Изменение состава и ферментативных активностей протеасом при апоптозе в клетках К562

1.1. Актуальность проблемы.

Апоптоз, или программированная клеточная гибель, является важнейшим механизмом контроля над качеством и численностью клеточной популяции в многоклеточном организме. Он обеспечивает равновесие в пролиферации клеток, элиминации поврежденных (например, радиацией), пораженных вирусом и неопластических клеток, а также селекцию лимфоцитов, при которой удаляются аутоиммунные клоны. Неспособность клеток претерпевать апоптоз — это один из ключевых моментов в опухолеобразовании. Молекулярные механизмы, задействованные в этом процессе, до сих пор окончательно не исследованы.

Апоптоз представляет собой сложно регулируемый клеточный процесс, который принято подразделять на две стадии: запуск и выполнение программы (Earnshaw, 1995). Известно, что запуск программы, приводящей к смерти клетки, может осуществляться как специфическими сигналами (например, цитокинами или гормонами), так и неспецифическими, такими как радиация, повышение температуры или действие окислителей (например, проокислитель — глутатион-истощающий агент диэтилмалеат (ДЭМ)).

Стадия выполнения инициируется активацией каспаз (семейство цитоплазматических цистеиновых протеаз), которые деградируют специфические клеточные белки, такие как поли-(АДФ-рибоза)-полимераза (PARP) (Martin, Green, 1995). Это приводит к серии определенных метаболических изменений, характерных для апоптоза (в том числе, ядерной фрагментации, образование апоптотических телец).

В настоящее время широко изучается участие в апоптозе протеасом. При использовании ингибиторов протеасом обнаружили как про-апоптозное, так и анти-апоптозное функционирование протеасом в клетке (Grimm et al., 1996; Lopes et al., 1997; Dou et al., 1999; Wojcik, DeMartino, 2003; Yang et al., 2006). Такие противоположные роли протеасом в регуляции апоптоза, по-видимому, обусловлены пролиферативным статусом клетки (Naujokat,.

Hoffmann, 2002; Wojcik, DeMartino, 2003; Chen, Lin, 2004; Sohn et al., 2006; Vink et al., 2006).

Для осуществления разнообразных функций в клетке протеасомы должны быть подвержены строгому регуляторному контролю. Фосфорилирование регуляторных белков (например, киназ) является ключевым моментом в передаче сигнала, продвижении клетки по клеточному циклу и в апоптозе (Bandyopadhyay et al., 2004; Sabatini et al., 2004; Contri et al., 2005; Jin et al., 2005; Wang et al., 2005; Ptacek, Snyder, 2006). Фосфорилирование субстратов и ферментов также играет важную роль в убиквитин-протеасомном пути (Glickman, Ciechanover, 2002; Wojcik, DeMartino, 2003). Известно также, что 26S протеасомы посттрансляционно модифицируются в различных случаях как фосфорилированием (Bose et al., 1999, 2004; Fernandez Murray et al., 2002; Iwafime et al., 2002), так и N-ацетилированием (Arendt, Hochstrasser. 1999; Kimura et al., 2000; Tokunaga et al., 1990; Claverol et al., 2002), гликозилированием (Schmid et al., 1993, Zachara, Hart, 2004; Sumegi et al., 2003) и 4-гидрокси-2-ноненил-алкилированием (Farout et al., 2006). Обнаружены сайты потенциального фосфорилирования на субъединицах 20S протеасомы и 19S регуляторных комплексов, и исходя из этого, выдвинуто предположение о возможном контроле протеолитической активности протеасом посредством фосфорилирования (Bose et al., 1999; Fernandez Murray et al., 2002). Так, например, дефосфорилирование аЗ и а7 субъединиц протеасом приводило к снижению двух пептидазных активностей протеасом (Mason et al., 1996). Кроме того, фосфорилирование субъединиц протеасом ответственно за ассоциацию 20S протеасомы и 19S регуляторных комплексов (Rivett et al., 2001). Известно, что в зависимости от стадии клеточного цикла, изменялся статус фосфорилирования протеасом (Iwafune et al., 2002) и что некоторые клеточные сигналы вызывают изменения в фосфорилированности субъединиц протеасом (Bose et al., 2001; Rivett et al., 2001; Bardag-Gorce et al., 2004). Однако воздействие индукторов апоптоза на изменение статуса фосфорилирования протеасом не исследовалось.

Основываясь на том, что при индукции апоптоза в дифференцированных клетках изменялся субъединичный состав и протеолитическая активность протеасом, было сделано предположение, что такие изменения в протеасомах могут приводить к усилению деградации по протеасом-убиквитиновому пути определенных клеточных белков, приводящих к апоптозу (Naujokat, Hoffmann, 2002). Однако до сих пор нет данных об изменении субъединичного состава и регуляции активностей протеасом в быстро пролиферирующих клетках при индукции апоптотической гибели. Кроме того, при индукции апоптоза в клетках не было исследовано изменение эндорибонуклеазной активности протеасом. Не исследовано влияние изменения статуса фосфорилирования протеасом на их протеолитическую и эндорибонуклеазную активности при индукции апоптоза как в дифференцированных, так и в быстро пролиферирующих клетках. Одним из актуальных и наименее исследованных, кроме всего прочего, является вопрос о гетерогенности популяции протеасом в клетке (в том числе, в отдельных клеточных компартментах), о назначении множественных форм протеасом. Так, например, нет данных об исследованиях субъединичного состава, статуса фосфорилирования и ферментативных активностей ядерных протеасом при индукции апоптоза в клетках.

В свете вышесказанного, представляется весьма актуальным исследование специфических изменений субъединичного состава и статуса фосфорилирования протеасом, очищенных из цитоплазмы и ядер клеток проэритролейкемии человека линии К562 при индукции программированной клеточной гибели при помощи диэтилмалеата (ДЭМ) или доксорубицина (ДР). Кроме того, важно проанализировать воздействие данных индукторов апоптоза на протеолитическую и эндорибонуклеазную активности протеасом, а также влияние дефосфорилирования протеасомных субъединиц на ферментативных активностей протеасом при индукции апоптоза в клетках К562. «.

выводы.

1. Индуктор программированной клеточной гибели (ДЭМ или ДР) вызывает изменения в субъединичном составе как цитоплазматических, так и ядерных 26S протеасом клеток К562. После воздействия на клетки индуктора апоптотической программы наблюдается модифицирование субъединиц 20S протеасом, как а-, так и р-типа, в том числе и субъединиц, ответственных за ферментативные активности протеасом (а5, аб и (32).

2. Действие индуктора апоптоза на клетки К562 приводит к изменению специфичности ферментативных (протеолитической и эндорибонуклеазной) активностей протеасом из ядер и цитоплазмы клеток К562.

3. Спектр фосфорилирования субъединиц протеасом различен в ядрах и цитоплазме клеток К562. Индукция апоптоза в клетках К562 приводит к специфическим изменениям статуса фосфорилирования ядерных и цитоплазматических протеасом по серину, тирозину и треонину.

4. Неспецифическое дефосфорилирование белковых субъединиц 26S протеасом из ядер и цитоплазмы клеток К562, приводит к изменению специфичности их протеолитической активности и изменению эндорибонуклеазной.

5. Полученные данные свидетельствуют о существовании новой, не исследованной, системы регуляции субъединичного состава и статуса фосфорилирования протеасом в составе клеточной программы в ответ на апоптотические стимулы.