Морфометрико-стереологический анализ ультраструктуры митохондрий при окислительном стрессе

В последнее время находится всё больше подтверждений того, что основой процесса старения и ряда патологических возрастных заболеваний является действие активных форм кислорода. Основным источником активных форм кислорода в клетке считаются митохондрии, характерная особенность которых — взаимосвязь структуры и функции.

В.П.Скулачёвым был разработан митохондриально-направленный антиоксидант SkQb представляющий собой соединение молекулы хлоропластного антиоксиданта пластохинона и проникающего катиона додецилтрифенилфосфония. Ключевой особенностью SkQi является способность избирательно накапливаться в митохондриях за счёт трансмембранного потенциала. Показано, что SkQi замедляет или предотвращает развитие огромного числа патологий и процессов старения [Скулачёв, 2007]. На клеточном уровне показано, что SkQi способен предотвращать апоптоз, вызываемый перекисью водорода. На мышах показано, что SkQi замедляет развитие трёх различных типов ускоренного старения (прогерии). Аналогичный эффект получен на беспозвоночных — плодовой мушке Drosophila melanogaster и дафниях. SkQi обладает мощным лечебным действием при множестве глазных заболеваний: при врождённой дисплазии сетчатки, при возрастной макулярной дистрофии, при экспериментальном увейте и глаукоме. Показан защитный эффект SkQj при экспериментальном инфаркте миокарда на крысах, получавших SkQi с пищей в течение трёх недель до эксперимента. Предварительный приём SkQi спасает животных при экспериментальном инфаркте почки и сильно снижает зону поражения мозга при экспериментальном инсульте [Скулачёв, 2007].

Визуальное описание выявляемых изменений в исследовании методами электронной микроскопии структуры митохондрий при различных патологических процессах, как, впрочем, и других клеточных компонентов, является недостаточным и малоинформативным: оно не может дать точную, объективную и статистически достоверную оценку степени этих изменений. Такая оценка возможна лишь с использованием специальных методов, — методов морфометрии, стереологии и трёхмерной реконструкции, -позволяющих объективизировать исследование и получить принципиально новые данные о строении и пространственной организации изучаемых структур.

Центральной задачей настоящей работы была разработка и применение методов морфометрического и стереологического анализа для количественной характеристики изменений ультраструктуры митохондрий при различных патологических процессах, обусловленных окислительным стрессом, при естественном и ускоренном старении, а также для количественной характеристики защитного эффекта ЭкСЬ, проявляющегося на уровне ультраструктуры митохондрий.

В рамках настоящей работы были разработаны компьютерные методы оценки поверхностной плотности внутренней митохондриальной мембраны — отношения площади поверхности мембраны к объёму митохондрии. Метод также позволяет оценить электронную плотность матрикса и другие параметры, дающие возможность судить о функциональном состоянии митохондрий.

Разработка методов количественной оценки состояния ультраструктуры митохондрий по большим выборкам электронно-микроскопических фотографий, на наш взгляд, является перспективным направлением, поскольку позволяет характеризовать ультраструктуру митохондрий с высокой точностью по сравнению с обычно принятыми описательными характеристиками наблюдаемых явлений. В связи с повышенным вниманием исследователей к митохондриям, играющим ключевую роль в огромном множестве патологий, а также, по-видимому, в развитии процесса старения, разработка компьютерных методов морфометрико-стереологического анализа митохондрий в настоящее время является чрезвычайно актуальной.

Обзор литературы I. Методы морфометрии и стереологии.

Морфометрия — это наука об измерении структуры, совокупность различных методов, с помощью которых можно получить информацию о реальных размерах трёхмерных структур.

Стереология — это система методов, разработанных на основе аналитической геометрии и теории вероятностей, предназначенных для исследования трёхмерных структур по их двумерным изображениям (фотографиям срезов или проекциям). Стереологические методы позволяют получить морфометрические результаты, так как с их помощью можно установить форму и пространственную ориентацию изучаемых структур [Непомнящих и др., 1986].

Ультратонкие срезы, используемые в электронной микроскопии, можно считать двумерными, поэтому применение инструментов стереологии к исследованию клеточных структур, исследуемых с помощью электронного микроскопа, является целесообразным. Использование методов стереологического анализа в количественной микроскопии при изучении тканевых, клеточных и внутриклеточных структур имеет существенное преимущество перед описательными методами исследований [БеНой-, ЫЫпез, 1968].

Выводы.

1. Разработаны морфометрико-стереологические методы, позволяющие анализировать и оценивать изменения ультраструктуры митохондрий.

2. Применение разработанных методов для анализа ультраструктуры митохондрий при окислительном стрессе показало, что митохондриально-направленный антиоксидант SkQl снижает степень основных ультраструктурных изменений митохондрий при естественном и ускоренном старении, а также при экспериментальном инфаркте миокарда, а именно: a. В процессе старения в летательной мышце Drosophila melanogaster происходит увеличение доли митохондрий, имеющих миелиноподобные структуры («swirls»), а получение SkQl в виде сухого корма в концентрации 1,85 нМ снижает долю таких митохондрий, как у самок, так и у самцов. Причём у самцов это снижение имеет более выраженный характер. b. У 39-недельных мышей, мутантных по PolgA-субъединице митохондриальной ДНК-полимеразы (подверженных ускоренному старению), по сравнению с мышами дикого типа того же возраста наблюдается снижение трёх параметров митохондрий кардиомиоцитов:

• относительного количества сечений митохондрий (на 1 мкм2);

• поверхностной плотности внутренней мембраны (мкм2/мкм3);

• относительной электронной плотности матрикса.

При ежедневном получении мутантными мышами препарата SkQl (в концентрации 1 мкмоль на килограмм веса животного) в течение всей жизни снижение значений указанных параметров не наблюдается: значения соответствуют значениям у мышей дикого типа. c. У крыс при экспериментальном инфаркте миокарда наблюдается снижение двух параметров митохондрий кардиомиоцитов зоны ишемического повреждения:

• поверхностной плотности внутренней мембраны (мкм2/мкм3);

• относительной электронной плотности матрикса.

При ежедневном получении крысами препарата 8к (^1 в концентрации 250 нМ в течение 3-х недель до инфаркта и последующем инфаркте миокарда снижение значений указанных параметров не наблюдается: значения соответствуют значениям у крыс, не подвергнутых инфаркту. с1. У 11-месячных крыс линии ОХУБ (модель ускоренного старения) по сравнению с крысами линии yistar в клетках пигментного эпителия сетчатки наблюдается:

• снижение относительного количества электронно-плотных гранул (на 1 мкм длины мембраны Бруха);

• снижение суммарной площади сечений электронно-плотных гранул в расчёте на 1 мкм длины мембраны Бруха;

• увеличение ширины зоны распределения электронно-плотных гранул;

• значительное увеличение относительного количества липофусциновых гранул (на 1 мкм длины мембраны Бруха).

При получении препарата 8кС>1 в виде глазных капель (250 нМ) в течение 68 суток указанные изменения не наблюдаются, а значения соответствуют значениям у крыс Vistar.