, при котором на концах палочек образуются зернышки (гонидии), увеличивающиеся в размерах, вытягивающиеся и превращающиеся в палочки, а также образование у бактерий молочнокислых фильтрующихся форм. Японскими исследователями доказано наличие у бактерий молочнокислых процесса спорообразования.

6. Рост и развитие

На рост и развитие бактерий молочнокислых влияют различные факторы.

Углеродное питание. Наиболее важными источниками энергии для бактерий молочнокислых являются моно и дисахариды (глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза), а также органических кислоты (лимонная, яблочная, пировиноградная, фумаровая, уксусная и муравьиная) в концентрации 30 — 50 мкг/мл. Из жирных кислот рост бактерий молочнокислых стимулируют олеиновая, линолевая, а также линоленовая. При отсутствии сбраживаемых углеродсодержащих субстратов бактерий молочнокислых могут использовать аминокислоты в качестве источника энергии. Некоторые штаммы сбраживают полисахариды.

Азотное питание. Значительное число бактерий молочнокислых не способно синтезировать органических формы азота и поэтому нуждаются для своего роста в присутствии их в среде; только некоторые из бактерий молочнокислых используют минеральные соединения азота для синтеза ряда органических соединений. Для удовлетворительного роста бактерий молочнокислых необходим ряд аминокислот: аргинин, цистеин, глутаминовая кислота, лейцин, фенилаланин, триптофан, тирозин, валин.

Витамины. Все виды палочковидных бактерий нуждаются в пантотеновой кислоте, биотине, никотиновой кислоте, а гетероферментативные — еще и в тиамине. Потребности в пуриновых основаниях и тиамине связаны с потребностями в аминобензойной или фолиевой кислотах.

Неорганические соединения. Для роста и развития бактерии молочнокислые нуждаются в соединениях меди, железа, натрия, калия, фосфора, йода, серы, магния и особенно марганца.

Спирты. Бактерии молочнокислые устойчивы к действию повышенных концентраций спирта. Приспособленность к развитию при высоких концентрациях спирта является характерным свойством, широко присущим как гетероферментативным, так и гомоферментативным бактериям. Штаммы бактерий молочнокислых, обладающие высокой энергией кислотообразования, характеризуются и максимальной устойчивостью к спирту. Наиболее быстро в средах с высоким содержанием спирта размножаются молодые культуры. С возрастом скорость размножения их в этих средах закономерно снижается. Чем больше спирта содержит среда, тем медленнее протекает размножение. Угнетающее действие высоких концентраций спирта на бактерии молочнокислые более остро сказывается при высоких температурax. На неполноценных питательных средах, на которых развитие бактерий молочнокислых происходит заторможено, устойчивость к спирту значительно снижается. Длительное культивирование бактерий с дрожжами повышает их устойчивость к спирту. Продолжительность жизни бактерий молочнокислых без пересевов в спиртосодержащих средах (напр., в винах) в 2−4 раза больше, чем в тех же средах без спирта. Это объясняется тем, что в спиртосодержащих средах бактерии медленнее размножаются и накапливают продукты брожения. В осветленных винах в лабораторных условиях при комнатной температуре бактерии молочнокислые выживали более 7 месяцев. В основном спирт подавляет функцию размножения клеток; функция роста подавляется слабее. Спирт у многих видов, особенно при развитии на средах, слабо обеспечивающих их питание, вызывает увеличение размеров клеток в длину; иногда при этом они принимают вид длинных изогнутых нитей.

Форма клеток молочнокислых бактерий: а — кокки — Leuconostoc oenos (х 6000); б — Pediococcus cerevisiae (х 5000); в-палочки — Lactobacillus casei (x 8500); г — Lactobacillus brevis (x 5500)

Величина рН. Бактерии молочнокислые характеризуются порогом рН использования яблочной кислоты и сахаров. Оптимальный предел рН роста для бактерий, выделенных из вин — 4,3−4,8, нижний предел значения рН использования сахаров и яблочной кислоты — 2,9−3,0. В исключительных случаях рН составляет 2,85 и 2,78. Оптимальное значение рН яблочно-молочного брожения 4,2−4,5. При рН выше 4,5 яблочно-молочное брожение замедляется.

Температура. Большинство молочнокислых бактерий растет в относительно узкой зоне температур, которая оказывает влияние на скорость роста, превращений, а также на их потребность в питании. бактерии молочнокислые, выделенные из вин, относятся к мезофильным; они не размножаются при 45 °C, и оптимальная температура их роста близка к 25°С-30°С. Температурa ниже 15 °C резко тормозит скорость яблочно-молочного брожения. Незначительные дозы растворенного в вине кислорода стимулируют развитие молочнокислых бактерий. Они относятся к группе микроаэрофильных микроорганизмов.

Сернистый ангидрид является ингибитором молочнокислых бактерий. Его токсичность зависит от титруемой кислотности среды. Она значительно усиливается при пониженном значении рН. Связанные формы SO₂ ингибируют бактерии молочнокислые, однако этот эффект значительно выше, когда SO₂ в свободном состоянии. Больше влияет на размножение бактерий, чем на яблочно-молочное брожение. При концентрации связанного SO₂ 90 — 120 мг/дм³ яблочно-молочное брожение в винах с рН 3,2−3,3 практически невозможно.

7. Молочнокислые стрептококки

К молочнокислым стрептококкам относят мезофильные стрептококки Streptococcus lactis, Str. cremoris и ароматобразующие Str. diacetilactis, Str. acetoinicus, Str. paracitrovorus (Leuconostoc citrovorum), Str. citrovorus (Leuconostoc citrovorum); термофильные Str. thermophilus; энтерококки (молочнокислые стрептококки кишечного происхождения) Str. liquefaciens, Str. faecalis, Str. zymogenes, Str. faecium, Str. durans, Str. bovis.

Это грамположительные кокки (рис. 27), образующие короткие или длинные цепочки. Неподвижны, спор и капсул не образуют. Они относятся к факультативно-анаэробным микроорганизмам (микроаэрофилам). Большинство из них не обладают протеолитической активностью, не образуют каталазу. Вызывают расщепление углеводов гомоили гетероферментативным путем (такое деление связано с количеством получаемых при молочнокислом брожении побочных продуктов — летучих кислот, эфиров, спирта, диацетила и пр.).

Мезофильные стрептококки. Мезофильные молочнокислые стрептококки кефирного грибка — не однородная группа. Она состоит из активных кислотообразователей (Streptococcus lactis, Streptococcus. cremoris) и ароматообразующпх стрептококков (Leuconostoc citrovorum и Leuconostoc dextranicum).

В настоящее время Streptococcus lactis и Streptococcus cremoris рассматриваются как постоянная и наиболее активная часть микрофлоры кефирного грибка, обеспечивающая быстрое нарастание кислотности закваски в первые часы сквашивания.

Ароматообразующие стрептококки участвуют в формировании специфического вкуса и аромата кефира, а при излишнем развитии могут вызывать газообразование.

Str. lactis (молочнокислый стрептококк). Клетки Str. lactis имеют круглую форму, располагаются в виде овальных, попарно соединенных клеток (диплококков) или коротких цепочек. При росте на поверхности твердых питательных сред образует мелкие, росинчатые колонии; глубинные колонии лодочкообразные или в форме чечевицы. Хорошо растут в присутствии глюкозы или лактозы. На гидролизованном агаре с мелом вокруг колоний образуют зоны просветления (в результате выделения молочной кислоты происходит растворение мела). Благоприятной средой для развития стрептококков является гидролизованное молоко. По росту на кровяном агаре относится к гамма-типу. Оптимальная температура роста 30 °C. При этой температуре они свертывают молоко за 10−12 ч. Сгусток ровный, плотный, колющейся консистенции, имеет чистый кисломолочный вкус и аромат. Некоторые расы (разновидности) образуют сгусток тягучей консистенции и поэтому непригодны для выработки большинства кисломолочных продуктов. Str. lactis никогда не сбраживают рамнозу, сахарозу, раффинозу. Часто разлагают казеин. Предельная кислотность, создаваемая в молоке при культивдровании Str. lactis, колеблется в пределах, НО — 120° Т (иногда 130° Т), однако встречаются и малоактивные штаммы, предельная кислотность которых достигает в молоке 90−100°Т. Некоторые разновидности Str. lactis продуцируют весьма активный антибиотик низин. Отдельные штаммы молочнокислых стрептококков могут вызывать пороки молочных продуктов: тягучесть, горечь (вследствие пептонизации молока) и др.

Str. cremoris (сливочный стрептококк). Он отличается от Str. lactis тем, что его клетки чаще располагаются в виде цепочек. Форма и величина колоний аналогична форме и величине колоний Str. lactis. Оптимальная температура развития Str. cremoris 20−25°С, максимальная 35−38°С. Через 12 ч в молоке образует прочный сгусток сметанообразной консистенции. Предельная кислотность, образуемая Str. cremoris в молоке, ПО-115°Т. Ферментативные свойства также идентичны. Str. cremoris отличается от Str. lactis по способности сбраживать мальтозу, декстрин, сахарозу. Str. cremoris не растет при 40 °C в среде с 4% NaCl при рН 9,2. Str. cremoris не разлагает казеина, иногда и салицина.

молочнокислый брожение бактерия гомоферментативный

Термофильные стрептококки Эта группа микроорганизмов длительное время игнорировалась исследователями микрофлоры кефирных грибков. Считалось, что, поскольку продукт вырабатывают при сравнительно низких температурах, термофильных микроорганизмов в нем не должно быть. Количество этих микроорганизмов резко возрастает при повышении температуры культивирования. Роль термофильных молочнокислых палочек в кефирной закваске и кефире, по-видимому, достаточно существенна. Эта группа проявляет себя во всех случаях нарушения режимов культивирования грибков — повышения температуры, увеличения выдержки и т. д. Интенсивное развитие ее в закваске приводит к излишнему повышению кислотности и к подавлению мезофильных молочнокислых стрептококков.

К ним относятся Streptococcus thermophilus. Термофильные стрептококки по сравнению с мезофильными лучше развиваются при повышенной температуре. Термофильные стрептококки в отличие от мезофильных сбраживают сахарозу. Поэтому для их выделения из посевного материала к безуглеводной питательной среде добавляют сахарозу. Форма и расположение клеток в мазках идентична морфологии и расположению клеток Str. cremoris. Клетки несколько крупнее, располагаются в виде цепочек разной длины. Но Str. thermophilus имеет и свои особенности (оптимальная температура развития 40−45°С, максимальная 45−50°С).

При росте на твердых питательных средах Str. thermophilus образует округлой формы с зернистой структурой поверхностные и глубинные лодочкообраз-ные, иногда с выростом колонии. При оптимальной температуре развития термофильный стрептококк свертывает молоко за 3,5−6 ч, образуя ровный, прочный сгусток сметанообразной консистенции; предельная кислотность 110−120°Т. Некоторые штаммы стрептококка выделяют диацетил. Термофильный стрептококк не сбраживает мальтозы, декстрина и салицина; не разлагает казеина.

Энтерококки — молочнокислые стрептококки кишечного происхождения. К ним относятся Str. liquefaciens (Mammococcus), Str. faecalis, Str. zymogenes, Str. faecium", Str. durans, Str. bovis. Они обитают в кишечнике человека и животных, в навозе, сточных водах. В больших количествах находятся в сыром и в малых в пастеризованном молоке, сыре.

Многие энтерококки образуют короткие цепочки или располагаются попарно. Клетки имеют округлую или яйцевидную форму. Они могут развиваться как при 10, так и при 45 °C. Устойчивы к поваренной соли (6,5%), метиленовой сини и желчи (40%), к щелочной реакции среды (рН 9,6), к пенициллину в концентрации 0,3 ед. в 1 мл, к высокой температуре. Выдерживают нагревание при 65 °C в течение 30 мин. Ферментируют большинство углеводов.

Str. liquefaciens (Mammococcus). Имеет некоторое сходство со Str. lactis. Оптимальная температура роста 37 °C. Маммококк образует не только молочную кислоту (110 — 115°Т), но и выделяет фермент типа сычужного, вследствие этого свертывание молока наступает при низкой кислотности 35−40°Т. Сгусток вначале прочный, ровный, затем под действием сычужного фермента стягивается (выделяется значительное количество сыворотки). Сбраживает сорбит и глицерин. Разлагает казеин и разжижает желатин. Молочные продукты при попадании маммококков приобретают горький вкус в результате накопления большого количества пептонов.

Str. faecalis. Располагается в виде диплококков коротких цепочек. Способен ферментировать маннит, сорбит, редко арабинозу; восстанавливает лакмусовое молоко. На агаре с кровью вызывает гемолиз. Гидролизует белки (особенно в сырах, придавая им специфический запах).

Str. zymogenes. По морфологии и культуральным свойствам сходен с Str. liquefaciens. Он частично разлагает казеин. В отличие от других энтерококков вызывает р-гемолиз эритроцитов, поэтому на кровяном агаре вокруг колоний образуются прозрачные зоны. Гемолиз эритроцитов считают признаком патогенности микроорганизма.

Str. faecium. Его свойства аналогичны свойствам Str. faecalis, сбраживает арабинозу, сахарозу, редко сорбит; частично восстанавливает лакмусовое молоко. Не разлагает казеина.

Str. durans (вариант Str. faecium). Сбраживает лактозу, глюкозу, мальтозу. Редко сбраживает сахарозу, салицин, маннит. Не сбраживает инулина, сорбита, раффинозы.

Str. bovis. По своим свойствам, сходен с термофильным стрептококком. Некоторые штаммы этого стрептококка подвижны. Отличаются от других стрептококков большой чувствительностью к поваренной соли, желчи, щелочной среде и метиленовой сини. Не способен расти при 10 °C. Лакмусовое молоко не свертывает, вызывает лишь частично его восстановление. Не сбраживает арабинозу, но часто ферментирует ксилозу.

Гомоферментативное молочнокислое брожение

Гомоферментативное молочнокислое брожение, в основе которого лежит гликолитический путь разложения глюкозы, является единственным способом получения энергии для группы эубактерий, которые при сбраживании углеводов превращают в молочную кислоту от 85 до 90% сахара среды. Бактерии, входящие в данную группу, морфологически различны. Это кокки, относящиеся к родам Streptococcus и Pediococcus, а также длинные или короткие палочки из рода Lactobacillus. Последний подразделяется на три подрода. Бактерии, включенные в два из них (Thermobacterium, Streptobacterium), также осуществляют гомоферментативное молочнокислое брожение. Все бактерии этой группы положительно окрашиваются по Граму, не образуют спор, неподвижны. Группа весьма гетерогенна в отношении нуклеотидного состава ДНК: молярное содержание ГЦ-пар оснований колеблется от 32 до 51%. Значительные колебания по этому признаку характерны и для бактерий, объединенных в роды и даже подроды.

Лактатдегидрогеназа, катализирующая превращение пирувата в лактат, стереоспецифична. У разных видов она содержится в виде определенных оптических изомеров; в зависимости от этого бактерии продуцируют Dили L-форму молочной кислоты. Те из них, которые образуют смесь Dи L-форм, содержат или две формы фермента, различающиеся стереоспецифичностью, или лактатрацемазу.

У этой группы эубактерий молекулярный кислород не включается в энергетический метаболизм, но они способны расти в присутствии О₂, т. е. являются аэротолерантными анаэробами. В их клетках в значительном количестве содержатся флавиновые ферменты, с помощью которых происходит восстановление молекулярного кислорода до Н₂О₂. Из-за неспособности молочнокислых бактерий синтезировать гемовую группу у них отсутствует каталаза — фермент, катализирующий разложение перекиси водорода, поэтому последняя может накапливаться в клетке.

Особенностями конструктивного метаболизма гомоферментативных молочнокислых бактерий являются слабо развитые биосинтетические способности, что выражается в большой зависимости их роста от наличия в питательной среде готовых органических веществ (аминокислоты, витамины группы В, пурины, пиримидины). В качестве источника углерода молочнокислые бактерии используют лактозу (молочный сахар) или мальтозу (растительный сахар, образующийся при гидролизе крахмала). Могут они также использовать некоторые пентозы, сахароспирты и органические кислоты.

Из всех известных непатогенных прокариот молочнокислые бактерии отличаются наибольшей требовательностью к субстрату. Зависимость этих бактерий от наличия готовых органических веществ среды указывает на примитивность в целом их конструктивного метаболизма.

Молочнокислые бактерии распространены там, где они могут обеспечить свои высокие потребности в питательных веществах и где имеются большие количества углеводов, переработка которых дает им необходимую для роста энергию. Их много в молоке и молочных продуктах, на поверхности растений и в местах разложения растительных остатков; обнаружены они в пищеварительном тракте и на слизистых оболочках животных и человека.

Молочнокислым бактериям принадлежит главная роль в осуществлении ряда процессов, используемых с давних времен для получения различных кисломолочных продуктов, в процессах соления и квашения овощей, силосования кормов. Кефир — продукт совместной деятельности молочнокислых бактерий и дрожжей. Известно много национальных кисломолочных продуктов (кумыс, йогурт и др.), для приготовления которых используют кобылье, верблюжье, овечье, козье молоко, а в качестве закваски — естественно возникшие и сохраняемые комплексы молочнокислых бактерий и дрожжей.

Молочнокислые бактерии играют также большую роль в процессе приготовления сыров и сливочного масла. Первый этап производства сыров (створаживание белков молока) осуществляется молочнокислыми бактериями.

Скисание сливок, необходимое для получения сливочного масла, также вызывают бактерии рода Streptococcus. Помимо молочной кислоты некоторые из них образуют ацетоин и диацетил, придающие сливочному маслу характерный запах и вкус. Субстратом служит лимонная кислота, содержание которой в молоке может достигать 1 г/л. Реакции, ведущие к образованию этих веществ, начинаются с расщепления лимонной кислоты:

НООССН₂СООНСН₂СООН СН₃СН₂СООН + С₂Н₅ООССОСН₂СООС₂Н₅

СООН Уксусная кислота выделяется в среду, а щавелевоуксусная кислота (ЩУК) декарбоксилируется, что приводит к образованию пирувата:

С₂Н₅ООССОСН₂СООС₂Н₅ СН₃СОСООН+ СО₂ (1)

Дальнейшее метаболизирование пирувата осуществляется по трем различным путям: часть молекул восстанавливается до молочной кислоты; другая часть подвергается декарбоксилированию, приводящему к возникновению разных С2-интермедиатов (ацетил-КоA и «активный» ацетальдегид) и взаимодействию между ними, заканчивающемуся синтезом молекулы диацетила. Восстановление последнего приводит к образованию ацетоина:

СН3-СО-СО-СН3 + НАД*Н2 СН3-СНОН-СО-СН3 + НАД+ (2),

где СН3-СО-СО-СН3 — диацетил, а СН3-СНОН-СО-СН3 — ацетоин.

Эта последовательность реакций не связана с получением клеткой энергии. Смысл ее, возможно, в дополнительном своеобразном решении «акцепторной проблемы», так как, во-первых, образование пирувата в реакции 1 не сопровождается синтезом НАД*Н2, и, во-вторых, синтез ацетоина из диацетила (реакция 2) требует дополнительных молекул НАД*Н2.

Использующие мальтозу молочнокислые бактерии участвуют в квашении овощей. В мелко нарезанные овощи добавляют 2−3% соли и создают условия, исключающие свободный доступ воздуха. Начинается спонтанное молочнокислое брожение. Аналогичный процесс протекает при силосовании кормов. Предназначенная для силосования растительная масса плотно загружается в силосные башни или ямы. Чтобы повысить питательные свойства среды, добавляют мелассу, а в целях создания более благоприятных условий для молочнокислых бактерий растительную массу подкисляют. В этих условиях также протекает спонтанное молочнокислое брожение.

Выводы

Молочнокислые бактерии — группа микроаэрофильных грамположительных микроорганизмов. Как правило, это неподвижные, неспорообразующие кокковидные или палочковидные представители отряда Lactobacillales (например, Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris или Lactobacillus acidophilus).

Геном этих бактерий состоит из кольцевой замкнутой хромосомы, в которой кодируется вся информация, необходимая для жизни, и дополнительных генетических элементов — плазмид и транспозонов. Последние могут обеспечить организм хозяина генетической информацией, которая ему необходима для выживания в определенных условиях. Плазмиды могут кодировать такие свойства, как расщепление углеводов, протеиназная активность, антибиотикорезистентность, резистентность к ультрафиолетовому излучению, сопротивление к фаговой инфекции и другие защитные механизмы против бактериофагов, продукция бактериоцина, а также вязкость и др.

Организация последовательности рибосомных участков, промотор, а также терминационные последовательности некоторых генов лактобактерий подобны другим грамположительным бактериям.

Передача генов совершается с помощью процессов конъюгации, трансформации. Последний сыграл ключевое значение в развитии методологии клонирования генов и молекулярной экспрессии генов.

Изучение генетики этих бактерий имеет как научный, так и коммерческий интерес в связи с их полезностью. Молочнокислые бактерии помимо своей роли в медицинской промышленности, производства пищи и кормов играют важную роль в природе и нормальной жизнедеятельности человека. Поэтому изучают и устанавливают механизмы передачи патогенных свойств, устойчивости к лекарственным препаратам, а также проводятся всевозможные исследования для усовершенствования этих культур.

1) Беленовский Г., Молочнокислые микробы и бактериотерапия (Мед. микробиология, под ред. Л. Тарасевича, т. II, СПБ-Киев, 1913)

2) Бурьян НИ., Тюрина Л. В. Микробиология виноделия. — M., 1999.

3) Квасников Е. И. Биология молочнокислых бактерий. — Ташкент, 2000

4) Квасников Е. И., Нестеренко О. А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. — Москва, 1995.

5) Миллер А. Санитарная бактериология, М.-Л., 1930

6) Шендеров Б. А. // Медицинская микробная экология и функциональное питание. 2001. Т.3.